I MPLEMENTAÇÃO DO MÉTODO PARA LC MS

Inicialmente, na avaliação das condições cromatográficas para o LC-MS, optou-se por uma coluna com fase C18, por ser muito citada na literatura na pesquisa de substâncias anfetamínicas (Tabela 4.23).

Tabela 4.23. Publicações que utilizaram coluna cromatográfica C18 em diferentes matrizes para pesquisa de anfetamínicos associada a abuso de substâncias psicoativas e a doping desportivo.

MATRIZ EQUIPAMENTO REFERÊNCIA

Urina LC-MS/MS (triplo quadrupolo) Dikunets et al., 2009. UPLC-MS/MS (triplo quadrupolo) Fernández et al., 2010.

LC-MS/MS (quadrupolo-íon trap) Dowling et al., 2010. UPLC-MS/MS (triplo quadrupolo-íon

trap) Chiuminatto et al., 2010

LC-MS/MS (triplo-quadrupolo) Hsu et al., 2011 LC-MS/MS (triplo quadrupolo) Lin et al., 2013.

UHPLC-MS (orbtrap) Musenga & Cowan, 2013. LC-MS/MS (íon-trap) Deventer et al., 2016. Esgoto LC-MS/MS (triplo quadrupolo) Gonzales-Mariño et al., 2009.

LC-MS/MS (orbitrap) Emke et al., 2014. LC-MS/MS (triplo-quadrupolo) Senta et al., 2015.

Cabelo UPLC-MS (TOF) Nielsen et al., 2010.

LC-MS/MS (orbitrap) Miyaguchi & Inoue, 2011. LC-MS/MS (triplo quadrupolo) Chang et al., 2014.

HPLC-DF Argente-García et al., 2016a Argente-García et al., 2016b. Sangue LC-MS/MS/MS (triplo quadrupolo-íon

trap) Cesari et al., 2010.

UPLC-MS/MS (triplo quadrupolo) Bjørk et al., 2013. Plasma LC-MS/MS (Ion-trap) Vlase et al., 2009. Saliva LC-MS/MS (triplo quadrupolo) Concheiro et al., 2008. Plasma e saliva LC-MS/MS (triplo quadrupolo-íon trap) Newmeyer et al., 2014.

CONTINUAÇÃO

Saliva e suor LC-MS/MS (triplo quadrupolo) Samyn et al., 2002. Urina, sangue e cabelo LC-MS/MS (triplo quadrupolo) Chèze et al., 2007. Sangue e mancha de sangue seco LC-MS/MS (quadrupolo-hexapolo-

quadrupolo) Saussereau et al., 2012. Urina e sangue UPLC-MS/MS (triplo quadrupolo) Berg et al., 2014. Sangue venoso e cardíaco, bile,

conteúdo estomacal, fígado, rim, baço, pâncreas, pulmão, musculo cardíaco e esquelético

Nas condições descritas em 3.2.2 e 3.2.3 avaliou-se as fases móveis aquosas para cada condição de pH, com base nos sinais dos íons M+1/z dos analitos e padrões deuterados. Os resultados estão ilustrados na Figura 4.10.

Figura 4.10. (A) Gráfico das áreas médias absolutas de 4 injeções de padrões a 25 µg L-1 em metanol/água (1:1): (A) apenas com as anfetaminas; (B) incluindo a famprofasona.

Considerando a média das áreas absolutas, o pH 3 ajustado com ácido fórmico oferece maior resposta para as anfetaminas e metanfetaminas (Figura 4.10, Gráfico A). Como a famprofasona apresentou áreas médias absolutas bem superiores em relação às anfetaminas em todos os pH (Figura 4.10, Gráfico B), optou-se por privilegiar analitos de menor resposta, e uma fase móvel de preparo mais simples e rápido, ou seja, pH 3, com ácido fórmico a aproximadamente 0,015 %. 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 Á R E A

ANFET ANFET-D5 METANFET METANFET-D5 pH 3 (ácido) pH 3 (tampão) pH 4 pH 5 pH 6 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 Á R E A

ANFET ANFET-D5 METANFET METANFET-D5 FAMPROF pH 3 (ácido) pH 3 (tampão) pH 4 pH 5 pH 6 A B

Na Tabela 4.24 estão listados o tempo de retenção médio em cada condição de pH, onde pode-se observar que a famprofasona sofreu maior influência na mudança de pH de 3 para 4.

Tabela 4.24. Tempo de retenção em minutos (média ± σ) em cada condição de pH (n=4)

pH Anfetamina Anfetamina- D5 Metanfetamina Metanfetamina- D5 Famprofasona 3 (ácido) 2,92 ± 0,11 2,91 ± 0,11 3,18 ± 0,09 3,18 ± 0,09 6,94 ± 0,04 3 (tampão) 2,95 ± 0,02 2,94 ± 0,02 3,20 ± 0,01 3,19 ± 0,01 7,57 ± 0,01 4 2,98 ± 0,01 2,97 ± 0,01 3,22 ± 0,01 3,22 ± 0,01 10,12 ± 0,01 5 3,10 ±0,07 3,09 ± 0,06 3,36 ±0,04 3,34 ± 0,05 10,27 ± 0,01 6 3,18 ± 0,04 3,16 ± 0,05 3,46 ±0,03 3,45 ± 0,04 10,31 ± 0,02

Ao considerar-se que, não foram encontrados na literatura valores experimentais para o pKa da famprofasona e, que o valor disponível (10,28) é um valor calculado (EBML-EBI, 2016), a mudança de no tempo de retenção, que foi observada, indica que, possivelmente, houve mudança na ionização, talvez por conta da desprotonação de um dos nitrogênios da molécula da famprofasona. A estrutura da famprofasona (Figura 4.11) possui três nitrogênios, sendo que um possivelmente tem o seu par de elétrons comprometido com a ressonância da carbonila. Portanto, há uma possibilidade do valor calculado do pKa para a famprofasona não estar de acordo com o valor pKa real da molécula.

Figura 4.11. Estrutura da famprofasona.

Buscando redução no tempo de corrida de 15 para 12 min, o gradiente descrito em 3.2.5 foi alterado, elevando a inclinação da rampa do gradiente (Figura 4.12).

Figura 4.12. Perfil cromatográfico dos analitos a 25 µg L-1, nas condições cromatográficas descritas em 3.2.4.

As novas condições aceleraram o tempo de retenção da famprofasona, sendo portanto, consideradas satisfatórias para os estudos posteriores.

Os parâmetros de trabalho estabelecidos para o espectrômetro de massa foram: spray voltage de 4500 V; fluxo do “sheath gas” de 35 (anfetamina e metanfetamina) e 30 (famprofazona) e do auxiliary gas de 20; capillary temperature de 300 ºC. As energias de colisão otimizadas para espectrometria sequencial (MS/MS) para os íons de quantificação foram: 28 para anfetamina (m/z 119), 25 para metanfetamina (m/z 119) e 28 para a famprofasona (m/z 162).

Quando foram aplicadas as condições de operação para o LC-MS/MS, observou-se que a metanfetamina-D5 produzia o íon m/z 91. Isso representa uma ação interferente do padrão interno no analito, já que esse íon é o qualificador do analito (Figura 4.13).

Anfetamina m/z=136 Anfetamina-D5 m/z=141 Metanfetamina m/z=150 Metanfetamina-D5 m/z=155 Famprofasona m/z=378

Figura 4.13. Cromatograma nas condições do LC-MS/MS, de anfetamina-D5 e metanfetamina- D5 na concentração de 250 µg L-1. (1) Filtro do fragmento de massa 119 (quantificador de anfetamina e metanfetamina) que se encontra ausente conforme o esperado; (2) filtro do fragmento massa 91 (qualificador de anfetamina e metanfetamina), que se esperava ausente, mas aparece no tempo de retenção da metanfetamina-D5; (3) fragmento 124, quantificador da anfetamina-D5; (4) fragmento 121, quantificador da Metanfetamina-D5; (5) fragmento 92, qualificador da Anfetamina-D5 (menor intensidade) e da Metanfetamina-D5 (maior intensidade).

Na Figura 4.13, pode-se observar que não há fragmento 119, quantificador de anfetamina e de metanfetamina, que poderia ser gerado se o padrão tivesse espécies não deuteradas. Na literatura há citações que indicam que os padrões deuterados apresentam comportamentos inesperados que pode comprometer a precisão na quantificação do analito (CHAVEZ-ENG et al., 2002; EECKHAUT et al. 2009; BERG et al., 2014; REEDY, 2017). Wang et al. (2007) em seu estudo, reportaram uma permuta de deutério do padrão interno com o hidrogênio da água na presença de solvente. Possivelmente foi o que aconteceu com a metanfetamina-D5, produzindo o fragmento 91 nas condições de trabalho do equipamento, pois não se observou metanfetamina não deuterada no padrão interno como impureza no modo LC- MS. 1 2 3 4 5

Como o íon 91 é o íon qualificador para a metanfetamina, sua superestimação afetaria a razão entre os íons (quantificador/qualificador), que é um dos critérios de identificação da molécula. Por conseguinte, a espectrometria de massa em tandem não foi aplicada nos ensaios posteriores, além disso, considerando que o procedimento tem por objetivo ser aplicado em amostras de suínos sob condições controladas, não haveria prejuízo no estudo.