LUIZ FERNANDO PORTUGAL FUCHS
ASPECTOS HISTOMORFOLÓGICOS E IMUNOHISTOQUÍMICOS
DA ADRENAL DE RATAS PINEALECTOMIZADAS E TRATADAS
COM MELATONINA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestrado em Ciências pelo Programa de Pós-Graduação em Ginecologia
LUIZ FERNANDO PORTUGAL FUCHS
ASPECTOS HISTOMORFOLÓGICOS E IMUNOHISTOQUÍMICOS
DA ADRENAL DE RATAS PINEALECTOMIZADAS E TRATADAS
COM MELATONINA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestre em Ciências pelo Programa de Pós-Graduação em Ginecologia
Orientador:
Prof. Dr. Edmund Chada Baracat
Co-orientadores:
Prof. Dr. José Maria Soares Júnior Ms. Carla Cristina Maganhin
Fuchs, Luiz Fernando Portugal
Aspectos histomorfológicos e imunohistoquimicos da adrenal de ratas pinealectomizadas e tratadas com melatonina. / Luiz FernandoPortugal Fuchs- São Paulo, 2009.
XXIII, 42f.
Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ginecologia.
Título em Inglês: Histomorphologic and imunohistochemical aspects of the pinealectomized female rat adrenal after treatment with melatonin
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LUIZ FERNANDO PORTUGAL FUCHS
ASPECTOS HISTOMORFOLÓGICOS E IMUNOHISTOQUÍMICOS
DA ADRENAL DE RATAS PINEALECTOMIZADAS E TRATADAS
COM MELATONINA
Tese apresentada a Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM) para obter o Título de Mestre em Ciências
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LUIZ FERNANDO PORTUGAL FUCHS
ASPECTOS HISTOMORFOLÓGICOS E IMUNOHISTOQUÍMICOS
DA ADRENAL DE RATAS PINEALECTOMIZADAS E TRATADAS
COM MELATONINA
Orientador
Prof. Edmund Chada Baracat
Professor Titular da Disciplina de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM)
Co-orientadores
Prof. Dr. José Maria Soares Júnior
Professor Livre-Docente da Disciplina de Endocrinologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM)
Ms. Carla Cristina Maganhin
Pós-graduanda do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
Chefe do Departamento
Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
Coordenador do Curso de Pós-Graduação
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Aos meus pais Marina Santos Portugal e Decio Fuchs por estarem
sempre do meu lado. Dando apoio, compreensão e carinho incondicionais tanto
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Ao Prof. Dr. EDMUND CHADA BARACAT, pela grande oportunidade, apoio e dedicação fundamentais para a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. JOSÉ MARIA SOARES JÚNIOR, por sua atenção e dedicação para a feitura deste trabalho e por todos os seus ensinamentos que incrementaram muito a minha formação acadêmica.
Ao Prof. Dr. MANUEL DE JESUS SIMÕES, que sempre acreditou em mim, pela calma, ensinamentos, doçura, palavras de apoio, incentivo, e paciência dedicados tanto a mim como para este estudo.
À doutoranda CARLA CRISTINA MAGANHIN, minha colega de trabalho, pelo apoio, atenção, dedicação e estímulo.
Aos alunos e colegas de estudo CAMILA RENNÓ GUIMARÃES, CAMILA TESTONI CANNATO, DANILO MENDES AKIAU, LAURA HELENA GASPARINI FERNANDES, MARCELLE CAVALCANTE FONSECA, WAGNER ALESSANDRO PINTO DE OLIVEIRA, pela contribuição fundamental, companheirismo e incentivo sem a qual este trabalho não poderia ser realizado.
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Meus sinceros agradecimentos a todos que de alguma forma, indireta ou diretamente auxiliaram eincentivaram este trabalho, em especial:
Às secretárias ILÇA BESSA, KELEN RAQUEL MARTINS e KARIM MARTIM DOS SANTOS pela ajuda, compreensão e palavras de incentivo.
Aos funcionários PEDRO NOBRE DOS SANTOS e EDNALDO GOMES DE MEDEIROS pela ajuda, amizade e incentivo.
A todos os FUNCIONÁRIOS, DOCENTES e PÓS GRADUANDOS do Setor de Histologia e Biologia Estrutural pela atenção, carinho, dedicação, paciência e apoio.
A todas as pessoas que de uma forma ou de outra, direta ou indiretamente contribuíram e viabilizaram a realização desta Tese.
A CAPES, pelo apoio financeiro durante o período de realização da Tese.
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Introdução: A pineal, moduladora da reprodução em mamíferos, influencia as gônadas e a ciclicidade estral por intermédio de alterações no eixo hipotálamo-ovário-adrenal. Objetivo: analisar a histomorfologia e a imunohistoquímica da adrenal de ratas pinealectomizadas e tratadas com melatonina. Material e métodos: foram utilizadas 40 ratas adultas, divididas em 4 grupos de 10 animais cada, a saber: GI – sem intervenção cirúrgica, com administração do veículo; GII – falsamente pinealectomizados com administração do veículo; GIII
– pinealectomizados tratados com veículo; GIV- pinealectomizados com administração de melatonina (10μg/animal) durante a noite. Após 60 dias de experimento, todos os animais foram anestesiados, e a adrenal retirada e fixada em formol tamponado a 10%. Após processamento histológico para inclusão em parafina, os cortes foram corados pelo H.E e outros submetidos a métodos imunohistoquímicos para detecção da Caspase-3-clivada (apoptose) e fator de crescimento vascular (VEGF). Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística (P<0,05). Resultados: morfologicamente, não houve
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Introduction: The pineal gland is the modulator of mammal’s reproduction, it has
some influence in gonads and in the estrous cycle thru hipotalamus-ovary-adrenal axis. Objectives: The objective of this study is to analyze the histomorphology and imunnohistochemical of the pinealectomized and treated
with melatonin female rat’s adrenals. Material and methods: Forty adult female rats were divided in 4 groups of 10 animals each. GI – no surgery intervention, with vehicle administration; GII – falsely pinealectomized with vehicle administration; GIII – pinealectomized with vehicle administration; GIV –
pinealectomized with melatonin administration (10μg/animal) during the night. After 60 days of experiment, all animals where anesthetized, and the adrenal removed and fixed in 10% formaldehyde. After histological processing to be embedded in paraffin, some slides were stained by H.E. and others submitted to imunnohistochemical to detection of Caspase-3 clivated (apoptosis) and vascular endothelial growth factor VEGF. The obtained data were submitted to statistics (P<0,05). Results: Morphologically, there weren’t modifications in the
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Dedicatória ... vi
Agradecimentos especiais ... viii
Agradecimentos ... x
Resumo ... xii
Abstract ... xiv
Sumário ... xvi
Lista de Figuras ... xviii
Lista de Tabelas ... xx
Lista de Abreviaturas e Siglas ... xxii
Introdução ... 1
Objetivos ... 8
Material e Métodos ... 10
Resultados ... 18
Discussão ... 29
Conclusões ... 33
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Fig 1 Ilustração mostrando os procedimentos cirúrgicos da pinealectomia em ratos... 14 Fig 2 Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GI, mostrando:
cápsula, zona glomerulosa e a zona fasciculada H.E... 20 Fig 3 Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GI, mostrando a
zona reticulada e inúmeros vasos sanguíneos H.E... 20 Fig 4 Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GII, mostrando:
cápsula, zona glomerulosa e a zona fasciculada H.E... 21 Fig 5 Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GII, mostrando a
zona reticulada e vasos sanguíneos H.E... 21 Fig 6 Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIII, mostrando:
cápsula, zona glomerulosa e a zona fasciculada H.E... 22 Fig 7 Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIII, mostrando
a zona reticulada H.E... 23 Fig 8 Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIV, mostrando:
cápsula, zona glomerulosa e a zona fasciculada H.E... 24 Fig 9 Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIV, mostrando
a zona reticulada com vasos sanguíneos H.E... 24 Fig 10 Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas
pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade ao VEGF presente no citoplasma (coloração marrom castanho) celular das zonas glomerulosa e fasciculada... 26
Fig 11 Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade ao VEGF presente no citoplasma celular (coloração marrom castanho) da zona reticulada... 26 Fig 12 Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas
pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade da Caspase-3 no citoplasma celular (coloração marrom castanho) nas zonas glomerulosa e fasciculada... 28
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Tabela 1 Especificações dos anticorpos primários utilizados na reação imuno-histoquímica... 16 Tabela 2 Mensuração das várias camadas da adrenal de ratas
pertencentes aos vários grupos de estudo (VEGF)... 25 Tabela 3 Quantificação (%) da reatividade a Caspase 3 clivada nas
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Abreviaturas Descrição
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
APAF-1 Fator de ativação associado a apoptose-1 ATP Adenosina trifosfato
DNA Ácido desoxi-ribonucleico FCF Receptor de estrogênio alfa FSH Hormônio folículo estimulante H.E. Hematoxilina e Eosina
IGF-1 Fator de crescimento insulinóide-1 LH Hormônio luteinizante
OH Hidroxila
ROO Peroxila
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2 As adrenais são glândulas endócrinas que se localizam acima dos rins sendo revestidas por uma cápsula de tecido conjuntivo rico em fibras colágenas, que se estende para o interior da glândula em forma de trabéculas (EVÊNCIO-NETO et al., 1997, SILVA et al., 2007).
Pela análise morfológica notamos que estão constituídas por duas regiões distintas: medula e córtex. A medula, originada da crista neural, está funcionalmente relacionada ao sistema nervoso simpático e segrega os hormônios adrenalina e noradrenalina em resposta à estimulação simpática. Estes hormônios, por sua vez, provocam quase os mesmos efeitos que a estimulação direta dos nervos simpáticos, em todas as partes do organismo.
Já o córtex da adrenal tem origem a partir do epitélio celomático e apresenta três camadas bem definidas, a saber: zona glomerulosa, zona fasciculada e zona reticulada (MENDONÇA et al., 2002). Tendo a principal função
de produzir esteróides, sendo alguns sexuais.
Estes hormônios podem ser divididos em três categorias: os mineralocorticóides, os glicocorticóides e por último os androgênios. Cada categoria é produzida em determinada zona. A glomerulosa produz os mineralocorticóides, o qual se destaca a aldosterona, atuando exclusivamente no controle hídrico e nos eletrólitos extracelulares. Na zona fasciculada, ocorre a produção dos glicocorticóides, tendo a corticosterona como o principal hormônio. Eles possuem um efeito metabólico sobre carboidratos, lipídios e proteínas. Os cortisois aumentam a gliconeogênese e a síntese de glicogênio, inibindo a utilização da glicose celular e estimulando o armazenamento de glicogênio. A zona reticulada, região mais interna do córtex produz hormônios andrógenos em pequena escala, em contrapartida aos testículos e ovários. Vale citar que, quando há qualquer distúrbio nesses hormônios por parte da glândula adrenal, pode levar a alguma síndrome, como a de Cushing (MENDONÇA et al., 2002).
3 neuroendócrinas amplamente distribuídas: células do coração, fígado, rins, gônadas e neurônios adrenérgicos do sistema nervoso simpático pós-ganglionar e sistema nervoso central. Em conjunto com a medula constituem o sistema paraganglionar (EVÊNCIO-NETO et al., 1997, SILVA et al., 2007, MOULIN et al.,
2007).
A pineal, glândula amplamente aceita como moduladora da reprodução em mamíferos, apresenta capacidade de influenciar as gônadas e a ciclicidade estral (SOARES JR et al., 2003). Sua atividade pode ser avaliada pelos níveis séricos
de melatonina, os quais variam de acordo com as diferentes fases do ciclo estral da rata e tendo os maiores valores durante a noite (JOHNSON et al., 1982).
Trabalhos mostraram que em ratas e hamsters, a pinealectomia leva a abertura vaginal precoce, hipertrofia ovariana e aumento da cornificação das células vaginais (DARDES et al., 2000). Esses efeitos podem ser revertidos após
ministração de melatonina. Em contraste, a melatonina reduz o peso dos ovários e retarda o amadurecimento sexual em ratas (DARDES et al., 2000).
Em laboratório (DARDES et al., 2000), estudos mostraram que a redução
dos níveis de melatonina em ratas pode levar ao desenvolvimento de micropolicistos ovarianos. SOARES JR. et al. (2003b) observaram aumento do
número de células intersticiais e proliferação da teca interna do folículo ovariano. Além disto, TEIXEIRA et al. (2004) mostraram que animais pinealectomizados
apresentaram redução da fertilidade com diminuição de ovócitos durante a ovulação. Já a reposição de melatonina reduz o número de cistos presentes nos ovários das ratas, provavelmente devido aos seus efeitos anti-gonadotrópicos (TEIXEIRA et al., 2004). Além disto, ratas submetidas à cirurgia para remoção da
pineal apresentaram hiperplasia do endométrio, a qual também foi revertida pelo uso da melatonina (PRATA LIMA et al., 2004).
4 MASANA & DUBOCOVICH, 2003), com ápice ao redor da meia-noite. Posteriormente, há queda durante o dia, quando se detecta os menores níveis sangüíneos deste hormônio (MASANA & DUBOCOVICH, 2003).
Além da regulação do sono, a melatonina controla o ritmo de vários outros processos fisiológicos no período noturno: a digestão torna-se mais lenta, queda da temperatura corporal, o ritmo cardíaco e a pressão sanguínea diminuem e o sistema imunológico é estimulado. Parece ser capaz de aumentar a mobilidade e a atividade das células de defesa, fortalecer a formação dos anticorpos e facilitar a defesa contra os vírus (MACCHI & BRUCE, 2004; CLAUSTRAT et al., 2005).
Costuma-se dizer, por isso, que a melatonina é a molécula chave que controla o relógio biológico dos animais e humanos. Contudo as condições dietéticas podem afetar o transporte de triptofano para o encéfalo e conseqüentemente afetar a síntese de melatonina. Deve-se salientar que experimentos mostram que a melatonina teria efeito antioxidante, retardando o processo de envelhecimento (MACCHI & BRUCE, 2004; CLAUSTRAT et al., 2005).
Os efeitos da melatonina na função gonadal dependem, sobretudo, da espécie estudada. Há animais sazonais, como a ovelha e o hamster, nos quais este hormônio teria ação pró-gonadotrófica (SOARES JR. et al., 2003). Nos
não-sazonais, a fertilidade não estaria relacionada com as estações do ano, como o homem, os primatas e alguns roedores, como o camundongo e o rato (SOARES JR. et al., 2003a) a melatonina apresenta ação anti-gonadotrófica (MASANA et al.,
2005).
As ratas que foram expostas à iluminação constante, tiveram produção reduzida de melatonina e o seu ciclo estral alongado, com maior incidência de estro. No entanto, a ministração exógena de melatonina em animais pinealectomizados ou mantidos sob iluminação constante, tem efeito contrário, regularizando o ciclo (WURTMAN et al., 1964; GITTES & CHU, 1965).
Similarmente, a pinealectomia, aumenta a incidência de estro e prolonga a duração do ciclo em ratas que previamente apresentavam ciclos estrais regulares. Em nosso meio, DARDES et al. (2000) mostrou que há queda do nível de
5 Sabe-se ainda que o implante de melatonina na eminência média do hipotálamo determina diminuição dos níveis do hormônio luteinizante (LH) e, em conseqüência, bloqueio gonadotrófico em ratas (AMADOR, 1986). BHAGAT et al.
(1994) detectaram queda dos níveis séricos de FSH e LH em ratas submetidas à ooforectomia unilateral e subsequentemente tratadas com melatonina. Este fato sugere ação deste hormônio em níveis hipotalâmicos ou em centros corticais superiores.
Um grupo de peptídeos são os fatores de cresimento, que se assemelham aos hormônios. Estes possuem diversas funções afetando uma grande gama de sistemas biológicos, entre eles a estimulando a divisão celular, angiogênese, indução ou inibição da diferenciação celular, transformação ou indução da síntese de proteínas. Possuem uma grande variedade de fontes e alvos celulares (MEDEIROS et al., 2003).
Dos fatores de crescimento conhecidos, os que aparecem com mais evidência com relação à renovação tecidual e vascular são: o fator de crescimento do fibroblasto (FCF) e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF). O FCF é uma reação básica (FCF-b) que possui o maior número de reações fisiológicas e o fator de crescimento vascular endotelial subtipo-A (VEGF-A) sendo influenciado pelos hormônios estrogênios (PIOVESAN et al., 2005). Tais
substâncias são moduladas pelo estrogênio, se apresentando com alterações em tumores (SANCHEZ-BARCELO et al., 2005). Estudos demonstram que a
melatonina, quando associada à quimioterápicos, pode interferir no sistema imune, como em outros fatores de crescimento (COS et al., 2006).
Define-se angiogênese a formação de novos vasos sanguíneos pela migração e proliferação de células endoteliais vindas de vasos já existentes (PLENDL, 2000). Tal processo é intimamente relacionado com o aumento da expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), considerado o principal fator mitogênico das células endoteliais, que induz a migração, diferenciação proliferação das células, tendo um papel também na maturação e estabilização dos vasos sanguíneos (FAVIR & CORVOL, 2001).
6 com anovulação crônica e policistose ovariana, há uma elevação sérica do VEGF e do IGF-1 (ABD et al., 2005).
Outro fator que contribui para o controle das células é a apoptose, ou, morte celular programada. É um processo celular fisiológico essencial para o desenvolvimento dos seres vivos. Sua principal função é eliminar células indesejáveis através de um complexo mecanismo metabólico, geneticamente regulado, levando a retração celular, perda de aderência à matriz extracelular, condensação da cromatina, fragmentação internucleossômica do DNA e formação de corpos apoptóticos. Tal fenômeno foi descrito pela primeira vez 1972 por KERR et al. sendo essencial em processos de organogênese, hematopoiese,
reposição teciual, atrofia de órgãos, respostas inflamatórias e eliminação de células após dano por agentes genotóxicos (GRIVICICH et al,. 2007).
A ativação de certas enzimas específicas conhecidas como caspases, resulta nas alterações morfológicas observadas nas células em tal processo, modulando-o e servindo como marcadores primários em ensaios de apoptose antes mesmo dos sinais morfológicos aparecerem (BOATRIGHT et al., 2003;
NICHOLSON et al., 1997).
Em seres humanos, são conhecidos. 14 tipos de caspases, onde só parte delas tem propriedade pró apoptótica (GRIVICICH et al., 2007). Caspases-1, 4 e
5, por exemplo, possuem grande importância em processos inflamatórios, enquanto caspases-2, 3 e 10 são predominantemente (se não exclusivamente) envolvidas na apoptose (NICHOLSON et al., 1997).
A apoptose pode ter duas vias: a extrínseca e intrínseca e ambas terminam com a ativação das caspases, levando à morte celular (BERGANTINI et al., 2005
e GRIVICICH et al., 2007). A via extrínseca começa através de ligantes
específicos, como por exemplo, o Faz-L, que se liga a um grupo de receptores de membrana da superfamília dos TNFs (Faz), ativando receptores de morte específicos, assim há o recrutamento de caspase-8 e a ativação da caspase-3 havendo então a morte por apoptose (GRIVICICH et al., 2007). A via intrínseca
7 liberando proteínas pró-apoptóticas no citoplasma. Tais alterações na mitocôndria provocam o bloqueio na síntese de ATP, levando à um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, contribuindo para a ativação de caspases 9 e 3. Além disso, citocromo C é liberado da mitocôndria para o citoplasma, onde forma um complexo com fator de ativação associado à apoptose-1 (APAF-1) e caspase-9, o chamado apoptossomo, que promove a clivagem da pró-caspase-caspase-9, liberando a caspase-9 ativa, que é capaz de ativar a caspase-3 e provocar a apoptose (GRIVICICH et al., 2007). É importante notar que, tanto na via extrínseca quanto
na intrínseca, após a caspase 3 ser ativada, torna-se irreversível a morte celular. Trabalhos mostram a ação anti-apoptótica da melatonina em diferentes sítios, tais como, timo, rim, cérebro e fígado e, atribuem isso principalmente à suas propriedades antioxidantes (BAYDAS et al., 2007; HOIJMAN et al., 2003;
MOLPECERES et al., 2007; NAVA et al., 2000; PEDREAÑEZ. et al., 2004;
SAINZ, et al. 1999), ao eliminar ânions hidroxila (OH-), peroxila (ROO-) e
superóxidos (PIERI et al., 1994; TAN et al., 1993). Também é capaz de exercer
atividade antioxidante ao regular negativamente os níveis de óxido nítrico sintase, enzima envolvida na síntese de óxido nítrico (KOH 2008). Em nosso meio, LIMA
et al. (2005) observaram que administração de melatonina em ratos
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Objetivos Gerais
Avaliar a morfologia e a imunohistoquímica da adrenal de ratas pinalectomizadas e/ou com reposição de melatonina.
Objetivos específicos
a) analisar a morfologia da adrenal de ratas pinealectomizas e/ou tratadas com melatonina;
b) avaliar o índice de apoptose (Caspase 3-clivada) na adrenal de ratas pinealectomizas e/ou tratadas com melatonina;
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11 Foram utilizadas ratas (Rattus norvegicus albinus, Rodentia Mammalia) da
Colônia OUTB EPM-1-Wistar, adultas, virgens, com peso aproximado de 250 gramas, oriundas do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais em Medicina e Biologia (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM) e manipuladas de acordo com os Princípios Éticos para Experimentação (OLFERT et al., 1993). Antes do inicio do
experimento, o projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da UNIFESP-EPM (Projeto nº0693/07).
Os animais foram realocados no Biotério da Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural do Departamento de Morfologia e Genética da UNIFESP-EPM, sendo confinados 5 em cada gaiola de plástico com tampa gradeada de metal, com dimensões de 45 x 35 x 15 cm de comprimento, largura e altura respectivamente. Estas últimas foram mantidas no Biotério com fotoperíodo e temperatura (22 °C) controlada. Foi feito o fotoperíodo claro de 10 horas intercalado com escuro de 14 horas. O período claro foi considerado das 8 horas às 18 horas, sendo usada uma iluminação artificial produzida por lâmpadas fluorescentes marca Phillips (modelo luz do dia de 40 Watts), desde o início até o término do experimento. A alimentação constituiu-se de ração padrão (Labina-Purina, São Paulo, Brasil) e água "ad libitum".
Após duas semanas de adaptação ao novo ambiente, todos os animais foram submetidos a um exame colpocitológico (às 8 horas), por 21 dias consecutivos, objetivando a avaliação do ciclo estral. A secreção vaginal foi obtida através de hastes de algodão, umedecidas com solução salina (cloreto de sódio a 0,9%). O conteúdo foi transferido para lâminas histológicas, fixado em solução de álcool-éter (1:1) e corado pelo Método de Harris-Shorr (SHORR, 1941). Posteriormente, tais lâminas foram submetidas à análise em microscópio de luz. Somente as ratas com ciclos estrais regulares (proestro, estro, metaestro e diestro), ou seja, que apresentaram atividade ovariana satisfatória foram incluídas no estudo (MONTES & LUQUE, 1988).
Assim, 40 ratas foram distribuídas aleatoriamente em 4 grupos, contendo 10 ratas cada, a saber:
12 Grupo Sham (G-II) – animais falsamente pinealectomizados tratados com
veículo;
Grupo experimental (G-III) – animais pinealectomizados tratados com veículo; Grupo experimental (G-IV) – animais pinealectomizados com reposição de melatonina (10 µg/animal) durante a noite;
A reposição de melatonina nos animais, ocorreu durante sessenta dias consecutivos, ministrada na água de beber, em frascos âmbar cobertos com papel alumínio, na dose de 10 microgramas (μg)/noite/rato (0,4 μg/ml), das 18 horas às 8 horas. O início da reposição melatonina ocorreu 21 dias após a realização do ato cirúrgico.
A melatonina foi preparada diariamente dissolvendo-se 400 mg de melatonina cristalina (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA) em 1 ml de etanol e esta solução diluída posteriormente em 1 litro de água filtrada.
Com relação aos grupos G-I, G-II e G-III foram ministrados a mesma concentração de solução de etanol na água de beber (veículo da melatonina).
PINEALECTOMIA
Para realização da ferida cirúrgica, foi feita anestesia dissociativa utilizando cloridrato de xilazina (20 mg/kg) (Rompun ) e cloridrato de quetamina (10 mg/kg) (Ketalar ), via intraperitoneal. Sob efeito do anestésico, realizou-se a tricotomia da região dorsal do crânio, sendo os animais posicionados em um aparelho estereotáxico com duas torres (Dual Manipulator Stereotaxic, marca Stoelting). Em seqüência foi realizada uma incisão na linha médio-dorsal do crânio. Tal incisão se deu desde a região interauricular até a região interorbitária. As abas de pele foram rebatidas, e assim mantidas; a fáscia subjacente e o periósteo raspado de modo a expor a calota craniana. Com um micromotor de baixa rotação (peça de mão) e uma broca esférica nº 05, retirou-se um fragmento circular da calota craniana de
13 Após a retirada do fragmento da calota craniana, pode-se visibilizar a junção do seio venoso sagital superior e transverso (em forma de Y). Com dois fios de nylon (3-0 Prolene ) passados delicadamente por baixo do seio sagital, um próximo à confluência dos seios e outro mais afastado deste ponto, de modo que uma vez tracionados, obteve-se a ligadura destes seios (MAGANHIN et al., 2009).
Sob lupa estereoscópica, realizou-se uma incisão entre os dois nós e em seguida, o nó próximo à confluência foi afastado para visibilização e retirada da glândula pineal por intermédio de pinça de microcirurgia (Roca Inox). A seguir, o fragmento da calota craniana foi recolocado em seu lugar e as camadas cirúrgicas suturadas.
14 Fig 1– Ilustração mostrando os procedimentos cirúrgicos da pinealectomia em ratos. A - a seta mostra a localização da abertura da calota craniana para remoção da glândula pineal na cabeça da rata; B sutura do seio venoso abaixo da dura mater, mostrando veia longitudinal dorsal (d) e veia transversal (t); C – exposição da glândula pineal após a ligadura e tração do seio venoso (d); D e E
– visão lateral das regiões encefálicas: cérebro (CE), cerebelo (C), seio venoso (SV) e glândula pineal (P). Notar que a figura E mostra a ligadura do seio venoso (MAGANHIN et al., 2009).
O mesmo procedimento do ato operatório foi realizado com os animais dos grupos GII (Grupo Sham), porém sem a retirada da glândula pineal, com o objetivo
de eliminar falsos resultados devido à ação do procedimento cirúrgico.
RETIRADA DAS ADRENAIS
Vinte dias antes da eutanásia reiniciaram-se novamente a coleta de esfregaços vaginais que foram realizados diariamente até o termino do experimento. No 60º dia do tratamento todos os animais que se apresentavam na fase de proestro, devido à produção elevada de esteróides ovarianos durante esta fase foram submetidos à eutanásia. Os animais que não estiveram nesta fase continuaram recebendo as dosagens sendo submetidos à eutanásia assim que atingiram a referida fase.
15 colocado em posição dorsal, os pêlos da região foram retirados por tração manual. Uma incisão abdominal longitudinal na linha média foi imediatamente realizada, expondo-se os órgãos internos. Após o afastamento dos órgãos, como intestino, fígado e rins, as glândulas adrenais foram localizadas uma em cada lado da rata, uma do lado direito e outra no lado esquerdo.
As glândulas adrenais, esquerda e direita foram fixadas em formaldeído (tamponado a 10%) e processadas para análise.
ANÁLISE MORFOLÓGICA
Usou-se formaldeído tamponado a 10% para fixar as glândulas adrenais, por 12 horas e depois desidratadas em concentrações crescentes de álcool etílico, diafanizadas em xilol e impregnadas pela parafina líquida em estufa, regulada à temperatura de 60 ºC, segundo a metodologia preconizada por MICHALANY (1998). Em seqüência, os blocos de parafina contendo as glândulas adrenais foram cortados em micrótomo do tipo Minot, ajustado para 3 m. Os cortes foram
colocados em lâminas previamente untadas com albumina de Mayer e mantidos
em estufa regulada à temperatura de 37 ºC, durante 24 horas, para secagem e colagem. Uma lâmina de cada animal foi submetida ao método de coloração pela hematoxilina e eosina (H.E), para posterior análise morfológica, sendo utilizado um microscópio de luz, da marca Carl Zeiss, com objetivas variando de 4 a 400 X.
ANÁLISE MORFOMÉTRICA
Realizou-se a avaliação histológica e morfométrica da espessura das várias camadas da cortical da adrenal analisadas pelo programa AxionVision. Este equipamento consiste em um microscópio de luz Axiolab Standart 20, acoplado a uma vídeo câmera de alta resolução (AxionCam, Carl Zeiss, Jena, Alemanha) que transmite a imagem a um computador (ROSSI et al., 2006).
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA
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Tabela 1: Especificações dos anticorpos primários utilizados na reação imuno-histoquímica.
Anticorpo Clone Fornecedor Recuperação
antigênica Diluição VEGF-A C-1 Santa Cruz Biotechnology Inc. Panela a Vapor 1:100 Casp3 clivada Santa Cruz Biotechnology Inc. Panela a Vapor 1:100
As lâminas com os cortes seguiram o seguinte protocolo:
a-) desparafinação: as lâminas foram deixadas em estufa a 60ºC por 12 horas, para melhor adesão do tecido, e em seguida desparafinadas com 3 banhos em xilol por 5 minutos cada em temperatura ambiente;
b-) hidratação: as lâminas foram submersas duas vezes em etanol absoluto por 5 minutos e lavadas com água corrente por 2 minutos para hidratação dos cortes;
c-) recuperação antigênica: as lâminas foram colocadas em solução de citrato de sódio 10mM pH 6,0 por 30 minutos em panela de vapor (95ºC), deixando-se depois esfriar a temperatura ambiente por 20 minutos e lavadas em PBS (Tampão Salina Fosfato) 0,05M, pH 7,4 3 vezes por 3 minutos cada;
d-) bloqueio da peroxidase endógena: as lâminas foram incubadas com peróxido de hidrogênio 3%, quatro vezes por 5 minutos cada, e em seguida, lavadas com água corrente e tampão PBS pH 7,4 3 vezes por 3 minutos cada;
e-) bloqueio de sítios inespecíficos: as lâminas foram incubadas em PBS pH 7,4+BSA (Soro Albumina Bovina) 1% por 30 minutos em temperatura ambiente;
f-) ligação com anticorpo primário: os cortes histológicos de cada lâmina foram incubados com anticorpo primário, diluídos em PBS+BSA 1% em titulação pré-estabelecida pelo fornecedor e deixadas em câmara úmida a 4ºC de 16 a 18 horas e na seqüência foram lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes;
17 foram lavadas em PBS pH 7,4 por 3 vezes e novamente incubação com o Kit de amplificação (estreptavidina conjugada com peroxidase) Dako por 30 minutos e em seguida foram lavadas com tampão PBS, pH 7,4 por três vezes);
h-) revelação: os cortes foram cobertos com solução de cromógeno 3,3’diaminobenzidina (DAB líquido);
i-) contracoloração: os cortes foram lavados em água corrente por 5 minutos e em seguida contracorados com hematoxilina de Harris por 20 segundos;
j-) desidratação e montagem: as lâminas foram lavadas em água corrente por 10 minutos, submersas em etanol absoluto 4 vezes e a seguir em xilol por 3 vezes e levadas para montagem com lamínula e em meio de montagem Entelan ® e identificadas.
Adotou-se como padrão de positividade o aparecimento de coloração marrom acastanhada no núcleo, na região da matriz extracelular, na região do limite celular ou no citoplasma da célula. A imunoexpressão foi avaliada, utilizando-se representação de imagem por meio de um sistema computadorizado, constituído por microscópio de luz (Carl Zeiss), adaptado a uma câmera de alta resolução (Axio Cam MRC da Carl Zeiss), monitor de vídeo colorido (Samsung). As imagens obtidas utilizando-se o programa de análise de imagens AxionVision REL 4.2 da Carl Zeiss.
Para a análise do VEGF e da Caspase-3 foram avaliados as células ou núcleos positivos em 1000 células por animal em cada região da adrenal.
MÉTODO ESTATÍSTICO
Usamos o teste de Análise de Variância (ANOVA), seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey para a análise das variáveis (NETTER et al.,
18
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MORFOLÓGICOS
20 Fig. 2 – Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GI, mostrando: cápsula (C), zona glomerulosa (G) e a zona fasciculada (F). H.E.
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GII - Sham: Os aspectos histológicos da adrenal no Grupo Sham são
semelhantes aos observados no Grupo Controle (GI).
Fig. 4 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GII, mostrando: cápsula (C), zona glomerulosa (G) e a zona fasciculada (F). Estão indicados também os vasos sanguíneos (VS) e espongiócito (ES). H.E.
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GIII - Pinealectomizado: Neste grupo notamos que, macroscopicamente, a adrenal encontra-se bem mais volumosa do que nos Grupos Controle (GI) e Sham (GII). Os aspectos morfológicos são muito parecidos aos já descritos. As zonas glomerulosa e fasciculada são muito semelhantes ao dos grupos anteriores, no entanto, a zona reticular mostra-se muito mais volumosa. Esta última zona está constituída por células epiteliais de formas poligonais, mais volumosas do que nos grupos anteriores, com núcleos volumosos e ricos em eucromatina. Em alguns locais identificamos a presença de áreas mais claras sugerindo imagem negativa de gordura. Há também a presença de capilares dilatados.
23 Fig. 7 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIII, mostrando a zona reticulada (R), onde se pode visualizar as células mais volumosas, vasos sanguíneos (VS) mais dilatados e uma suposta presença de gordura nesta área (ES). Notar também a presença da medula (M). H.E.
24 Fig. 8 - Fotomicrografia da região cortical da adrenal do GIV, mostrando: cápsula (C), zona glomerulosa (G) e a zona fasciculada (F). H.E.
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IMUNOHISTOQUIMICOS
Fator de crescimento Endotelial vascular (VEGF)
Os dados referentes à mensuração do VEGF estão expressos na tabela 2. Na figura 10 estão expressas as fotomicrografias referentes ao VEGF nos vários grupos de estudo.
Tabela 2 – Mensuração das várias camadas da adrenal de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo.
GRUPOS
GI GII GIII GIV
Glomerulosa ++ ++ ++ ++
Fasciculada + + ++ +
Reticulada + + + +
26 Fig. 10– Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade ao VEGF presente no citoplasma (coloração marrom castanho) celular das zonas glomerulosa e fasciculada.
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Caspase - 3 clivada
Os dados referentes à quantificação da caspase 3 clivada estão expressos na tabela 3. Na figura 10 estão expressas as fotomicrografias referentes a Capase 3 clivada nos grupos de estudo.
Tabela 3 – Quantificação (%) da reatividade a Caspase 3 clivada nas várias camadas da adrenal de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo.
GRUPOS
GI GII GIII GIV
Glomerulosa 20,12±2,12 19,50±3,32 21,13±2,11 19,45±3,14 Fasciculada 21,21±2,15 25,22±4,23 15,51±3,12* 25,40±3,21 Reticulada 12,22±2,21 13,41±1,15 8,11±1,90* 9,51±2,15
28 Fig. 12– Fotomicrografias comparativas das adrenais de ratas pertencentes aos vários grupos de estudo mostrando a reatividade da Caspase-3 no citoplasma celular (coloração marrom castanho) nas zonas glomerulosa e fasciculada.
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30 A adrenal, material por nós escolhida para a realização deste trabalho está relacionada com a produção de esteróides sexuais, mostra aumento na espessura das zonas fasciculada e reticulada em ratas em estro permanente, causado pela administração de propionato de testosterona (SILVA et al., 2007; SILVA et al.,
2009). Uma vez que a pinealectomia induz um estado de estro permanente, acreditamos que esta hipertrofia deve ocorrer também nas várias camadas da adrenal.
Para o presente estudo, foi escolhida a rata por ser um animal de pequeno porte, fácil de ser manipulado, dócil, mas com tendência fácil ao estresse, exigindo pouco espaço para alojamento e manuseio, fácil recuperação dos agentes anestésicos com pós-operatório relativamente curto. Além de ter a mesma procedência, ser de fácil disponibilidade e podendo ser obtido através do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais em Medicina e Biologia (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM) todas com a mesma idade, tamanho e pequena variação de peso (LIMA et al., 2005; SILVA et al., 2007; SOARES JR et al., 2003 (b), etc).
Inúmeros trabalhos descrevem a técnica da pinealectomia em ratos, como o de KUSZAK e RODIN (1977), que teve o seu trabalho como base para melhorar a padronização desta técnica, a qual foi por nós utilizada (MAGANHIN et al.,
2009). Mesmo com tais melhoras, que levaram à diminuição da taxa de mortalidade, a cirurgia ainda é um tanto delicada, pois pode acarretar na remoção não só da pineal como também de fragmentos do encéfalo da rata. O inverso também pode ocorrer, tendo partes da pineal retirada, mas ainda restando fragmentos que poderiam produzir melatonina, em níveis muito pequenos, mas mesmo assim levando a um falso resultado.
Em outros estudos, como os de EVÊNCIO-NETO et al. (2001), foi utilizado
o frasco âmbar como recipiente para administrar a solução de melatonina nas ratas. No nosso estudo, os frascos âmbar foram ainda envoltos por papel alumínio, para nos certificar de que não haveria a entrada de nenhum tipo de luz, pois a melatonina é fotossensível, sendo rapidamente degradada. Isso somado ao fato de que as ratas ficavam em biotério fechado, com luz controlada por um timer,
31 Nossos resultados morfológicos mostraram que não houve alterações em todas as zonas da cortical da adrenal. A zona glomerulosa permaneceu com a mesma configuração nos quatro grupos estudados.
A zona fasciculada teve poucas alterações na sua morfologia, cabendo a zona reticulada ter uma acentuada mudança. O grupo pinealectomizado (GIII) teve as células da zona reticulada com núcleos mais volumosos e ricos em eurocromatina, o que indica haver maior atividade celular. O mesmo grupo também apresentou, macroscopicamente, uma adrenal maior quando comparada aos outros grupos. Esses dados têm respaldo no tocante à hipertrofia da adrenal, sendo encontrados nos estudos de LIMA et al. (2002) em pinealectomia de ratos.
No entanto, a zona que mais se hipertrofiou nesse estudo, assim como no de DEFRONZO e ROTH (1972) foi à zona fasciculada, onde houve aumento das taxas de RNA e DNA nas células do córtex da adrenal de ratas submetidas à pinealectomia, havendo a reversão deste quadro quando a melatonina exógena foi administrada. Outro estudo, MILOVANOVIĆ et al. (2003) também mostraram haver aumento no diâmetro e no volume das células da zona fasciculada após injetar etanol intraperitonealmente em ratas não pinealectomizadas. Já MENDONÇA et al. (2002) mostraram que, deixar as ratas na ausência de luz por
um período de 15 dias, induz aumento no número de células da zona fasciculada, mas não leva a um aumento no tamanho macroscópico da adrenal. Estes últimos sugerem que ocorre um aumento na produção da melatonina pela pineal, o que leva a uma proliferação celular na zona fasciculada.
Em nosso estudo, o grupo das ratas pinealectomizadas, mas com administração de melatonina (GIV), tiveram os efeitos revertidos, ou seja, assemelhando-se novamente ao grupo controle (GI) e Sham (GII).
Os resultados de apoptose usando a Caspase-3 clivada mostraram que a ausência de melatonina reduz a taxa de apoptose nas zonas fasciculadas e reticulada, o que pode justificar o aumento macroscópico da adrenal como um todo. Já o tratamento com melatonina reverte ao normal os níveis de apoptose na zona fasciculada nos animais pinealectomizados.
32 uma queda no seu índice de apoptose no grupo pinealectomizado (GIII) sem tratamento com melatonina, tal queda foi revertida no grupo pinealectomizado com melatonina (GIV).
A zona reticulada é a que teve o menor índice apoptótico no grupo de ratas pinealectomizadas (GIII), tal quadro, teve pouca melhora quando se administrou a melatonina após pinealectomia (GIV). Este dado também é conflitante com os achados por outros autores. EVÊNCIO-NETO et al. (2001) observaram através do
método de TUNEL que só a zona reticulada apresentou células imunopositivas.
Também foi observado que, nos animais pinealectomizados, com seis meses de pós-operatório, o número de células em apoptose foi maior que nos outros grupos. O mesmo pode ser encontrado em um estudo mais antigo. CARSIA et al. (1996),
que estudou apoptose na região cortical da adrenal de ratas hipofisectomizadas, também observaram células em apoptose quase exclusivamente na zona reticulada, sugerindo que o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) seria o único hormônio pituitário capaz de bloquear a apoptose nas células da região cortical.
Com relação ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), a zona glomerulosa, mais uma vez, não teve alterações significantes em nenhum dos grupos estudados. A maior diferença entre os grupos foi observada na zona fasciculada do grupo pinealectomizado (GIII). Nela o VEGF ficou mais expresso quando comparado aos outros grupos. Tal quadro foi revertido no grupo pinealectomizado com melatonina (GIV) onde a expressão voltou a ficar semelhante com a dos grupos controle (GI) e Sham (GII).
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34 Nossos resultados permitem-nos concluir que ratas pinealectomizadas e tratadas com melatonina, que:
1 – A pinealectomia leva a um aumento das adrenais, em especial nos núcleo sdas célulasa presentes zona reticulada, no entanto, a administração de melatonina reverte esse quadro;
2 - A pinealectomia diminui o índice de apoptose nas zonas fasciculada e reticulada, sendo que a melatonina exógena reverteu esse efeito somente na zona fasciculada;
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