4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 CULTIVO DE Mysidopsis juniae
4.3 ESTUDO DAS VARIÁVEIS PARA DEFINIÇÃO DO MÉTODO PARA O TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA
4.3.4 Montagem do teste
Sugere-se que sejam utilizados para o início do teste apenas organismos que apresentem sensibilidade adequada, por meio de monitoramento realizado com Dodecil Sulfato de Sódio, ou outra substância de referência, conforme recomendações da ABNT 15308:2011 (ABNT, 2011) que padroniza ensaios de toxicidade aguda.
Também sugere-se iniciar o teste de toxicidade com 90 organismos juvenis com 5 a 7 dias de vida para o controle e 90 para a amostra, considerando que, após o dimorfismo sexual, possam ser criadas famílias na proporção de 1 macho para 4 fêmeas. Deve-se montar um número igual de famílias para o controle a para a amostra, a partir dos 90 juvenis iniciais, em triplicata. Os organismos excedentes após o dimorfismo sexual devem ser descartados. Um esquema desse sistema a ser elaborado é demonstrado na Figura 19.
Figura 19: Diagrama esquemático para a montagem de um teste de toxicidade crônica com M. juniae.
No caso do teste de toxicidade, o uso de Erlenmeyer de 1 litro é mais adequado, já a quantidade de organismos necessária para um teste é menor que a de cultivo e que este tipo de recipiente ocupa menor espaço em relação aos frascos de 2 litros. Este tipo de frasco também apresenta robustez para minimizar as variações no volume de água e na salinidade entre os períodos de troca de água do teste. Em cada um dos recipientes devem estar contidos uma quantidade de 16 fêmeas para 4 machos, garantindo assim uma densidade máxima de 20 organismos por litro de amostra (1 misidáceo/50 mL).
A alimentação dos misidáceos deve ser realizada diariamente de acordo com a idade dos organismos, conforme recomendado pela ABNT 15308:2011, utilizando Artemia sp. eclodidas com 48 horas de vida e enriquecidas com óleo de peixe e óleo de fígado de bacalhau. 4.3.5 Condições abióticas para o teste
As condições para o a execução dos testes de toxicidade crônica devem ser semelhantes ao cultivo, buscando dessa forma minimizar variações nos resultados causadas por variações em parâmetros abióticos.
Essa manutenção das condições análogas ao cultivo tornam desnecessários períodos de adaptação dos organismos teste. Caso sejam necessárias análises com amostras ambientais que possuem características diferentes das listadas no Quadro 18, deverá se tomar o cuidado para não causar variações abruptas nas condições em que os misidáceos estão adaptados.
O Quadro 18 apresenta as condicionantes para o teste de toxicidade crônica. De maneira geral, busca-se com o estabelecimento desse padrão causar o mínimo de interferências durante a avaliação da toxicidade crônica e dessa maneira, garantir a confiabilidade nos resultados observados durante o teste de toxicidade, além de tornar possível a reprodução dessa metodologia em outros laboratórios de toxicologia ambiental e ecotoxicologia.
Quadro 18: Condições definidas para o teste de toxicidade crônica.
Descrição Recomendado
Sistema Semi-estático
Temperatura 25±1 oC
Fotoperíodo 12 horas luz; 12 horas escuro Capacidade do
Recipiente
Erlenmeyers de 1 litro Densidade populacional 50 mL/indivíduo
Aeração Constante e branda
Água marinha Reconstituída a partir de água deionizada com sal marinho
Troca de água 1 vez por semana – total Relação macho:fêmea Proporção de 4 fêmeas para cada macho
Continuação – Quadro 18: Condições definidas para o teste de toxicidade crônica.
Descrição Recomendado
Idade dos organismos 3 a 5 dias de vida
Tipo de Alimento Náuplio de Artemia sp. com 48 h de vida, enriquecida com óleo de fígado de bacalhau e óleo de peixe (na proporção de 0,1 mL de
cada óleo para 100 mL de água marinha)
Controles diários Temperatura máxima e mínima da água e máxima, salinidade e aeração
Controles semanais Nº de adultos e de filhotes, medição do tamanho por amostragem simples, salinidade
da água
Controle da Sensibilidade das culturas
Teste com a substância de referência Dodecil Sulfato de Sódio. A CL50(96h) obtida
deve estar em um intervalo de ± 2 desvios- padrão em relação aos valores médios anteriormente obtidos para uso da prole para
início do teste crônico. 4.4 ESTUDO DE CASO UTILIZANDO O MÉTODO
DESENVOLVIDO PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE
CRÔNICA EM AMOSTRAS DE ÁGUA DA BAIA DA BABITONGA Após a definição da metodologia para avaliação da toxicidade crônica, buscou-se a aplicação desse método primeiramente em amostras ambientais, já que nessas amostras, normalmente os poluentes encontram-se muito diluídos e não oferecem efeitos agudos ao organismo teste.
A baía da Babitonga (BB) é um ambiente que possui essa característica. Apesar da intensa antropização, como o volume de água da BB é elevado e o tempo de residência de 99% da água da BB é de 237 dias (AMORIM et al., 2006), é propiciada a dispersão dos poluentes ao longo do tempo e também sua diluição no interior do estuário.
Os experimentos foram conduzidos ao longo de 60 dias, conforme definido no método, com a água coletada nos pontos selecionados. Foram realizadas trocas de água semanais dos aquários controle e dos aquários com a amostra, bem como o acompanhamento de parâmetros físico-químicos de forma a garantir acuracidade no teste. Os dados obtidos nos testes de toxicidade crônica são apresentados nos Apêndices A14 a A17.
Os parâmetros oxigênio dissolvido, temperatura, salinidade, pH da água nos controles e amostras estudadas ficaram na faixa de 4,3-6,3 mg·L-1 (> 60% de saturação), 23-26 ºC, 32-35‰, 8,1-8,3 respectivamente. A sobrevivência de 96 horas na primeira geração foi ≥ 95% nos controles e nas amostras em todos os casos testados.
O teste executado apresentou-se adequado para a identificação de alterações nas características definidas para avaliação. Foi possível identificar diferenças estatísticas significativas nas características crescimento, reprodução, tempo para primeira prole e mortalidade, quando comparados os grupos controle com as amostras nos pontos interiores à BB. No ponto P4, localizado em uma região de mar aberto, não houve diferença estatística significativa em nenhuma das variáveis avaliadas. Esse comportamento dos resultados confirma a hipótese de que a BB é um local em que a presença de poluentes pode causar interferências na saúde dos ecossistemas. Os resultados das características avaliadas são apresentados de forma resumida no Quadro 19. A codificação APn significa “Amostra do Ponto n” e CPn “Controle do Ponto n”, sendo n o número do ponto. Foram usados métodos estatísticos inferenciais para identificar se ocorreram diferenças significativas entre os controles e as amostras e também para verificar se ocorreram diferenças significativas entre os controles dos pontos P1 a P4, visando verificar a estabilidade dos testes executados. Cada um dos testes foi realizado em períodos diferentes, por esse motivo, cada um deles possui um controle associado.
As regiões preenchidas em cinza no Quadro 19 denotam as características que apresentaram diferenças significativas com base no método estatístico utilizado.
Quadro 19: Comparação entre as amostras e os controles considerando as variáveis estudadas nos ensaios de toxicidade crônica, reprodução, tamanho e mortalidade.
Variável AP1 CP1 AP2 CP2 AP3 CP3 AP4 CP4
Primeira prole na primeira geração (dias) (1) 17 (1) 34 18 27 23 28 16 16 Primeira prole na segunda geração (dias) (1) 57 (1) 36 16 23 24 21 13 16 Média e desvio- padrão do tamanho dos organismos (mm) na 1ª geração 3,802 ± 0,8764 3,89 ± 0,6176 * 3,180 ± 0,7423 * 3,513 ± 1,193 * 3,422 ± 0,8977 * 3,731 ± 0,8140 4,243 ± 0,3765 4,083 ± 0,2350 Nascidos na primeira geração *142,35% maior que o controle *100% 24,71% menor que o controle 100% 19,51% menor que o controle 100% 16% menor que o controle 100% Nascidos na segunda geração 21,43% maior que o controle 100% *45,24% menor que o controle * 100% 100% igual ao controle 100% 18% maior que o controle 100% Mortalidade total após 50 dias de teste na 1ª geração * 70% * 65.6% * 88,7% * 60% ** 79,2% ** 72,1% 52,8% 48,3% (1)
variáveis que apresentaram diferenças significativas entre a amostra e o controle para um intervalo de confiança de 95% utilizado o teste estatístico Qui-quadrado com um intervalo de confiança de 95%.
* variáveis que apresentaram diferenças significativas entre a amostra e o controle utilizando o teste t de Student, para um intervalo de confiança de 95%.
** variáveis que apresentaram diferenças significativas entre a amostra e o controle apenas após 40 dias de teste, utilizando o teste t de Student com intervalo de confiança de 95%.