UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - CIPHARMA

ESCOLA DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - CIPHARMA

ISOLAMENTO BIOMONITORADO DE ATIVOS TÓXICOS DAS FOLHAS DE

Annona

crassiflora

Mart. E EFICÁCIA ANTIMALÁRICA DO ALCALOIDE

NORESTEFALAGINA EM NANOEMULSÕES

Bruno César de Albuquerque Ugoline

Bruno César de Albuquerque Ugoline

ISOLAMENTO BIOMONITORADO DE ATIVOS TÓXICOS DAS FOLHAS DE

Annona crassiflora Mart. E EFICÁCIA ANTIMALÁRICA DO ALCALOIDE

NORESTEFALAGINA EM NANOEMULSÕES

Dissertação apresentada ao Programa de Ciências

Farmacêuticas da Escola de Farmácia da

Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito

parcial para obtenção do grau de Mestre em

Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Prof

Dr

Vanessa Carla Furtado

Mosqueira

Co-Orientadora: Prof

Dr

Lúcia Pinheiro Santos

Pimenta

Universidade Federal de Ouro Preto

Ouro Preto

Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

Isolamento biomonitorado de ativos tóxicos das folhas de Annona crassiflora

Mart. e eficácia antimalárica do alcaloide norestefalagina em nanoemulsões

[manuscrito] / Bruno César de Albuquerque Ugoline – 2012.

v, 104 f.: il. color.; grafs., tabs.

Orientadora: Profª Drª Vanessa Carla Furtado Mosqueira.

Co-orientadora: Profª Drª Lúcia Pinheiro Santos Pimenta.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de

Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.

(...) E quando sentir que sua esperança se foi,

olhe dentro de si e seja forte.

E finalmente verá que na verdade

À Deus, Senhor de todas as coisas e ideias. Obrigado por me fazer crer quando

achei que não fosse capaz.

Aos meus Pais, Cida e Cláudio, pelos exemplos, pela sabedoria, pela confiança

nas minhas escolhas.

À minha orientadora Vanessa Carla Furtado Mosqueira, pela oportunidade e

ensinamentos imensuráveis que farão parte da minha história.

À minha co-orientadora Lúcia Pinheiro Santos Pimenta, que mesmo distante, se fez

presente.

Aos professores e grandes colaboradores, Dênia Saúde Guimarães, Carmem

Paula e Neila Barcellos.

Aos amigos do LDGNano Liliam Teixeira, Raquel Castanheira, Giani Garcia,

Alessandra Vidal e Carina pelos ensinamentos práticos e acadêmicos, pelos momentos

descontraídos que tanto fazeram a diferença.

À Gisele Lage do CerquiBio, pela ajuda em muitos experimentos e pela paciência.

Aos funcionários do Cipharma, Mirela e Leonardo, parabéns pelo profissionalismo.

Aos alunos de Iniciação Científica que me acompanharam e também possuem

mérito neste trabalho: Felipe Medeiros, Werônica Lima, Larissa Cotrin, Vanessa Braga e

Rubens Andrade.

Aos amigos da turma GEDUC – Pitágoras, pelas experiências compartilhadas e

pela preocupação de todos com meus resultados.

Aos meus grandes amigos Raphael Hoelzle, Sandra Ambrósio, Éder Siqueira,

Conceição Oliveira, Vânia Lúcia, Marina Pyramo, Leley Silva, Fernanda, Wesley, Welison

e Luiz Fernando pelo companheirismo e lealdade.

A todos meus familiares, que tem em mim um exemplo de batalha: Tios Sérgio,

Regiane, Zezé e Fátima. Às minhas grandes primas irmãs: Tatiane, Jéssica e Poliana

Ugoline. Obrigado por tantos incentivos minha família.

Ao Luciano Ramalho, companheiro de todos os momentos e cúmplice dos meus

fracassos e sucessos. Obrigado por me incentivar a ser melhor a cada dia.

Enfim, agradeço a todos que contribuíram com sua torcida e confiaram em mim.

À Universidade Federal de Ouro Preto e Universidade Federal de Minas Gerais, ao

CNPq, FAPEMIG e CAPES pelo apoio financeiro.

SUMÁRIO

ABSTRACT ... iii

LISTA DE FIGURAS ... ...iv

LISTA DE TABELAS... ...v

1 INTRODUÇÃO GERAL ... 1

2 REVISÃO DE LITERATURA ... 3

2.1 A família Annonaceae e seus principais metabólitos secundários ... 3

2.1.1 A família Annonaceae ... 3

2.2 A espécie Annona crassilfora Mart. - Taxonomia ... 3

2.2.1 Classificação botânica ... 3

2.2.2 Descrição botânica e aspectos econômicos ... 3

2.3 Fitoquímica da família Annonaceae ... 4

2.3.1 Polifenóis ... 6

2.3.2 Terpenos ... 7

2.3.3 Acetogeninas isoladas na família Annonaceae ... 8

2.3.4 Alcalóides ... 8

2.4 A malária e os desafios da terapêutica ... 10

2.4.1 A malária no mundo e no Brasil ... 10

2.4.2 Ciclo da doença e principais sintomas...11

2.4.3 Terapêutica antimalárica ... 12

2.4.4 Desafios e estudos de novos fármacos ... 13

2.4.5 Fármacos antimaláricos derivados de plantas ... 14

2.5 Nanotecnologia farmacêutica aplicada à terapêutica antimalárica ... 17

2.5.1 Nanotecnologia farmacêutica e sistemas vetorizados ... 17

2.5.2 Nanopartículas poliméricas...18

2.5.3 Nanoemulsões ... 18

2.5.4 Caracterização físico-química de sistemas vetorizados...19

2.5.4.1 Tamanho e distribuição...19

2.5.4.2 Potencial Zeta...20

3 OBJETIVOS...21

3.1 Objetivo Geral...21

3.2 Objetivos específicos...21

CAPÍTULO I

Extração e isolamento dos metabólitos secundários de

Annona crassiflora

Mart. . 22

1 MATERIAIS E MÉTODOS ... 22

1.1

Métodos cromatográficos ... 22

1.1.1 Cromatografia em camada delgada de sílica ... 22

1.1.2 Cromatografia líquida sob pressão ... 22

1.1.3 Cromatografia líquida de alta eficiência analítica ... 22

1.1.4 Cromatografia líquida de alta eficiência semi-preparativa ... 22

1.2 Reveladores cromatográficos ... 23

1.3 Métodos físico-químicos e espectrométricos ... 24

1.3.1 Análise do ponto de fusão ... 24

1.3.2 Infra-vermelho ... 24

1.3.3 Ressonância Magnética Nuclear ... 24

1.4 Coleta da A. crassiflora e preparo do material vegetal ... 25

1.4.1 Coleta e identificação botânica da espécie vegetal ... 25

1.4.2 Processamento do material vegetal ... 25

1.4.3 Obtenção do extrato bruto ... 25

1.4.4 Obtenção do perfil cromatográfico impressão digital do extrato etanólico

das folhas por CLAE ... 25

1.5 Obtenção das frações alcalóidicas...25

1.5.1 Marcha química para fracionamento de alcalóides ... 25

1.6 Prospecção química das frações ... 27

1.7 Purificação e isolamento de compostos da fração ACF-CI ... 29

2 RESULTADOS E DISCUSSÃO...30

2.1 Obtenção do perfil cromatográfico do extrato etanólico...30

2.4 Identificação e elucidação estrutural de CI-G2-P1, CI-G2-P2 E

ACF-CI-G15...50

CAPÍTULO II

Ensaio Biomonitorado de letalidade sobre a

Artemia

salina

...51

1

INTRODUÇÃO ... 51

2 MATERIAIS E MÉTODOS ... 51

2.1 Materiais...51

2.2 Eclosão das larvas...51

2.3 Aplicação das amostras...52

2.4 Determinação da dose letal 50% ...52

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...53

CAPÍTULO III

Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para doseamento da

norestefalagina (NOR)...57

1 MATERIAIS E MÉTODOS ... 57

1.1 Desenvolvimento e validação de metodologia analítica...57

1.1.1 Materiais...57

1.1.2 Equipamentos ... 57

1.1.3 Metodologia ... 57

1.1.3.1 Condições analíticas...57

1.1.3.2 Parâmetros de validação ... 58

1.1.3.2.1 Linearidade...58

1.1.3.2.2 Precisão ... 58

1.1.3.2.3 Exatidão ... 58

1.1.3.2.4 Especificidade...59

2.1 Especificidade...60

2.2 Linearidade...60

2.3 Precisão...61

2.3.1 Repetibilidade...61

2.3.2 Precisão intermediária...62

2.3 Exatidão...62

2.4 Limites de detecção e de quantificação...63

CAPÍTULO IV

Desenvolvimento e caracterização das nanoemulsões contendo

Norestefalagina...65

1 MATERIAIS E MÉTODOS ... 65

1.1 Materiais ... 65

1.2 Preparo das nanoemulsões ... 65

1.3 Caracterização físico-química das nanoemulsões ... 66

1.3.1 Distribuição de tamanho ... 66

1.3.2 Potencial Zeta ... 66

1.3.3 Determinação do teor da NOR encapsulada...67

1.3.4 Porcentagem e eficiência de encapsulação ... 67

1.3.5 Avaliação da estabilidade das nanoemulsões...69

2 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 69

2.1 Desenvolvimento e preparo das nanoemulsões ... 69

2.2 Caracterização físico-química das nanoemulsões...71

2.2.1 Distribuição de tamanho ... 71

2.2.2 Potencial Zeta...72

2.2.3 Determinação do teor de NOR encapsulada (Eficiência e porcentagem de

encapsulação) ... 74

2.2.4 Avaliação da estabilidade das nanoemulsões...75

V.I Ensaio de atividade hemolítica in vitro da norestefalagina ... 78

1 INTRODUÇÃO ... 78

2 MATERIAIS E MÉTODOS ... 78

2.1 Materiais ... 78

2.2 Metodologia experimental ... 78

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 79

V.II Ensaio de atividade antimalárica em modelo murino ... 82

1 INTRODUÇÃO ... 82

2 MATERIAIS E MÉTODOS ... 82

2.1 Materiais ... 82

2.2 Animais ... 82

2.3 Cepas...83

2.4 Metodologia experimental...83

2.5 Monitoramento dos animais...84

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 84

DISCUSSÃO GERAL...92

CONCLUSÃO GERAL ... ...95

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

λ

Comprimento de onda

δ

Deslocamento químico

ζ

Potencial Zeta

µg

Micrograma

µM

Micromolar

µm

Micrômetro

CCDS

Cromatografia em camada delgada de sílica

[(CD

)

SO]

Dimetilsulfóxido deuterado

CLAE

Cromatografia líquida de alta eficiência

CLAE-DAD

Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos

CLAE-SP

Cromatografia líquida de alta eficiência semi-preparativa

COSY

Correlation Spectroscopy

CV

Coeficiente de variação

DAD

Detector com arranjo de diodos

DEPT-135

Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer –

ângulo 135°

DL

Dose mínima letal para 50% dos indivíduos

DP

Desvio padrão

ECF

Espectroscopia de correlação de fótons

HCl

Ácido clorídrico

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

IC

Concentração inibitória para 50% dos indivíduos

IP

Índice de polidispersão

IV

Infravermelho

J

Constante de acoplamento escalar

Mart.

Martius

NE

Nanoemulsão

NE-NOR

Nanoemulsão contendo norestefalagina

NH

OH

Hidróxido de amônio

NOESY

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

NOR

Norestefalagina

PEG

Polietilenoglicol

R

Fator de retenção

RMN de

_C

_{Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13}

RMN de

H

Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

TAS

Teste larvicida sobre

Artemia salina

t

Tempo de retenção

RESUMO

Neste trabalho foi realizado o estudo biomonitorado da toxicidade de frações e

metabólitos secundários isolados das folhas de

Annona crassiflora

Mart., planta

conhecida popularmente como araticum ou marolo. Além disso, foi investigada a atividade

antimalárica dos compostos isolados e veiculados em nanoemulsões. O fracionamento do

extrato etanólico, obtido de suas folhas, foi biomonitorado através do teste de letalidade

sobre as larvas de

Artemia

salina

, para a seleção de frações potenciais para obtenção de

substâncias bioativas. O fracionamento do extrato etanólico bruto foi realizado através de

extração ácida e métodos cromatográficos “

flash

” e CLAE-PDA. As frações obtidas foram

submetidas à prospecção fitoquímica, com reagentes e reveladores para identificação das

classes de metabólitos secundários, que levaram à detecção de alcaloides nas frações

clorofórmicas (ACF-CI e ACF-CII). Foi isolado o alcaloide majoritário norestefalagina

(NOR). Sua identificação foi realizada através de métodos espectrométricos como UV, IV,

RMN de

H e de

C, DEPT 135, mapas de contornos COSY, HSQC, HMBC e NOESY.

Foi também desenvolvido e validado um método CLAE-PDA para quantificação da NOR

em nanoemulsões, através da avaliação da linearidade, precisão, exatidão, seletividade e

limites de quantificação e detecção para a metodologia escolhida. Nanoemulsões

contendo NOR (NE-NOR) foram produzidas e apresentaram tamanho e índice de

polidispersão inferiores a 300nm nas concentrações entre 0,1 e 1,0 mg/mL. O potencial

zeta das NE foi determinado, mas não foram observadas diferenças significativas entre as

formulações testadas, estando todas em torno de -50 mV. A eficiência de encapsulação

determinada foi de 22,0; 45,6 e 44,9% nas concentrações de 1,0; 2,0 e 5,0 mg/mL,

respectivamente. As NE-NOR nas concentrações de 0,1 e 0,5 mg/mL apresentaram

estabilidade de nove meses considerando os parâmetros físico-químicos avaliados. Na

determinação da atividade hemolítica da NOR, foi constatado que esta foi inferior a 10%

nas concentrações de 0,5 e 2,0 µg/mL. No ensaio de atividade antimalárica, a NOR em

solução nas doses de 4,0; 8,0 e 20,0 mg/kg por via intraperitoneal reduziu

significativamente (68 a 83%) a parasitemia dos camundongos infectados

pelo

Plasmodium berghei

NK65 no quarto dia de infecção, quando comparada ao grupo

controle não tratado. A redução da parasitemia foi de 80 a 84% para a NOR encapsulada

nas nanoemulsões nas mesmas concentrações. A formulação de NE-NOR (4 mg/kg)

apresentou maior redução da parasitemia ao longo do estudo, revelando seu efeito

inibitório tardio sobre a carga parasitária dos animais.

ABSTRACT

This work reports the bioguided study of the toxicity of fractions and secondary

metabolites isolated from the leaves of

Annona

crassiflora

Mart. popularly known as

“araticum” or “marolo”, as well as the investigation of the antimalarial activity of isolated

substances loaded in nanoemulsions. Fractionation of leave’s ethanolic extract was

bioguided by the test of lethality using brine shrimp metanauplii. Itallows the selection of

potential fractions containing bioactive substances. The crude ethanol extract fractionation

was performed by acid-base extraction using flash chromatography and detected by

HPLC-PDA. Phytochemical screening of the fractions with reagents enables detection of

alkaloids from chloroform fractions (ACF and ACF-CI-CII) and isolation of the major

aporphine alkaloid norstephalagine (NOR). Its identification was performed by

spectrometric methods such as UV, IR,

H NMR and

C NMR, DEPT 135, contour maps

COSY, HSQC, HMBC and NOESY. It was developed and validated an HPLC-PDA

methodology for quantification of NOR in nanoemulsions, assessed by linearity, precision,

accuracy, selectivity and limits of quantification and detection determination of the method.

Nanoemulsions containing NOR were developed and presented suitable size distribution

and surface charge (-50mV) between 0,1 e 1,0 mg/mL. Encapsulation efficiency was 22,0;

45,6 e 44,9% for the concentrations of 1.0; 2.0 e 5.0 mg/mL respectively. NE-NOR at 0,1 e

0,5 mg/mL had shown good stability following 9 months in all physicochemical parameters

evaluated. The hemolytic activity of NOR was lower than 10% at concentrations of 0.5 e

2.0 µg/mL. The antimalarial activity of alkaloid in mice infected with

Plasmodium

berghei

NK65 was also performed. In 4

and 7

days pos-infection, the parasitemia of

mice decreased in the range of 70 and 80% for the tested groups, similarly with

chloroquine group (90%). The NOR nanoemulsified treated group showed prolonged effect

of alkaloid on parasitemia reduction, indicating the maintenance of activity when this

substance was associated to nanostructures.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - A espécie

Annona

crassiflora

Mart...4

Figura 2 - Esquema da extração ácido-base realizada com o extrato hidroalcoólico bruto

(95 g) das folhas de

Annona crassiflora

e obtenção das frações e sólidos...28

Figura 3 – A) Cromatograma do extrato etanólico bruto das folhas de

Annona crassiflora

e

espectros de absorção no UV (254 nm) dos principais constituintes. B) Estrutura química

básica de núcleos oxoaporfínicos e aporfínicos...31

Figura 4 – Cromatograma de ACF-CIa a 254nm...32

Figura 5 –

A) Cromatograma de ACF-CIa-G2 e perfil de absorção no UV a 254 nm de

ACF-CIa-G2-P1 e ACF-CIa-G2-P2 B) Núcleos químicos de alcaloides oxoaporfínicos e

aporfínicos...34

Figura 6 – Perfil cromatográfico e espectro no UV de ACF-CIa-G15 a 254nm...35

Figura 7 –

Esquema do fracionamento da CIa e isolamento dos precipitados

ACF-CIa-G2-P1 E ACF-CIa-G15...36

Figura 8 –

Cromatograma obtido de CLAE em fase reversa e espectro de absorção no

UV de ACF-Al-P1...37

Figura 9 - Espectro no IV de ACF-AI-P1...38

Figura 10 – Estrutura química de ACF-AI-P1 norestefalagina (NOR)...39

Figura 11 – Espectro de RMN de

H de ACF-AI-P1 (400 MHz, DMSO-

d

)...40

Figura 12 –

Espectro expandido de RMN de

H de ACF-AI-P1 (400 MHz, DMSO-

d

)

Expansão da região

de δ 2,4 a 3,8 (400 MHz, DMSO

-

d

)...41

Figura 14 – Espectro de RMN de

_{C e subespectro DEPT 135 de ACF-AI-P1 (100 MHz,}

DMSO-

d

)...43

Figura 15 - Mapa de contornos COSY de ACF-AI-P1 (400 MHz, DMSO-d

)...46

Figura 16 – Expansão do mapa de contornos COSY de ACF-AI-P1 (400 MHz,

DMSO-d

)

na região de δ 2,2 a 4,6...47

Figura 17 – Expansão do mapa de contornos HSQC de ACF-AI-P1 (400 MHz,

DMSO-d

)...47

Figura 18 – Expansão do mapa de contornos HSQC de ACF-AI-P1 (400 MHz,

DMSO-d

)...48

Figura 19 – Expansão do mapa de contornos HSQC de ACF-AI-P1 (400 MHz,

DMSO-d

)...48

Figura 20 – Expansões do mapa de contornos HMBC de ACF-AI-P1 (400 MHz,

DMSO-d

)...49

Figura 21 – Expansão do mapa de contornos HMBC de ACF-AI-P1 (400 MHz,

DMSO-d

)...49

Figura 22 –

Esquema das frações obtidas do extrato hidroalcoólico bruto (95 g) de

A.

crassiflora

e respectivos valores de DL

frente à TAS em µg/Ml...54

Figura 23 – Cromatogramas da norestefalagina a 25,0 µg/mL e da mistura de excipientes

da nanoemulsão obtidos em CLAE-PDA a 241 nm...59

Figura 24 – Curva de calibração do NOR no comprimento de onda de 241 nm;

R

=

Figura 28 – Variação do tamanho das gotículas das NE-NOR em 9 meses a 8ºC...76

Figura 29 – Variação do IP das gotículas das NE-NOR em 9 meses a 8ºC...76

Figura 30 –

Curva de calibração de doseamento da hemoglobina liberada dos

eritrócitos...80

Figura 31 – Porcentagem de hemólise induzida pela NOR...80

Figura 32 – Parasitemia no quarto dia de infecção após tratamento com NOR

segundo o four-day-test...85

Figura 33 – Resultado do Four-day test no sétimo dia de infecção...87

Figura 34 – Parasitemia para os grupos NOR e NE-NOR na dose de 4 mg/kg...88

Figura 35 – Sobrevida dos grupos de animais infectados pelo

Plasmodium berghei

NK65...89

Figura 36 – Peso dos camundongos infectados pelo

P. berghei

NK65 e tratados com

NOR...90

Figura 37 – Peso dos camundongos infectados pelo

P. berghei

NK65 e tratados com

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 -

Massas secas das frações obtidas após extração ácido-base do extrato

etanólico bruto (95 g) das folhas de

A. crassiflora

...27

Tabela 2 - Fracionamento cromatográfico da ACF-Cia...29

Tabela 3 – Grupos provenientes do fracionamento cromatográfico da ACF-Cia...33

Tabela 4 – Dados de RMN de

H de ACF-AI-P1 e suas correlações...44

Tabela 5 - Dados de RMN de

H e de

C, δ em ppm, de ACF

-AI-P1 e norestefalagina

(NOR)...45

Tabela 6 – Concentrações do extrato etanólico e frações de

A. crassiflora

empreg

a

das no

teste larvicida TAS...52

Tabela 7 –

Resultados do teste de letalidade sobre

A. salina

dos extratos e frações

obtidas das folhas de

A. crassiflora

Mart...53

Tabela 8 –

Atividade no teste de letalidade sobre

A. salina

dos compostos isolados

obtidos das frações clorofórmicas ACF-CIa e ACF-AI das folhas de

A. crassiflora

Mart...54

Tabela 9 – Valores da área sob a curva da NOR em função de sua concentração...61

Tabela 10 – Resultados do teste de repetibilidade para validação do doseamento da NOR

a 241 nm...61

Tabela 11 –

Resultados do teste de precisão inter dia, em dois dias, para validação do

doseamento da NOR a 241 nm...62

Tabela 12 – Exatidão do método de doseamento da NOR...63

Tabela 13 – Composição e caracterização das NE brancas...70

Tabela 14 –

Comparação entre os parâmetros físico-químicos das NE-NOR de acordo

com a concentração de NOR e solventes utilizados...72

Tabela 16 – Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NE-NOR com

concentrações de 0,5 e 2,0 mg/mL de NOR...74

Tabela 17 – Delineamento experimental do

four-day-test

...83

Tabela 18 – Tratamento de camundongos Swiss infectados pelo

Plasmodium berghei

1

1 INTRODUÇÃO GERAL

A malária apresenta-se como a principal doença infecciosa prevalente no mundo,

afetando cerca de 250 milhões de pessoas (WHO, 2008). A infecção é causada por

protozoários unicelulares do gênero

Plasmodium

(PIMENTEL

et al

., 2007). No Brasil, as

infecções mais comuns são causadas pelas espécies

Plasmodium vivax

e

Plasmodium

falciparum

(BRASIL, 2006), sendo essas espécies as principais responsáveis pela

prevalência e mortalidade, respectivamente, na malária humana.

A terapêutica antimalárica atualmente empregada é eficaz, mas a adesão dos

pacientes à terapêutica ainda é insuficiente, ocasionada por complexos regimes

posológicos e por efeitos colaterais graves (CRAWLEY, 1999; WINSTANLEY, 2001).

Além disto, o aumento da incidência de resistência aos fármacos disponíveis,

principalmente à cloroquina, tornou-se um fator preocupante e que vem estimulando a

busca por novos compostos e regimes terapêuticos (PIMENTEL

et al

., 2007).

As plantas representam uma importante fonte de novos compostos antimaláricos,

(protótipos) como exemplo, os descobertos ao longo das últimas décadas, desde a

quinina em 1820 até a artemisinina e seus derivados em 1972 (OLIVEIRA

et al

., 2009),

reforçando a importância dessa fonte de fármacos (WRIGHT, 2005). A família

Annonaceae compreende cerca de 130 gêneros e mais de 2300 espécies (ARAYA, 2004).

A espécie

Annona

crassiflora

Mart. é característica do cerrado brasileiro e conhecida

como araticum, sendo utilizada tradicionalmente contra diarreia, reumatismo, infecções

helmínticas e doença de Chagas (TEMPONE, 2005). No entanto, o potencial da espécie é

vasto, sendo relatados estudos sobre as atividades leishmanicida, antimalárica, citotóxica

e antimutagênica (GONÇALVES

et al

., 2010; PIMENTA, 1995; SANTOS

et al

., 1999;

VILAR

et al

., 2008). Na espécie, há predominância de alcaloides; além de polifenóis,

óleos essenciais, terpenos e acetogeninas (PIMENTA, 1995; HOCQUEMILLER

et al

.,

1982).

Os alcaloides são metabólitos secundários que, geralmente, apresentam estrutura

orgânica nitrogenada derivada de aminoácidos (SIMÕES

et al.,

2004)

. Alguns alcaloides

do tipo isoquinolínicos apresentaram atividade antiplasmódica

in vitro

, indicando este

2

Formas farmacêuticas de liberação controlada de fármacos são capazes de manter

ou prolongar a ação de fármacos com potencial no combate e controle da malária,

podendo também permitir a administração de fármacos considerados potencialmente

tóxicos e que são pouco utilizados pela possibilidade de redução da dose

(SANTOS-MAGALHÃES e MOSQUEIRA, 2010); e ainda, melhorar e prolongar a resposta imune a

vacinas (ALVING, 2002; CARBOSO

et al

., 2003).

Os sistemas nanoestruturados são sistemas carreadores de fármacos com

diâmetro inferior a 1000 nm. Dentre os principais sistemas nanoestruturados

encontram-se os lipossomas, as nanopartículas (nanocápsulas e nanoesferas) e as nanoemulsões

(SCHAFFAZIK e GUTERRES, 2003). A principal propriedade dos nanocarreadores no

contexto da malária seria a habilidade de permanecer em circulação no sangue por um

longo período de tempo, liberando lentamente o fármaco, elevando a interação dos

fármacos com as hemácias infectadas (MOSQUEIRA

et al.

, 2004).

Diversos estudos realizados apontam a potencialidade da nanotecnologia na

terapêutica antimalárica. Mosqueira e colaboradores (2004, 2006) avaliaram a atividade

antimalárica de nanocápsulas furtivas de polímero de ácido lático contendo halofantrino,

em camundongos infectados pelo

Plasmodium berghei

, onde uma rápida supressão dos

parasitas foi obtida, além de melhorar o perfil farmacocinético e reduzir a cardiotoxicidade

(LEITE

et al

., 2001). O mesmo resultado foi obtido com a quinina veiculada em

nanocápsulas (HAAS

et al

., 2009).

A utilização de substâncias de origem natural e o desenvolvimento de

medicamentos com liberação controlada são alternativas importantes a serem

consideradas na terapêutica, não somente para melhorar a eficácia contra parasitas

resistentes, como para reduzir os efeitos adversos e melhorar a adesão dos pacientes ao

tratamento, gerando melhorias na eficácia no combate à malária, principalmente no Brasil.

Diante do exposto, este trabalho investigou o potencial antimalárico de um alcaloide

obtido das folhas de

Annona crassiflora

Mart., tanto na forma livre como na forma

3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A Família Annonaceae e seus principais metabólitos secundários

2.1.1 A família Annonaceae

A Annonaceae representa uma família ampla da ordem Magnoliales, abrangendo

cerca de 130 gêneros e mais de 2300 espécies (ARAYA, 2004). Com distribuição tropical

e subtropical, ocorre principalmente como árvores, arbustos ou cipós (QUEIROZ

et al

.,

1996). Apresenta uniformidades anatômica e estrutural, de hábito e do “habitat”,

apresentando características marcantes (BARROSO, 1991). Os principais gêneros

pertencentes a essa família são

Guateria

(250),

Uvaria

(175),

Xylopia

(160),

Polyalthia

(150) e

Annona

(120).

No Brasil, já foram registrados 29 gêneros, compreendendo cerca de 260

espécies. O gênero

Annona

é cultivado e comercializado no Brasil, apresentando

importância econômica, como exemplos as espécies,

A. squamosa

(Fruta-do-conde),

A.

muricata

(graviola),

A. reticulata

(condessa) e

A. cherimola

(cherimoia); fonte de frutos

comestíveis e obtenção de óleos e madeira (LEBOEUF

et al

., 1982).

2.2 A Espécie

Annona crassiflora

Mart. - Taxonomia

2.2.1 Classificação botânica (BARROSO, 1991 e ANGIOSPERM PHILOGENY

GROUP, 2003)

Reino: Plantae

Divisão: Spermatophyta

Subdivisão: Angiospermae

Reino: Magnoliophyta

Classe: Magnolitae

Sub-classe: Magnoliidae

Ordem: Magnoliales

Família: Annonaceae

Subfamília: Annonoideae

Tribo: Unoneae

Gênero:

Annona

4

2.2.2 Descrição botânica e aspectos econômicos

A espécie

Annona crassiflora

Mart. (Figura 1) é conhecida popularmente como

araticum, pinha, marolo, cabeça-de-negro e pinha-do-cerrado. A planta é típica do cerrado

brasileiro, situando-se de forma mais específica no parque-cerrado ou campo de

murundus. Essa tipologia caracteriza-se por um grupamento de espécies sobre pequenos

murundus, formando ilhotas de vegetação arbóreo-arbustiva, distribuídas irregularmente

sobre uma superfície plana e com certo grau de umidade constante (MENDONÇA

et al.,

2000). A

Annona crassiflora

Mart. ocorre nos estados de Minas Gerais, Bahia, Ceará,

Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, São Paulo e Tocantins.

Figura 1 - A espécie

Annona

crassiflora

Mart.

A

Annona crassiflora

é uma espécie arbórea de até 8 m de altura, de tronco ereto

ou não, casca clara, fendida, descamada como cortiça. As folhas são simples, alternas e

elípticas; de haste curta, espessada, quase sem pelos na face superior e recoberta por

pelos cor de ferrugem na face inferior. Suas flores possuem cerca de 3 cm de diâmetro,

podendo estar isoladas ou agrupadas de 2 a 4. São grandes, com pétalas carnosas,

amarelo-avermelhadas (BRANDÃO

et al

., 1992).

Os frutos são utilizados na alimentação na sua forma inteira (

in natura

) ou na forma

5

(LORENZI

et al

., 2002). As sementes são achatadas e elípticas, apresentando

característica de dormência durante meses de estiagem (FONSECA e RIBEIRO, 1992).

2.3 Fitoquímica da família Annonaceae

A família Annonaceae apresentou até 1982, predominância de alcaloides dentre os

metabólitos secundários isolados das espécies pertencentes à família. Outros

constituintes foram relatados na família como polifenóis, óleos essenciais, terpenos e

substâncias aromáticas (LEBOEUF

et al.,

1982).

Estudos fitoquímicos das sementes conduziram ao isolamento de acetogeninas da

Annona crassiflora

, principais marcadores da família Annonaeae, como a araticulina (1).

As acetogeninas tetra-hidrofurânicas foram isoladas primeiramente por Jolad e

colaboradores (1982), sendo que tal descoberta foi importante no direcionamento dos

estudos fitoquímicos, devido às atividades citotóxica, antitumoral e pesticida apresentadas

por esses metabólitos (SANTOS

et al

., 1999; PIMENTA, 1995; SANTOS

et al

., 1994).

Além dessas, outros compostos como a N-trans-cafeoiltiramina (2) e a lignanamida

grossamida (3) foram relatados para a espécie (PIMENTA, 1995). Também foram

isolados das folhas, alcalóides do tipo benzilisoquinolínicos, como a liriodenina (4),

anonaína (5), asimilobina (6) e reticulina (7) (HOCQUEMILLER

et al

., 1982). Da madeira

de

Annona crassiflora

foram isolados os alcaloides oxoaporfínicos aterospermidina (8),

liriodenina (4) e duas acetogeninas (GONÇALVES

et al.,

2010).

(1)

O

O (CH2)7

O O

H3C(H2C)9

HO

6

Serão revisados a seguir os principais metabólitos produzidos pelas espécies da

família Annonaceae.

2.3.1 Polifenóis

Os polifenois são compostos redutores, que são oxidados facilmente gerando

produtos corados. A cor desses produtos de oxidação deve-se ao elevado grau de

conjugação (SIMÕES

et al

., 2004).

Os flavonoides são os principais polifenóis encontrados na família Annonaceae. A

catequina (9) foi relatada em

Annona cherimola

, enquanto a quercetina (10) ocorre em

Annona glabra

,

Annona senegalensis

,

Asimina triloba

e

Annona crassiflora

. Diversas

espécies de gênero

Uvaria

apresentaram o flavonoide pinocembrina (11). As classes mais

(3)

(2)

(

5

)

(

4

)

(

6

)

NH HO

O

(

7

)

N O HO _CH 3 OH O CH3

H3C

(

8

)

7

abundantes de flavonoides no gênero são flavonóis e derivados glicosilados (

O

-glicosídeos e

C

-glicosídeos) (SANTOS e SALATINO, 2000).

(9)

(10)

(11)

2.3.2 Terpenos

Constituem uma classe de substâncias obtidas a partir de unidades C

. Na família

Annonaceae, mono e sesquiterpenos foram relatados como constituintes de óleos

essenciais de inúmeras espécies. A atividade larvicida de uma mistura de sesquiterpenos

foi relatada por Leboeuf e colaboradores (1982). O ácido xilópico (12) isolado de espécies

do gênero

Xylopia

apresentou atividade antimicrobiana (TAKAHASHI

et al

., 2006). Dois

esteroides são comuns na família Annonaceae, o

β

-sitosterol (13) e o estigmasterol (14).

(12)

(13)

(14)

O HO

OH

OH

OH

O

OH

O HO

OH

OH

OH

OH

HO

OH O

O

OAc COOH

HO

H

HO

8

2.3.3 Acetogeninas isoladas da família Annonaceae

As acetogeninas constituem uma série de produtos naturais isolados quase que

exclusivamente de espécies da família Annonaceae. Esses metabólitos apresentam longa

cadeia carbônica C-35 ou C-37 sustentando um anel

γ

-lactônico terminal, podem conter

número variável de anéis tetra-hidrofurânicos, epóxidos ou ligações duplas, além de

vários substituintes oxigenados. A uvaricina (15) foi o primeiro constituinte isolado dessa

classe por Jolad e colaboradores (1982) das raízes de

Uvaria acuminata

, sendo que este

composto apresentou ação antitumoral no sistema de leucemia linfocítica em ratos (OS).

(15)

2.3.4 Alcaloides

Os alcaloides são substâncias nitrogenadas geralmente derivadas de aminoácidos,

sendo agentes potentes e que apresentam diversas propriedades farmacológicas. Dentre

as inúmeras classes de alcaloides relatadas na família, os alcaloides aporfínicos, que

constituem inúmeros compostos inseridos no grupo dos alcaloides isoquinolínicos, já

apresentaram atividades importantes, tais como, as atividades tripanosomicida e contra

espécies de

Leishmania

. Dentre eles destacam-se os compostos liriodenina (4) e

anonaina (5). Estes foram isolados das folhas de

Annona crassiflora

, sendo o primeiro o

principal alcaloide oxaporfínico de espécies da família Annonaceae, e o segundo, o

alcaloide aporfínico mais comum no gênero

Annona

.

A atividade antiplasmódica

in vitro

de alcaloides isoquinolínicos foi avaliada por

Wright e colaboradores (2000), onde o potencial antimalárico foi expresso pela IC

frente

às cepas de

Plasmodium falciparum

, um parasita importante na malária humana. A

coridina (16) apresentou IC

= 22,30 µM, enquanto a norcoridina (17), diferenciada da

anterior apenas pela ausência de um grupo metila ligado ao nitrogênio, exibiu IC

= 3,08

µM. O difosfato de cloroquina foi a droga de referência utilizada e apresentou IC

= 0,20

µM. Diversos estudos revelaram que a resistência à cloroquina por algumas cepas de

P.

O O

(CH2)10

O O

(CH2)9CH3

O O

9

falciparum

é o principal desafio da terapêutica, sendo necessário o desenvolvimento de

novos fármacos para o tratamento da malária. Os estudos realizados com alcaloides

isoquinolínicos indicam que este grupo de compostos pode se tornar uma fonte

interessante de novos fármacos e protótipos.

Chang e colaboradores (1998) constataram que alcaloides isoquinolínicos de

Annona purpurea

inibem a agregação plaquetária

in vitro

induzida por fatores como o

ácido araquidônico. A desidrotalicpureína (18) e 6a, 7-desidrolirinidina (19) inibem a ação

de enzimas ciclooxigenases que convertem o ácido araquidônico em tromboxana A2,

substância fundamental no processo de coagulação. A atividade anticancerígena do

alcaloide roemerina (20) isolado de folhas de

Annona senegalensis

foi demonstrada, onde

o acúmulo de fármaco intracelular foi favorecido pela administração de roemerina em

células de carcinoma de epiderme oral, que apresentavam resistência ao fármaco

tradicional vimblastina.

O alcaloide xilopina (21) apresentou atividade fungicida contra cepas de

Candida

albicans

, enquanto a tetraidroplamitina (22) apresentou atividade bactericida sobre cepas

de

Staphylococcus aureus

(SIMÉON

et al.,

1990). Alguns alcaloides são menos comuns

como a anomontina (23), isolada de

Annona montana

e a samoquasina-A (24), o primeiro

alcaloide benzoquinazolínico obtido, isolado e identificado da família Annonaceae.

(16)

(17)

(18)

(19)

N H3CO

HO _CH

3

H3CO

H3CO

H

HN H3CO

HO

CH3

OCH3

H3CO

H₃CO

OCH3

N H3CO

HO _CH 3 H 6a 7 N H3CO

HO _H

H3CO

H3CO

10

(20)

(21)

(22)

(23) (24)

2.4 A malária e os desafios da terapêutica

2.4.1 A malária no mundo e no Brasil

A malária é a doença parasitária mais prevalente no mundo, sendo causada por

protozoários do gênero

Plasmodium

. A doença está distribuída em regiões tropicais, nas

quais prevalecem as espécies

Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax

,

Plasmodium

malarie

e

Plasmodium ovale

.

Os parasitas são transmitidos ao homem através da picada de fêmeas dos

mosquitos vetores do gênero

Anopheles

. Em 2008, 109 países foram focos endêmicos de

malária, sendo 45 somente na África (WHO, 2008). Foram estimados 247 milhões de

casos em todo mundo em 2006, dos quais 86% ocorreram na África, culminando em mais

de 1,25 milhão de mortes (GARDELLA

et al.,

2008), onde a letalidade da infecção pelo

P.

falciparum

torna-se uma das principais razões desses números. Após a África, Brasil e a

Índia são os principais países com elevada endemicidade no mundo, sendo afetados

também por outras espécies do

Plasmodium

. O parasita

P. vivax

, mesmo não

N H3CO

H3CO

OCH3

OCH3

HN CH3

O

O

OCH3

N CH3

O

O

H

N H

N

N

H2N

NH N

11

apresentando a mesma letalidade como nos casos de infecção pelo

P. falciparum

, causa

sérios impactos econômicos, encontrando-se distribuído a nível global como na América

do Sul, Ásia e Oceania.

Na América, o Brasil apresenta o maior número de casos, cerca de 300000

registros em 2009, dos quais 99,9% ocorrem principalmente na região da Amazônia Legal

brasileira, onde 10 a 15% da população está sob risco (BRASIL, 2010). No Brasil, as

infecções mais comuns são mais causadas pelas espécies

P. vivax

e

P. falciparum

, sendo

15% dos casos provocados pela segunda espécie

(BRASIL, 2010). Alguns fatores

dificultam o controle da doença nessa região, como a intensa migração, condições

inapropriadas de moradia e serviços de saúde inadequados (CHAVES e RODRIGUES,

2000; TAIUL, 2003).

2.4.2 Ciclo da doença e principais sintomas

O ciclo da malária no homem inicia quando um mosquito infectado pica o indivíduo,

inoculando os esporozoítos, que migram para o fígado e invadem os hepatócitos por

mecanismos ainda não totalmente esclarecidos. Cada esporozoíto pode gerar cerca de

30000 novos parasitas no caso do

P. falciparum

ou 10000 na infecção pelo

P. vivax

. Para

este os esporozoítos se desenvolvem mais lentamente nas células hepáticas, e são

conhecidos como hipnozoítos, e que podem permanecer por meses nesse tecido. Os

hipnozoítos induzem às recidivas da doença em até dois anos após a infecção inicial

(KRETTLI

et al

., 2001).

Os estágios assexuados sanguíneos do ciclo do parasita, como trofozoítos e

esquizontes, são os principais agentes etiológicos da infecção, provocando sintomas até

em duas semanas após a inoculação dos esporozoítos. Os estágios assexuados

intra-eritrocíticos são os principais alvos dos fármacos antimaláricos (WINSTANLEY

et al

.,

12

A lise dos eritrócitos desencadeia os principais sintomas da malária como a dor de

cabeça, mialgia, anemia, hepatite, esplenomegalia e períodos cíclicos de febre elevada

entre 48 ou 72 horas. Além desses, sintomas neurológicos graves podem ocorrer

principalmente pela infecção pelo

P. falciparum

, provocando a malária cerebral. Este

forma letal da infecção é causada por eventos de interrupção e bloqueio do fluxo

sanguíneo em pequenos vasos cerebrais devido às alterações nas membranas das

mesmas provocadas pela alta replicação do parasita.

As espécies

P. vivax

e

P. ovale

apresentam estágio dormente (hipnozoítos) no

fígado, que são responsáveis pelas recidivas da doença após o tratamento com

esquizonticidas sanguíneos. O parasita

P. malarie

produz infecções duradouras e que

podem ser assintomáticas no homem por anos ou durante toda a vida (KRETTLI

et al

.,

2001).

2.4.3 Terapêutica antimalárica

O tratamento da malária humana possui como estratégia a redução da morbidade e

mortalidade provocadas pela infecção. O tratamento imediato e eficaz é provavelmente o

principal método de controle da infecção. O tratamento oral interrompe a progressão para

estágios mais graves da doença que resultam em complicações.

Os fármacos antimaláricos utilizados correntemente na terapêutica pertencem a

inúmeras classes como as aminoquinolinas (cloroquina, amodiaquina, primaquina), os

derivados de quimolinometanol (quinina, mefloquina, halofantrino), diaminopiridinas

(pirimetamina), sulfonamidas (sulfadoxina, sulfadiazina), biguanidas (proguanil e

derivados), antibióticos (tetraciclina, doxiciclina, clindamicina), sesquiterpenos (artemisina,

dihidroartemisina, arteether, artemether, artesunato) e naftoquinonas (atovaquona)

(GUÉRIN

et al

., 2002).

A cloroquina (25) é o fármaco amplamente usado na terapêutica, com sua

descoberta e utilização relatadas na década de 40. Este fármaco, basicamente por

apresentar vantagens farmacocinéticas e farmacodinâmicas comparadas aos demais,

tornou-se padrão ouro na terapêutica antimalárica em associação com a

sulfadoxina-piridoxamina. No entanto, a resistência de algumas cepas de

P. falciparum

foi relatada já

13

(25)

A primaquina (26) é aplicada em casos de prevenção de recidivas em casos de

infecção das espécies que apresentam a forma hipnozoíta do parasita em seu ciclo. No

entanto, sua utilização é limitada devido à sua elevada toxicidade. Um análogo da

primaquina, a tafenoquina, tem apresentado elevada eficácia tanto na cura primária da

malária reincidente como na profilaxia das infecções causadas por

P. falciparum

e

P.

vivax

.

(26)

Em 2001, associações terapêuticas formadas pela artemisinina e seus derivados

com fármacos antimaláricos tradicionais foram propostas pela Organização Mundial da

Saúde (OMS), como a artesunato-amodioquina, artemether-lumefantrino (Coartem

),

artesunato-mefloquina e dihidroartemisina-piperaquina (Artecom

). A associação

artemether-lumefantrino é a terapêutica mais eficaz no tratamento da infecção provocada

por

P. falciparum

, tornando-se o tratamento de primeira ou segunda linha para casos não

graves da doença (WHO, 2005; 2008).

2.4.4 Desafios e os estudos de novos fármacos

Apesar da vasta gama de fármacos disponíveis, a quimioterapia da malária ainda

apresenta inconvenientes ligados principalmente ao seguimento da terapêutica, desde

complexos regimes posológicos até efeitos colaterais graves (CRAWLEY, 1999;

WINSTANLEY, 2001). Outra adversidade encontrada, até mesmo como consequência da

ineficácia da quimioterapia, seria a resistência do parasita aos antimaláricos, considerada

N

HN

N CH3

CH3

CH3

Cl

N O

HN

CH3

14

por Crawley (1999) o mais importante problema no controle da doença. A resistência do

P. falciparum

, segundo Wongsrichanalai e colaboradores (2002), se estende a muito

antimaláricos e associações, havendo assim, formação de áreas de multi-resistência.

Há uma urgente necessidade de desenvolvimento de novos fármacos antimaláricos

mais eficazes contra as variedades de cepas de

P. falciparum

. No entanto, deve-se

considerar outros fatores importantes como a facilidade de adesão ao tratamento,

segurança, custo e disponibilidade do tratamento por via oral (WRIGHT, 2005; FIDOCK

et

al

., 2004).

Diferentes abordagens de estudos sobre novos fármacos antimaláricos são visadas

atualmente como a otimização da terapia com fármacos já disponíveis e suas

associações; obtenção de análogos sintéticos; descoberta de agentes antimaláricos

naturais; pesquisas sobre substâncias utilizadas em outras doenças; descobertas de

agentes que inibam a resistência; e quimioterápicos atuantes em outros sítios moleculares

(ROSENTHAL, 2001; 2003).

Para combater os mecanismos de resistência aos fármacos na terapêutica

antimalárica, novas estratégias para a liberação intracelular dos fármacos também

possuem grande importância como em estudos utilizando nanosistemas que promovem o

transporte dos fármacos proporcionando uma fácil passagem pelas membranas celulares

(BAREFORD,

et al

., 2007).

2.4.5 Fármacos antimaláricos derivados de plantas

15

A quinina (27) foi o primeiro representante dos alcaloides antimaláricos, sendo

obtida em 1820 da casca da cinchona (

Cinchona ssp.

) e com estrutura química elucidada

em 1944. Sua síntese em larga escala, no entanto, era complexa e de elevado custo.

Diante disto, sua obtenção por extração é a forma mais utilizada atualmente, sendo o

cultivo realizado principalmente na América do Sul (BOULOS

et al

., 1997). A quinina foi

uma importante descoberta como protótipo para síntese da cloroquina (26) em 1940,

sendo este, até recentemente, o principal fármaco disponível para a terapia.

(27)

(28)

A descoberta da artemisinina (28) foi a contribuição mais recente dos produtos

derivados de plantas para a terapêutica antimalárica. Seu isolamento ocorreu a partir da

espécie

Artemisia annua

, prevalente na China e representou uma nova estrutura

farmacológica importante, uma lactona sesquiterpênica endoperóxido. A artemisinina

também foi protótipo para diferentes derivados como o artemeter (29), arteeter (30) e

artesunato sódico (31); que são atualmente mais empregados na terapêutica por

apresentarem uma farmacocinética mais adequada que a da artemisinina, além de

minimizar os riscos de recidivas e de desenvolvimento de resistência em associação com

uma segunda droga antimalária (OLIVEIRA

et al

., 2009).

(29)

(31)

(30)

H3C

O

O

CH3

H

O

OCOC2H4CO2Na

CH₃ H O

H3C

O O CH3 H O O CH3 H O

H3C

O

O

CH3

H

R

Artemeter R = CH₃

Arteeter R = CH₂CH₃

N H3CO

H

16

(32)

O mais recente fármaco antimalárico descoberto foi a atovaquona (32), um

derivado do lapachol (obtido das espécies

Tabebuia ssp.

), que vem norteando a

tendência das pesquisas. A associação da atovaquona com proguanil (Malarone

)

relatada por Looareesuwan e colaboradores (1999) tem se apresentado muito eficaz

contra malária, entretanto, seu elevado custo de produção em larga escala impossibilita a

fabricação em países onde a doença é endêmica (FIDOCK

et al.,

2004).

O

O

OH

17

2.5 NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA APLICADA À TERAPÊUTICA

ANTIMALÁRICA

2.5.1 Nanotecnologia farmacêutica e sistemas vetorizados

A Nanotecnologia representa uma das fronteiras da ciência, a qual envolve

diferentes aspectos multidisciplinares e pode contribuir muito para o avanço da saúde

humana. A utilização de vetores no controle e liberação de fármacos em sítios de ação

específicos, visando uma otimização da velocidade de cedência e do regime posológico

de substâncias ativas têm sido alvo de intensa pesquisa nos últimos trinta anos

(SCHAFFAZICK e GUTERRES, 2003; COUVREUR e VAUTHIER, 2006).

A nanotecnologia farmacêutica possui como objeto de seu estudo, os sistemas

carreadores de liberação com tamanhos menores que 1 µm. Estes sistemas oferecem

inúmeras vantagens quando comparados aos medicamentos de formas farmacêuticas

convencionais. Os benefícios obtidos na terapêutica são diversos como Legrand e

colaboradores (1999) citaram:

•

Maior eficácia terapêutica, com liberação progressiva e controlada do fármaco, a

partir da degradação da matriz;

•

Diminuição significativa da toxicidade;

•

Maior tempo de permanência do fármaco na circulação;

•

Redução da bioinativação prematura;

•

Administração segura (sem reações inflamatórias locais) e conveniente (menor

número de doses);

•

Direcionamento a alvos específicos;

•

Tanto bioativos hidrofílicos quanto lipofílicos podem ser incorporados.

Segundo Santos-Magalhães e Mosqueira (2010) estas novas estratégias para a

veiculação incluem aplicações importantes da ciência de coloides, nas suas mais variadas

formas (nanogeis, lipossomas, nanopartículas biodegradáveis). Os nanomateriais também

são utilizados no diagnóstico, como por exemplo, os coloides para radiofarmácia e como

agentes de contraste na ressonância magnética.

18

tratamento e profilaxia da malária (SANTOS-MAGALHÃES e MOSQUEIRA, 2010). O

emprego de carreadores de fármacos de liberação controlada tem sido capaz de manter a

eficácia de fármacos já parcialmente abandonados devido aos seus efeitos tóxicos, assim

como de agentes promissores no combate e controle da doença (CHIMANUKA

et al.,

2002). Esses nanocarreadores permitem o uso de fármacos em menor dose com redução

da toxicidade, além de contribuírem para o aumento da duração do efeito e eficácia de

vacinas (PIMENTEL

et al

., 2007). Os carreadores mais importantes relativos a este

estudo serão revisados a seguir.

2.5.2 Nanopartículas poliméricas

São sistemas coloidais vesiculares com tamanho nanométrico, onde o fármaco

encontra-se em uma cavidade oleosa, cercada por uma membrana polimérica (LEGRAND

et al

., 1999). São aplicadas no carreamento de fármacos hidrofóbicos, incorporados em

seu núcleo oleoso (SANTOS-MAGALHÃES e MOSQUEIRA, 2010).

Nanocápsulas furtivas de halofantrino foram desenvolvidas em estudos realizados

por Mosqueira e colaboradores (2004; 2006) com camundongos infectados pelo

Plasmodium berghei

. Os resultados evidenciaram a capacidade das nanocápsulas de

superfície modificada alterar o perfil farmacocinético do fármaco, mantendo-o por longos

períodos na circulação sanguínea e também reduzindo a cardiotoxicidade (LEITE

et al.,

2001).

2.5.3 Nanoemulsões

As nano e microemulsões óleo em água (o/a) em escala nanométrica ( 500 nm)

têm sido investigadas como carreadores de fármacos contra a malária. Esse tipo de

carreadores possui vantagens em relação aos demais como o custo reduzido e a

disponibilidade para administração pela via oral (SANTOS-MAGALHÃES e MOSQUEIRA,

2010). As nanoemulsões possuem maior área superficial e energia livre, sendo um

sistema de transporte mais efetivo comparado às macroemulsões (SHAH

et al.,

2010).

19

busca de novas terapias (VAZIRI e WARBURTON, 1994; NISHI e JAYAKRISHNAN,

2004).

Em estudo realizado por Singh e Vingkar (2008), nanoemulsões preparadas com

primaquina foram administradas por via oral em camundongos infectados por

P. berghei

.

O fármaco apresentou melhora na sua atividade antimalárica em doses 25% menores que

as utilizadas em soluções do mesmo, promovendo uma redução da parasitemia acima de

90%. Além disto, elevou o tempo de sobrevivência dos animais e os níveis do fármaco no

fígado que justificaram sua eficácia no controle da infecção.

Estudos realizados por Viandawgade e colaboradores (2008) demonstraram a

atividade antimalárica contra

P. berghei

em camundongos do artememter em sistemas

auto-emulsionáveis de liberação de fármacos, onde a formulação desenvolvida formava

uma microemulsão rapidamente ao ser administrada via oral. Este sistema apresentou

ação antimalárica superior comparada ao artemeter em cápsulas, este disponível no

mercado, principalmente por favorecer a biodisponibilidade do fármaco.

2.5.4 Caracterização físico-química de sistemas vetorizados

2.5.4.1 Tamanho e distribuição

O tamanho da partícula ou vesícula é um importante parâmetro no controle do

processo e na garantia da qualidade desses sistemas, principalmente devido à

estabilidade física da dispersão depender do tamanho e distribuição do tamanho das

partículas ou vesículas.

A técnica de espalhamento dinâmico da luz ou espectroscopia de correlação de

fótons (ECF) pode ser aplicada na determinação desse parâmetro e baseia-se na

determinação das flutuações na intensidade da luz espalhada pelas nanoestruturas em

função do tempo (SCHOLES

et al

., 1993). Uma grande vantagem desta técnica em

comparação ao espalhamento de luz estático é permitir a determinação da distribuição do

diâmetro das partículas, e não apenas um valor médio de diâmetro.

20

valores de IP menores ou iguais a 0,3 apresentam-se monodispersas, ou seja,

representam uma única população de nanopartículas com distribuição de tamanho

gaussiana (SCHOLES

et al

., 1993).

2.5.4.2 Potencial Zeta

A determinação do potencial zeta

(ζ)

baseia-se no fenômeno relacionado à carga

líquida na superfície da partícula que afeta a distribuição de íons à sua volta, elevando a

concentração de contra-íons junto à superfície (LEGRAND

et al.

, 1999). A bicamada

formada apresenta regiões distintas; uma interna, formada por íons fortemente ligados à

superfície; e uma externa, onde a distribuição dos íons é dependente do equilíbrio entre

forças eletrostáticas e movimento térmico. O potencial zeta reflete o potencial elétrico

existente na superfície das partículas e pode ser influenciado pela carga dos diferentes

componentes dessas estruturas, localizado na interface com o meio dispersante, e pela

adsorção de espécies iônicas do meio de dispersão, levando ao movimento do plano de

cisalhamento para longe da superfície (LEGRAND

et al.

, 1999).

2.5.4.3 Eficiência de encapsulação e porcentagem de encapsulação

Este parâmetro permite determinar a quantidade de fármaco que é associada ao

sistema nanocarreador em todo o processo de produção das formulações

nanoestruturadas. Assim determina-se o quanto do fármaco encontra-se associado às

nanoestruturas em relação à quantidade inicial de fármaco adicionado ao sistema. A

eficiência de encapsulação de um fármaco pode influenciar na estabilidade da preparação

e, consequentemente, alterar seu perfil de liberação. O teor do fármaco associado às

nanoestruturas depende de fatores como o método de preparo da formulação,

surfactantes e/ou polímeros empregados, polaridade do fármaco, solubilidade do mesmo

no núcleo oleoso entre outros (MORA-HUERTAS

et al.

, 2010).

2.5.5 Estabilidade

21

22

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Realizar estudo biomonitorado de ativos potencialmente citotóxicos obtidos das

folhas de

Annona crassiflora

Mart, e investigar particularmente as frações ricas em

alcalóides com atividade antimalárica

in vivo

, visando a obtenção de produtos isolados

com tal atividade, para desenvolvimento de formulações nanoestruturadas adequadas ao

tratamento antimalárico em modelo murino.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

•

Identificar as frações larvicidas e citotóxicas

in vivo

do extrato etanólico das folhas

da

Annona crassiflora

Mart, através do ensaio biomonitorado de letalidade sobre

larvas de

Artemia salina

, direcionando o estudo para o isolamento de compostos

potencialmente bioativos;

•

Isolar através de fracionamento cromatográfico, e identificar alcaloides e/ou outros

metabólitos secundários bioativos das frações potenciais por meio de estudo

biomonitorado;

•

Desenvolver e validar uma metodologia analítica de doseamento dos alcaloides

isolados, para determinação do seu teor em formulações farmacêuticas

nanométricas (nanoemulsões ou nanocápsulas);

23

CAPÍTULO I – EXTRAÇÃO E ISOLAMENTO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE

Annona crassiflora

MART.

1 MATERIAIS E MÉTODOS

1.1 Métodos cromatográficos

1.1.1 Cromatografia em camada delgada de sílica (CCDS)

Foram utilizadas placas de vidro revestidas com suspensão de sílica gel 60 G

(Merck, Alemanha) em água destilada e ativadas em estufa a 100 °C.

1.1.2 Cromatografia líquida sob pressão (Cromatografia

Flash

)

Baseada no fenômeno de adsorção, este método consiste em colunas de vidro

contendo um dispositivo para adaptação de entrada de ar comprimido. Foi utilizada uma

coluna de sílica gel 60, com partículas de 40-60 µm (230-400 ASTM – Merck

) e bomba

Pump Module C-601 (Buchi

, Alemanha), sob um fluxo de 5 cm/min. A escolha do eluente

para o método foi determinada em CCDS, quando o constituinte apresentou um fator de

retenção (R

) igual a 0,35.

1.1.3 Cromatografia líquida de alta eficiência analítica (CLAE)

CLAE UFLC Shimadzu, módulo CBM-20A, bomba LC-6AD e detector de arranjo de

diodos SPD-M20A. A coluna utilizada foi Shimadzu Shim-pack ODS-18 (

5 μm, 250 mm x

4,6 mm) e pré-coluna Shimadzu Shim-Pack ODS-18 (5

μm

, 20 mm x 4,6 mm). A fase

móvel inicial foi composta de metanol:água (43:57) até atingir 100% de metanol aos 30

min. O fluxo foi mantido a 0,8 mL/min, sendo o tempo de corrida de 65 min.

1.1.4 Cromatografia líquida de alta eficiência semi-preparativa (CLAE-SP)