MORFOLÓGICOS

GI - Controle (Fase de proestro): No Grupo Controle (GI), a adrenal encontra-se

revestida por uma cápsula constituída de tecido conjuntivo denso não modelado. Abaixo desta, identificamos duas regiões bem distintas: a cortical, que é a região mais periférica, e a medular, que se situa no centro da glândula. A região cortical está constituída por células epiteliais que se agrupam formando cordões de células rodeadas por capilares bem definidos. Estes cordões se dispõem de tal maneira que podemos identificar três zonas, a saber: uma mais periférica, de pequena espessura, localizada logo abaixo da cápsula denominada zona glomerulosa (Fig. 2). Nesta área, as células agrupam-se formando arcos. Outra zona, bem mais desenvolvida, sendo formada por cordões paralelos denominada de fasciculada. Nesta zona as células são poliédricas, com núcleo central e volumoso, apresentando citoplasma vacuolizado, com imagem negativa de lipídios, denominadas de espongiócitos. E uma última camada menor onde os cordões se entrelaçam denominada de reticulada. Nesta última zona, as células são de pequeno volume. Algumas apresentam núcleos picnóticos. Na região mais interna e central da adrenal situa-se a zona medular, contendo maior concentração de vasos sanguíneos com células mais volumosas (Fig. 3).

20 Fig. 2 – Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GI, mostrando: cápsula (C), zona glomerulosa (G) e a zona fasciculada (F). H.E.

Fig. 3 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GI, mostrando a zona reticulada (R) e

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GII - Sham: Os aspectos histológicos da adrenal no Grupo Sham são

semelhantes aos observados no Grupo Controle (GI).

Fig. 4 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GII, mostrando: cápsula (C), zona

glomerulosa (G) e a zona fasciculada (F). Estão indicados também os vasos sanguíneos (VS) e espongiócito (ES). H.E.

Fig. 5 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GII, mostrando a zona reticulada (R) e

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GIII - Pinealectomizado: Neste grupo notamos que, macroscopicamente, a

adrenal encontra-se bem mais volumosa do que nos Grupos Controle (GI) e

Sham (GII). Os aspectos morfológicos são muito parecidos aos já descritos. As

zonas glomerulosa e fasciculada são muito semelhantes ao dos grupos anteriores, no entanto, a zona reticular mostra-se muito mais volumosa. Esta última zona está constituída por células epiteliais de formas poligonais, mais volumosas do que nos grupos anteriores, com núcleos volumosos e ricos em eucromatina. Em alguns locais identificamos a presença de áreas mais claras sugerindo imagem negativa de gordura. Há também a presença de capilares dilatados.

Fig. 6 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIII, mostrando: cápsula (C), zona

23 Fig. 7 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIII, mostrando a zona reticulada (R),

onde se pode visualizar as células mais volumosas, vasos sanguíneos (VS) mais dilatados e uma suposta presença de gordura nesta área (ES). Notar também a presença da medula (M). H.E.

GIV - Pinealectomizado + Melatonina: Os aspectos morfológicos da adrenal

neste grupo são muito parecidos aos observados nos Grupos Controle (GI) e

Sham (GII), ou seja, as glândulas adrenais apresentam-se de menor tamanho e

24 Fig. 8 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIV, mostrando: cápsula (C), zona

glomerulosa (G) e a zona fasciculada (F). H.E.

Fig. 9 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIV, mostrando a zona reticulada (R) com

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IMUNOHISTOQUIMICOS

Fator de crescimento Endotelial vascular (VEGF)

Os dados referentes à mensuração do VEGF estão expressos na tabela 2. Na figura 10 estão expressas as fotomicrografias referentes ao VEGF nos vários grupos de estudo.

Tabela 2 – Mensuração das várias camadas da adrenal de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo.

GRUPOS

GI GII GIII GIV

Glomerulosa ++ ++ ++ ++

Fasciculada + + ++ +

Reticulada + + + +

Código: + a +++ representam graus de reatividade de cor da glicoproteina VEGF- A. GI = Proestro; GII = Sham; GIII – Pinealectomizado + veículo; GIV – Pinealectomizado + Melatonina.

26 Fig. 10 – Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade ao VEGF presente no citoplasma (coloração marrom castanho) celular das zonas glomerulosa e fasciculada.

Fig. 11 – Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade ao VEGF presente no citoplasma celular (coloração marrom castanho) da zona reticulada.

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Caspase - 3 clivada

Os dados referentes à quantificação da caspase 3 clivada estão expressos na tabela 3. Na figura 10 estão expressas as fotomicrografias referentes a Capase 3 clivada nos grupos de estudo.

Tabela 3 – Quantificação (%) da reatividade a Caspase 3 clivada nas várias camadas da adrenal de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo.

GRUPOS

GI GII GIII GIV

Glomerulosa 20,12±2,12 19,50±3,32 21,13±2,11 19,45±3,14 Fasciculada 21,21±2,15 25,22±4,23 15,51±3,12* 25,40±3,21 Reticulada 12,22±2,21 13,41±1,15 8,11±1,90* 9,51±2,15

Código: GI = Proestro; GII = Sham; GIII – Pinealectomizado + veículo; GIV – Pinealectomizado + Melatonina. * P<0,05.

28 Fig. 12 – Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade da Caspase-3 no citoplasma celular (coloração marrom castanho) nas zonas glomerulosa e fasciculada.

Fig. 13 – Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade a Caspase-3 no citoplasma celular (coloração marrom castanho) na zona reticulada.

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30 A adrenal, material por nós escolhida para a realização deste trabalho está relacionada com a produção de esteróides sexuais, mostra aumento na espessura das zonas fasciculada e reticulada em ratas em estro permanente, causado pela administração de propionato de testosterona (SILVA et al., 2007; SILVA et al., 2009). Uma vez que a pinealectomia induz um estado de estro permanente, acreditamos que esta hipertrofia deve ocorrer também nas várias camadas da adrenal.

Para o presente estudo, foi escolhida a rata por ser um animal de pequeno porte, fácil de ser manipulado, dócil, mas com tendência fácil ao estresse, exigindo pouco espaço para alojamento e manuseio, fácil recuperação dos agentes anestésicos com pós-operatório relativamente curto. Além de ter a mesma procedência, ser de fácil disponibilidade e podendo ser obtido através do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais em Medicina e Biologia (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM) todas com a mesma idade, tamanho e pequena variação de peso (LIMA et al., 2005; SILVA et al., 2007; SOARES JR et al., 2003 (b), etc).

Inúmeros trabalhos descrevem a técnica da pinealectomia em ratos, como o de KUSZAK e RODIN (1977), que teve o seu trabalho como base para melhorar a padronização desta técnica, a qual foi por nós utilizada (MAGANHIN et al., 2009). Mesmo com tais melhoras, que levaram à diminuição da taxa de mortalidade, a cirurgia ainda é um tanto delicada, pois pode acarretar na remoção não só da pineal como também de fragmentos do encéfalo da rata. O inverso também pode ocorrer, tendo partes da pineal retirada, mas ainda restando fragmentos que poderiam produzir melatonina, em níveis muito pequenos, mas mesmo assim levando a um falso resultado.

Em outros estudos, como os de EVÊNCIO-NETO et al. (2001), foi utilizado o frasco âmbar como recipiente para administrar a solução de melatonina nas ratas. No nosso estudo, os frascos âmbar foram ainda envoltos por papel alumínio, para nos certificar de que não haveria a entrada de nenhum tipo de luz, pois a melatonina é fotossensível, sendo rapidamente degradada. Isso somado ao fato de que as ratas ficavam em biotério fechado, com luz controlada por um timer, o que nos dava uma garantia maior de que não haveria interferência da luz externa durante o período escuro.

31 Nossos resultados morfológicos mostraram que não houve alterações em todas as zonas da cortical da adrenal. A zona glomerulosa permaneceu com a mesma configuração nos quatro grupos estudados.

A zona fasciculada teve poucas alterações na sua morfologia, cabendo a zona reticulada ter uma acentuada mudança. O grupo pinealectomizado (GIII) teve as células da zona reticulada com núcleos mais volumosos e ricos em eurocromatina, o que indica haver maior atividade celular. O mesmo grupo também apresentou, macroscopicamente, uma adrenal maior quando comparada aos outros grupos. Esses dados têm respaldo no tocante à hipertrofia da adrenal, sendo encontrados nos estudos de LIMA et al. (2002) em pinealectomia de ratos. No entanto, a zona que mais se hipertrofiou nesse estudo, assim como no de DEFRONZO e ROTH (1972) foi à zona fasciculada, onde houve aumento das taxas de RNA e DNA nas células do córtex da adrenal de ratas submetidas à pinealectomia, havendo a reversão deste quadro quando a melatonina exógena foi administrada. Outro estudo, MILOVANOVIĆ et al. (2003) também mostraram haver aumento no diâmetro e no volume das células da zona fasciculada após injetar etanol intraperitonealmente em ratas não pinealectomizadas. Já MENDONÇA et al. (2002) mostraram que, deixar as ratas na ausência de luz por um período de 15 dias, induz aumento no número de células da zona fasciculada, mas não leva a um aumento no tamanho macroscópico da adrenal. Estes últimos sugerem que ocorre um aumento na produção da melatonina pela pineal, o que leva a uma proliferação celular na zona fasciculada.

Em nosso estudo, o grupo das ratas pinealectomizadas, mas com administração de melatonina (GIV), tiveram os efeitos revertidos, ou seja, assemelhando-se novamente ao grupo controle (GI) e Sham (GII).

Os resultados de apoptose usando a Caspase-3 clivada mostraram que a ausência de melatonina reduz a taxa de apoptose nas zonas fasciculadas e reticulada, o que pode justificar o aumento macroscópico da adrenal como um todo. Já o tratamento com melatonina reverte ao normal os níveis de apoptose na zona fasciculada nos animais pinealectomizados.

A zona glomerulosa manteve-se, sem alterações significantes, com relação ao nível de apoptose em todos os grupos. Esta zona está relacionada basicamente com a produção de mineralocorticóides, ou seja, regula os níveis séricos dos minerais presentes no plasma sanguíneo. Já a zona fasciculada teve

32 uma queda no seu índice de apoptose no grupo pinealectomizado (GIII) sem tratamento com melatonina, tal queda foi revertida no grupo pinealectomizado com melatonina (GIV).

A zona reticulada é a que teve o menor índice apoptótico no grupo de ratas pinealectomizadas (GIII), tal quadro, teve pouca melhora quando se administrou a melatonina após pinealectomia (GIV). Este dado também é conflitante com os achados por outros autores. EVÊNCIO-NETO et al. (2001) observaram através do método de TUNEL que só a zona reticulada apresentou células imunopositivas. Também foi observado que, nos animais pinealectomizados, com seis meses de pós-operatório, o número de células em apoptose foi maior que nos outros grupos. O mesmo pode ser encontrado em um estudo mais antigo. CARSIA et al. (1996), que estudou apoptose na região cortical da adrenal de ratas hipofisectomizadas, também observaram células em apoptose quase exclusivamente na zona reticulada, sugerindo que o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) seria o único hormônio pituitário capaz de bloquear a apoptose nas células da região cortical.

Com relação ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), a zona glomerulosa, mais uma vez, não teve alterações significantes em nenhum dos grupos estudados. A maior diferença entre os grupos foi observada na zona fasciculada do grupo pinealectomizado (GIII). Nela o VEGF ficou mais expresso quando comparado aos outros grupos. Tal quadro foi revertido no grupo pinealectomizado com melatonina (GIV) onde a expressão voltou a ficar semelhante com a dos grupos controle (GI) e Sham (GII).

Nossos resultados, assim como o de vários outros autores, mostraram que a melatonina exerce uma influência sobre a camada cortical da adrenal em ratas pinealectomizadas. No entanto, outros estudos devem ser feitos com este modelo experimental para aprofundar os conhecimentos desta influência, tanto nos aspectos morfológicos, histoquímicos quanto nos fisiológicos.

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34 Nossos resultados permitem-nos concluir que ratas pinealectomizadas e tratadas com melatonina, que:

1 – A pinealectomia leva a um aumento das adrenais, em especial nos núcleo sdas célulasa presentes zona reticulada, no entanto, a administração de melatonina reverte esse quadro;

2 - A pinealectomia diminui o índice de apoptose nas zonas fasciculada e reticulada, sendo que a melatonina exógena reverteu esse efeito somente na zona fasciculada;

4 - A expressão do VEGF apresenta-se mais intensa no grupo pinelaectomizado em especial na zona fasciculada, sendo que a melatonina exógena reverteu esse efeito.

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