Monitoramento dos animais - Ensaio de atividade antimalárica em modelo murino

V.II Ensaio de atividade antimalárica em modelo murino

2.5 Monitoramento dos animais

O tempo de sobrevida e o peso dos animais foram monitorados por um período de

30 dias. Para determinar a parasitemia, foi utilizado o método de análise do esfregaço

sanguíneo realizado em lâminas de vidro. Uma alíquota de sangue foi colhida através da

incisão na extremidade caudal dos animais. As lâminas foram coradas pela técnica de

GIEMSA e examinadas em microscópio óptico na objetiva de imersão no aumento de 100

vezes. A parasitemia foi determinada pela contagem do número de hemácias parasitadas

em um total de 3000 células visualizadas e expressa em porcentagem. Para tal contagem

as imagens dos campos foram salvas em computador, após obtenção no microscópio

óptico (Opton, Brasil). O monitoramento da parasitemia ocorreu nos 4º, 7º, 10º, 15º e 22º

dias após a inoculação da cepa nos animais.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tabela 18 (página 86) apresenta os resultados referentes ao tempo médio de

sobrevida e parasitemia dos animais monitorados durante o teste de atividade

antimalárica realizado para as doses totais de 4, 8 e 20 mg/kg tanto para a NOR quanto

para a NE-NOR. A parasitemia foi significativamente reduzida, no quarto dia de infecção,

em todos os grupos tratados com NOR (Figura 32, página 85), tanto na forma livre quanto

na forma nanoemulsionada; comparados aos seus respectivos grupos não tratados

(salina e NE branca). Foi permitido verificar a faixa de redução da infecção de 68 a 83%

para os grupos de tratamento com a NOR livre, e de 80 a 84% para os grupos contendo

86 NOR em nanoemulsões; ambos os grupos apresentaram efeito semelhante à redução do

grupo tratado com cloroquina (88%).

Figura 32 – Parasitemia no quarto dia de infecção após tratamento com NOR segundo o

four-day-test. (***) Grupos significativamente diferentes dos grupos controle não tratados

(p > 0,05).

No sétimo dia, a parasitemia dos grupos tratados com NOR livre a 4 e 8 mg/kg foi

significativamente menor quando comparada ao controle não tratado (salina) (Figura 33,

página 87). Os níveis da parasitemia com o tratamento pela NOR livre a 4 mg/kg também

não apresentaram diferenças significativas perante o grupo controle tratado (salina). Não

foram encontradas diferenças significativas de nenhum tratamento comparado ao grupo

controle não tratado NE branca nesse dia.

A redução na parasitemia no sétimo dia foi relatada para todos os grupos tratados

com a NOR livre, na faixa de 29 a 71%. O mesmo se aplica aos grupos NE-NOR 4 e NE-

NOR 20, porém com uma faixa menor de redução (9 a 33%). A dose menor (4 mg/kg)

para a NOR livre e nanoemulsionada obteve melhores resultados de redução da

parasitemia no sétimo dia. As doses de 8 e 20 mg/kg nas formas de solução e

nanomemulsão apresentaram efeitos menores. Isso indica que possíveis fatores

relacionados à toxicidade da NOR poderiam estar relacionados a este resultado.

87 Tabela 18 – Tratamento de camundongos Swiss infectados pelo Plasmodium berghei NK65 com a NOR e NE-NOR (four-day-test)

Grupos

Dose

(mg/kg/dia)

tms

(dias ± DP)

Parasitemia Média

(%) ± DP

Redução da

Parasitemia (%)

(dias 4/7/10/15)

D4

D7

D10

D15

Controle salina

-

11,2 ± 4,3

_{8,5 ± 1,7}

_{22,9 ± 3,5}

_{27,4 ± 6,7}

_30,7

_---

Controle cloroquina

15,0

>30*

1,0 ± 0,4*

2,1 ± 1,1*

2,9 ± 1,5

3,1 ± 4,0

88/90/89/90

NOR 4

4,0

16,4 ± 3,1

1,4 ± 0,4*

6,6 ± 1,8*

20,4 ± 3,8

23,3 ± 3,4

83/71/25/23

NOR 8

8,0

15,2 ± 5,9

1,6 ± 0,7*

12,3 ± 7,8*

24,7 ± 9,8

26,3 ± 3,6

81/46/10/14

NOR 20

20,0

13,3 ± 6,4

2,7 ± 1,5*

16,2 ± 5,6

26,1 ± 3,1

28,9 ± 2,7

68/29/5/6

Controle NE branca

-

13,3 ± 5,3

4,53 ± 1,2*

18,9 ± 3,9

ND

46/17/5/ND

NE-NOR 4

4,0

15,0 ± 4,6

1,7 ± 1,0

_{15,2 ± 1,7}

_{19,1 ± 5,0}

_{18,6 ± 1,6}

_80/33/30/39

NE-NOR 8

8,0

9,3 ± 2,1

1,3 ± 1,2

_{25,0 ± 2,8}

_{34,1 ± 8,9}

_ND

_84/ND/ND/ND

NE-NOR 20

20,0

10,3 ± 3,7

1,4 ± 1,4

_{20,8 ± 6,6}

_{24,3 ± 8,5}

_26,7

_83/9/11/13

tms = tempo médio de sobrevida

* Significativamente diferente do controle salina (não tratado) (p<0,05)

#_{Significativamente diferente do controle NE branca (não tratado) (p<0,05)} §_{Significativamente diferente do controle cloroquina (tratado) (p<0,05)}

ND não determinado DP desvio padrão

88 Figura 33 – Resultado do Four-day test no sétimo dia de infecção. () e () Grupos**

significativamente diferentes dos grupos controle não tratados (p > 0,001 e p > 0,05,

respectivamente).

Sendo assim, a investigação de doses inferiores que 4mg/kg/dia poderão ser

testadas em estudos posteriores.

Os resultados permitiram constatar que a dose de NOR em solução a 4 mg/kg

(Figura 34) induziu maior redução da parasitemia nos animais. Além disso, a formulação

nanoemulsionada na mesma dose foi capaz de promover uma atividade mais prolongada

de redução dos níveis de parasitemia nos dias D10 e D15 (Tabela 18 e Figura 34) em

relação ao grupo não tratado (salina). Para o décimo dia, os grupos NOR 4 e NE-NOR 4

apresentaram efeito na redução da parasitemia de 25 e 30%, respectivamente, quando

comparados ao grupo não tratado. No 15

dia após a infecção, a parasitemia para os

mesmos grupos manteve-se na faixa de 23 a 39%.

89 Figura 34 – Parasitemia para os grupos NOR e NE-NOR na dose de 4 mg/kg

0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Controle Salina NE-branca Controle Tratado NOR 4 mg/kg NOR 8 mg/kg NOR 20 mg/kg NE-NOR 4 mg/kg NE-NOR 8 mg/kg NE-NOR 20 mg/kg Dias % S obr ev ida

90 Não houve diferença significativa no tempo de sobrevida entre os grupos tratados e

o grupo controle não tratado. No entanto, foi possível verificar que as doses elevadas da

nanoemulsões de NOR (8 e 20 mg/kg), reduziram o tempo de sobrevida em relação ao

grupo não tratado, dado este, que pode indicar a toxicidade da NOR em doses elevadas,

e que necessita de investigações posteriores.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 10 15 20 25 30 Controle Tratado Controle Salina NOR 4 mg/kg NOR 8 mg/kg NOR 20 mg/kg Dias P eso ( g )

Figura 36 – Peso dos camundongos infectados pelo P. berghei NK65 e tratados com

NOR

91

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 10 15 20 25 30 Controle Tratado NE-NOR 4 mg/kg NE-NOR 8 mg/kg NE-NOR 20 mg/kg Controle Salina Controle NE branca Dias P eso ( g)

Figura 37 – Peso dos camundongos infectados pelo P. berghei NK65 e tratados com NE-

NOR

No mesmo contexto, o acompanhamento do peso dos animais (Figuras 36 e 37)

revelou a perda de peso corporal para todos os grupos tratados com NOR e NE-NOR, a

partir do 5º dia de infecção. A exceção do grupo tratado com cloroquina, que recuperou o

ganho de peso, todos os grupos perderam peso significativamente durante os 20 dias de

acompanhamento. Entretanto, o efeito diferenciado no grupo tratado com nanoemulsões

de NOR a 4mg/Kg/dia, revelou um menor efeito na perda de peso. Nestes animais, a

manutenção do peso corporal foi mantida até o 8º dia de infecção, indicando a menor

toxicidade, perante este parâmetro, desta preparação nessa concentração.

Estes dados aqui obtidos reforçaram estudos anteriores, onde Gonçalves e

colaboradores (2006) evidenciaram o potencial de frações alcaloídicas obtidas da madeira

de Annona crassiflora em doses de 12,5 mg/kg/dia, que provocaram a redução de cerca

de 50 e 70% na parasitemia nos dias 4 e 7 da infecção. Em comparação a este estudo

preliminar, pode-se constatar a atividade da NOR isolada das frações de folhas de A.

crassiflora. Além disso, uma formulação de NOR veiculada em nanoemulsões, apresentou

92 supramencionados. E ainda, os resultados aqui dissertados reafirmam a necessidade de

mais estudos referentes aos compostos isolados dessas frações potenciais da Annona

crassiflora, mediante ensaios mais detalhados para conhecimento de sua toxicidade,

93 DISCUSSÃO GERAL

Através da extração ácido-base e dos fracionamentos cromatográficos realizados a

partir do extrato etanólico bruto das folhas de Annona crassiflora Mart. foi possível obter

frações clorofórmicas, nas quais constatou-se a predominância de alcaloides em sua

composição. O ensaio de letalidade sobre a Artemia salina revelou o potencial dessas

mesmas frações quanto à bioatividade e direcionou o estudo para o isolamento de

metabólitos dessas frações. A fração clorofórmica ACF-CIa originou três compostos

altamente larvicidas, dentre eles, o alcalóide aporfínico norestefalagina (NOR), que foi o

principal metabólito secundário isolado e identificado, sendo o mesmo já elucidado em

estudos anteriores em nosso laboratório (LAGE, 2011). Os demais compostos encontram-

se ainda em fase de determinação estrutural.

Os resultados obtidos condizem com o apresentado por estudos anteriores que

revelaram o potencial da Annona crassiflora como fonte de metabólitos secundários

bioativos. Gonçalves e colaboradores (2010) isolaram alcaloides aporfínicos e

oxaporfínicos da madeira da espécie partindo do ensaio biomonitorado de letalidade

sobre a A. salina, no qual constataram a bioatividade de frações alcaloídicas,

direcionando o isolamento dos compostos ativos dessas frações. Pimenta e

colaboradores (2003) realizaram uma triagem entre diferentes espécies da família

Annonaceae, evidenciando a bioatividade de frações hexânicas e clorofórmicas da

Annona crassilfora.

Com o objetivo de quantificar a NOR em formulações nanoestruturadas para

administração parenteral em estudos pré-clínicos, foi desenvolvido e validado um método

inédito de quantificação do alcaloide NOR por meio de CLAE-DAD. O método de

determinação da NOR foi linear na faixa de 1,0 a 50,0 µg/mL (R

=0,9999), preciso e

exato. Os coeficientes de variação intra e interdias foram inferiores aos recomendados

pela ANVISA. O método CLAE foi considerado validado e permitiu a quantificação da

NOR para determinação da porcentagem e da eficiência de encapsulação nas

nanoemulsões desenvolvidas.

Sendo a NOR uma substância com baixa solubilidade em água, formulações

nanoestruturadas foram desenvolvidas, particularmente nanoemulsões, de forma a conter

os excipientes adequados para melhorar a solubilidade do alcaloide, sendo

posteriormente avaliadas sob o aspecto físico-químico, especialmente o tamanho das

94 populações de nanopartículas, o potencial de superfície (zeta) e a capacidade de

associação à NOR. As nanoemulsões possuem vantagem frente às nanopartículas como

seu baixo custo e disponibilidade de administração pela via oral e vêm sendo amplamente

estudadas na terapêutica de diferentes doenças parasitárias (SANTOS-MAGALHÃES e

MOSQUEIRA, 2010). A nanoemulsão contendo Pluronic

e Epikuron

como surfactantes,

Mygliol

como núcleo oleoso e a mistura de metanol/acetona forneceu tamanhos de

gotículas e índice de polidispersão menores e adequados para administração

intraperitoneal, sendo assim, selecionada para o carreamento da NOR no ensaio de

atividade antimalárica. Os surfactantes são reconhecidos por elevar a biodisponibilidade

de fármacos veiculados em emulsões por atuarem na permeabilidade de membranas

biológicas, possibilitando a penetração do fármaco (HELENIUS e SIMONS, 1975).

Nanoemulsões contendo NOR (NE-NOR) foram produzidas em diferentes

concentrações e apresentaram tamanho e índice de polidispersão satisfatórios nas

concentrações entre 0,1 e 1,0 mg/mL. O potencial zeta das NE foi determinado, mas não

foram observadas diferenças significativas entre as formulações testadas que

apresentaram a carga em torno de -50 mV. A eficiência de encapsulação determinada foi

de 22,0; 45,6 e 44,9% nas concentrações de 1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL respectivamente,

permitindo indicar o limite de encapsulação da substância para a formulação escolhida.

As NE-NOR nas concentrações de 0,1 e 0,5 mg/mL apresentaram estabilidade de nove

meses considerando os parâmetros físico-químicos avaliados (tamanho e IP).

Na determinação da atividade hemolítica da NOR, foi constatado que a atividade foi

inferior a 10% nas concentrações de 0,5 e 2,0 µg/mL. Este resultado permitiu determinar,

aproximadamente, as doses para o ensaio de atividade antimalárica, baseando-se na

toxicidade inerente à NOR frente aos eritrócitos. Esta toxicidade foi inferior à toxicidade da

sua fração de origem.

No ensaio de atividade antimalárica, a NOR na forma de solução intraperitoneal a

4, 8 e 20 mg/kg reduziu significativamente (68 a 83%) a parasitemia dos camundongos

infectados pelo Plasmodium berghei NK65 no quarto dia de infecção, quando comparada

ao grupo controle não tratado. Esse índice fora ainda maior para a NOR em nanoemulsão

nas mesmas doses (80 a 84%). A formulação NE-NOR (dose 4 mg/kg) apresentou melhor

redução da parasitemia ao longo do estudo, revelando seu efeito inibitório tardio sobre a

carga parasitária dos animais.

95 A melhoria na eficácia antimalárica como consequência da veiculação em

nanoemulsões foi revelada no estudo de Singh e Vinkar (2008) que conseguiram reduzir

em até 25% da dose de primaquina quando comparada ao fármaco livre no tratamento de

camundongos infectados pelo P. berghei.

A toxicidade da NOR não foi detectada quando comparada aos grupos não

tratados controle. No entanto, foi permitido identificar a perda de peso dos animais após o

5º dia de infecção, sendo a mesma possivelmente atribuída à progressão da infecção.

Estudos anteriores comprovam a capacidade de formulações nanoestruturadas na

redução de toxicidade de fármacos. Mosqueira e colaboradores (2004; 2006) avaliaram a

capacidade de nanocápsulas com superfície modificada de alterar o perfil farmacocinético

do halofantrino, favorecendo sua ação prolongada e reduzindo a cardiotoxicidade

provocada em ratos.

Foi possível identificar a supressão prolongada na dose de 4 mg/kg sobre a

parasitemia dos camundongos infectados, que atingiu 39% no 15º dia após o início da

infecção. No entanto, a necessidade de novos estudos de avaliação da biodisponibilidade

e toxicologia da substância podem indicar pesquisas futuras, visto que em doses maiores

esse efeito não foi detectado.

Desta forma, a Annona crassiflora Mart. confirma-se como uma promissora fonte

de novas substâncias bioativas, como do alcaloide potencialmente bioativo

norestefalagina (NOR) corroborando estudos anteriores que indicaram a atividade

biológica de extratos e frações da espécie (PIMENTA et al., 2003; GONÇALVES et al.,

2010; LAGE, 2011). Este estudo inédito permitiu desenvolver uma metodologia de

quantificação da NOR e produzir formulações contendo esse alcaloide para o tratamento

da malária experimental. Os resultados indicam que novas investigações devem ser

realizadas, tanto de isolamento quanto de avaliação da atividade antimalárica de outros

alcaloides aporfínicos da espécie, ou ainda, no desenvolvimento de formulações

nanoestruturadas que contenham esses compostos naturais; ampliando assim, a

possibilidade de obtenção de novos protótipos ou fármacos para o controle da malária.

96 CONCLUSÃO GERAL

- Foi realizado um estudo biomonitorado de atividade sobre as larvas de A. salina a partir

do extrato etanólico bruto das folhas de Annona crassiflora Mart., que através do

fracionamento cromatográfico permitiu isolar das frações clorofórmicas três compostos

altamente larvicidas, a norestefalagina (NOR), um alcaloide aporfínico e mais dois

compostos ainda em fase de determinação estrutural;

- Uma metodologia inédita de quantificação da NOR foi desenvolvida, por meio do CLAE-

DAD, visando a determinação do alcaloide em formulações nanoestruturadas, que foi

considerado linear na faixa de 1,0 a 50,0 µg/mL, preciso e exato;

- Foram desenvolvidas e caracterizadas nanoemulsões contendo NOR em diferentes

concentrações, sendo que duas delas (0,1 e 0,5 mg/mL) se mantiveram estáveis por até

nove meses;

- A NOR foi considerada pouco tóxica para os eritrócitos em concentrações inferiores a

0,5 e 2,0 µg/mL in vitro;

- A NOR na forma de solução intraperitoneal a 4,0 mg/kg reduziu significativamente (68 a

83%) a parasitemia dos camundongos infectados pelo Plasmodium berghei NK65 até o

quarto dia de infecção, quando comparada ao grupo controle não tratado. Esse índice fora

ainda maior para a NOR em nanoemulsão nas mesmas concentrações (80 a 84%);

- As formulações nanoemulsionadas NE-NOR na dose de 4 mg/kg, apresentaramefeito

tardio de supressão da parasitemia nos camundongos infectados pelo P. berghei quando

comparadas as soluções do alcaloide livre. Conforme os dados da mortalidade e perda de

peso apresentados; as doses de 8 e 20 mg/kg indicaram a possível toxicidade, devido aos

dados de perda de peso e mortalidade apresentados;

97 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA), MINISTÉRIO DA SAÚDE,

BRASIL. Resolução n

899, de 29 de maio de 2003. Dispõe sobre o guia de validação de

métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da República Federativa do Brasil,

Brasília, DF, 02 junho 2003.

ALVING, C.R. Design and selection of vaccine adjuvant: animal models and human trials.

Vaccine, Amsterdam, v.20, p.S56-S64, 2002.

APG: http://www.mobot.org/mobot/research/apweb/, acessado dia 26/03/11.

ARAYA, H. Studies on annonaceous tetrahydrofuranic acetogenins from Annona

squamosa L. seeds. Bull. Natl. Inst. Agro-Environ. Sci., v.23, 77-149, 2004.

BARROSO, G.M. Sistemática de angiospermas no Brasil. Universidade Federal de

Viçosa, Imprensa Universitária, 1991.

BECHER, D.Z. Application in agriculture. In: Becher, P. (Ed.), Encyclopaedia of Emulsion

Technology, first ed. Marcel Dekker, New York, pp. 239–320, 1983.

BOHLIN, L.; BRUHN, J. Biossay methods in natural product research and drug

development. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1999.

BOUCHEMAL, K.; BRIANÇON, S.; PERRIER, E.; FESSI, H. Nano-emulsion formulation

using spontaneous emulsification: Solvent, oil and surfactant optimization. Int J Pharm.,

280 (1-2), 241-251, 2004.

BOULOS, M.; DUTRA, A.P.; DISANTI S.M.; SHIROMA, M.; AMATO NETO, V. Avaliação

clínica do quinino para o tratamento da malária por Plasmodium falciparum. Rev Soc Bras

Med Trop 30: 211–213, 1997.

BRANDÃO, M.; CARVALHO, P.G.S.; JESUÉ, G. Guia ilustrado de plantas do cerrado de

Minas Gerais – CEMIG – Belo Horizonte: Superintendência de Coordenação de Ações e

Estudos sobre o Meio Ambiente, 1992.

98 BRASIL, Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Epidemiológica. Ações de controle

da malária: manual para profissionais de saúde básica. Disponível em:

http://www.saude.gov.br/svs, acessado dia 28/08/2012.

BRASILEIRO, B. G.; PIZZIOLO V. R.; RASLAN, D. S.; JAMAL, C. M.; SILVEIRA D.

Antimicrobial and cytotoxic activities screening of some Brazilian medicinal plants used in

Governador Valadares district. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 42 195-202,

2006.

CARCABOSO, A.M.; HERNANDEZ, R.M.; IGARTUA, M.; GASCON, A.R.; ROSAS, J.E.;

PATARROYO, M.E.; PEDRAZ, J.L. Immune response after oral administration of the

encapsulated malaria synthetic peptide SPf66. Int. J. Pharm., Amsterdam, v.260, p.273-

282, 2003.

CASTANHEIRA, R.G. Desenvolvimento e caracterização de formulações

nanoestruturadas e bioadesivas de uso veterinário. Minas Gerais. Dissertação de

Mestrado, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Cipharma,

Universidade Federal de Ouro Preto, 2012.

CHARMAN, S. A.; CHARMAN, W. N.; ROGGE, M. C.; WILSON, T. D.; DUTKO, F. J.;

POUTON, C. W. Self-emulsifying drug delivery system: formulation and biopharmaceutic

evaluation of an investigational lipophilic compound. Pharmaceutical Research. 9, 87– 93,

1992.

CHAVES, S.S.; RODRIGUES, L.C. An initial examination of the epidemiology of malaria in

the state of Roraima, in the Brazilian Amazon basin. Rev Inst Med Trop, São Paulo 42:

269–275, 2000.

CHIMANUKA, B.; GABRIELS, M.; DETAEVERNIE, M.R.; PLAIZIER-VERCAMMEN, J.A.

Preparation of beta-artemether lipossomes, their HPLC-UV evaluation and elevance for

clearing recrudescent parasitemia in Plasmodium chabaudi malaria-infected mice. J.

Pharm. Biomed., vol.28, 13-22, 2002.

CORTES, D.; TORRERO, M.Y.; D’OCON, M.P.; CANDENAS, M.L.; CAVÉ, A.; HADI, H.A.

Norstephalagine et atherospermidine, deux aporphines d’Arbotrys maingayi relaxants du

muscle lisse. Journal of Natural Products, v.53, 503-508, 1990.

99 COUVREUR, P., VAUTHIER, C. Nanotechnology: intelligent design to treat complex

disease. Pharm. Res., v. 23, p.1417-1450, 2006.

CRAWLEY, J. Malaria: new challenges, new treatments. Curr. Paediatrics, Amsterdam,

n.9, p.34-41, 1999.

DE SIQUEIRA, J.M.; BOMM, M.D.; PEREIRA; N.F.G.; GARCEZ; W.S.; BOAVENTURA,

M.A.D. Estudo fitoquímico da Unonopsis lindmanii Annonaceae, biomonitorado pelo

ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina. Quím. Nova, 21, p.557-559, 1998.

DE SIQUEIRA, J.M.; ZIMINIANI, M.G.; RESENDE, U.M.; BOAVENTURA, M.A.D. Estudo

fitoquímico das cascas do caule de Dughetia glabriúscula – Annonaceae, biomonitorado

pelo ensaio de toxicidade frente a Artemia salina Leach. Quím. Nova, 24, p.185-187;

2001.

DOLABELA, M.F. Triagem in vitro para atividade antitumoral e anti Trypanossoma cruzi

de extratos vegetais, produtos naturais e substâncias sintéticas. Minas Gerais, 130p.

Dissertação de Mestrado, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, ICB, Universidade

Federal de Minas Gerais, 1997.

FIDOCK, D.A.; ROSENTHAL, P.J.; CROFT, S.L.; BRUN, R.; NWAKA, S. Antimalarial drug

discovery: efficacy models for compound screening. Nature Rev Drug Discovery 3: 509–

520, 2004.

FISHER, D.C.H., GUALDA, N.C.A., BACHIEGA, D., CARVALHO, C.S., LUPO, F.N.,

BONOTTO, S.V., ALVES, M.O. YOGI, A., SANTI, S.M.D., AVILA, P.E., KIRCHGATTER,

K., MORENO,P.R.H. In vitro screening for antiplasmodial activity of isoquinoline alkaloids

from Brazilian plant species. Acta Tropica, 82: 261-266, 2004.

FONSECA, C.E.L DA; RIBEIRO, J.F. Fruteiras nativas do cerrado: Estágio atual e

perspectivas futuras. Simpósio Nacional de recursos genéticos de fruteiras nativas. Cruz

das almas: Anais: EMBRAPA – CNPMF, 1992.

GARDELLA, F.; ASSI, S.; SIMON, F.; BOGREAU, T.; EGGELTE, FOUMANE F.B.V.;

HENRY, M.C. KIENTEGA, P.T.; BASCO, L.; TRAPE, J.F.; LALOU, R.; MARTELLONI, M.;

DESBORDES, M.; BARAGATTI, M.; BRIOLANT, S.; ALMERAS, L.; PRADINES, B.;

100 FUSAI, T.; ROGIER, C. Antimalarial drug use in general populations of tropical Africa.

Malaria J. 1, 2008.

GONÇALVES, M.A.; MOSQUEIRA, V.C.F.; PIMENTA, L.P.S. Annona crassiflora wood

constituents: antimalarial efficacy, larvicidal and antimicrobial activity. In: Dr. V K Gupta,

Anil Kumar Verma & Sushma Kaul (Eds.). Comprehensive Bioactive Natural Products.

Houston, pág. 293-305, 2010.

GOPAL, R.E.S. Principles of emulsion formation. In: Sherman, P. (Ed.), Emulsion Science.

Academic Press, London, pp. 1–75, 1968.

GUÉRIN, P.J.; OLLIARO, P.; NOSTEN, F.; DRUILHE, P.; LAXMINARAYAN, R.; BINKA,

F.; KILAMA, W.; FORD, N.; WHITE, N.J. Malaria: current status of control, diagnosis,

treatment, and a proposed agenda for research and development. Lancet Infect Dis 2:

564–573, 2002.

HAAS, S.E.; BETTONI, C.C.O.; KAUSBURG, L.; GUTERRES, S.S.; COSTA, T.D.

Nanoencapsulation increases quinine antimalarial efficacy against Plasmodium berghei in

vivo. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 34, p. 156-161, 2009.

HELENIUS, A.; SIMONS, K. Solubilization of membranes by detergents. Biochemical

Biophysical Acta, 415, 29–79, 1975.

HOCQUEMILLER, R.; CAVÉ, A.; JACQUEMIN, H., TOUCHÉ, A.; FORGACS, P.

Alcaloides des Annonacées, XXXVI: alcaloides de I’Annona crassiflora Mart. Plantes

Médicinales et Phytothérapie, vol.XVI,4-6, 1982.

JOLAD, S.D.; HOFFMAMM, K.H.S.; COLE, J.R. Uvaricin, a new antitumor agent from

Uvaria accuminata (Annonaceae). J. Org. Chem., vol.47, 3151-3153, 1982.

KRETTLI, A.U.; ANDRADE-NETO, V.F.; BRANDAO, M.G.; FERRARI, W.M.G.; FERRARI,

W.M.S. The search for new antimalarial drugs from plants used to treat fever and malaria

or plants randomly selected: a review. Mem. Inst.Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v.96,

p.1033-1042, 2001.

LAGE, G.A. Isolamento, identificação química e bioprospecção de metabólitos

secundários nas folhas Annona crassilfora Mart. Minas Gerais, 130p. Dissertação de

101 Mestrado. Departamento de Química do Instituto de Ciências Exatas (ICEX) da

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), 2011.

LEBOEUF, M.; CAVÉ, A.; BHAMIK, P.K.; MUKHERJEE, R. The phytochemistry of the

Annonaceae. Phytochemistry, 214 (12), 2783-2813, 1982.

LEGRAND, P., BARRAT, G., MOSQUEIRA, V.C.F., FESSI, H., DEVISSAGUET, J.P.

Polymeric nanocapsules as drug delivery systems: A review. S.T.P. Pharma Sci, v.9,

p.411-418, 1999.

LEITE, E.A.; GUIMARÃES, A.G.; GUIMARÃES H.N. MOSQUEIRA, V.C.F. Entrapment of

antimalarial drug in biodegradable nanocapsules reduces side effect of heart damage. In.

PINOTTI M.; WYKROTA, L. POLETTO (ed.), Proceedings os the II Latin American

Congress of Artificial Organs and Biomaterials, reference BRMG046, 2001. [CD-ROM.]

LOOAREESUWAN, S.; CHULAY, J.D.; CANFIELD, C.J.; HUTCHINSON, D.D. Malarone

(atovaquone and proguanyl hydrochloride): a review of its clinical development for

treatment of malaria. Malarone Clinical Trials Study Group. Am J Trop Med Hyg 60: 533–

No documento UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - CIPHARMA (páginas 105-125)