No contexto social alguns fármacos podem ser utilizados com propósito não- terapêutico, normalmente por autoadministração e com intenção recreacional. A maioria exerce efeitos psicoativos que prejudicam a atenção e o julgamento, aumentando o risco de acidentes (STARK & NORFOLK, 2005; WALL & KACH, 2005). No estudo de Zancanaro e col. (2012), avaliando a saliva de 2235 motoristas de 26 estados, coletadas em rodovias federais brasileiras num período de 24 h, os resultados positivos para alguma droga de abuso ficaram próximos a 10% das amostras. Das amostras positivas, 29,2% estavam associadas a anfetaminas e seus
metabólitos. Nesse contexto as anfetaminas demandam atenção, pois são consideradas potentes estimulantes do sistema nervoso central (DE LA TORRE et al., 2004).
Denomina-se anfetaminas e derivados anfetamínicos substâncias que apresentam uma estrutura de feniletilamina substituída (Figura 1.5).
Feniletilamina
EXEMPLOS
Figura 1.5. Estrutura da Feniletilamina e alguns exemplos de estruturas anfetamínicas. AMPH: anfetamina; METH: metanfetamina e MDMA: metilenodioximetanfetamina.
A anfetamina e a metanfetamina apresentam um alto potencial para liberar monoaminas endógenas (principalmente dopamina), produzindo alterações no humor. A maioria dos efeitos envolvem motivação, prazer e ação motora, que estão associados à dopamina. A metanfetamina é mais lipossolúvel que a anfetamina, portanto penetra mais facilmente através da barreia hematoencefálica e persiste mais tempo no SNC (LOGAN, 2002; DE LA TORRE et al., 2004; CRUICKSHANK & DYER, 2009).
Os efeitos agudos dessas substâncias estão associados a: estado de alerta, euforia, aumento da libido, redução do sono, do apetite e da fadiga. Em altas doses os efeitos somáticos costumam ser: aumento da pressão sanguínea, arritmias cardíacas, tremores musculares e elevação da temperatura (RANG et al., 1997; DIAS et al., 2001; CRUICKSHANK & DYER, 2009).
São substâncias de caráter básico com pKa com valores de 9,9 e 10,1, para a anfetamina e metanfetamina, respectivamente. A eliminação dessas substâncias é fortemente dependente do pH urinário, sendo maior quanto mais ácida estiver a urina (MUSSHOFF, 2000; DIAS et al., 2001).
Diferentemente do caráter recreativo do uso da anfetamina e metanfetamina, a famprofasona (Figura 1.6) é uma substância com propriedades antipirética e analgésica
produzida pela Ed. Geistlich Söhne AG, Wolhusen na Suíça; porém também possui algumas propriedades simpaticomiméticas leves. É um compomente do medicamento Gewodin, e cada comprimido contém 25 mg de famprofasona, 250 mg de paracetamol (acetaminofeno), 75 mg de isopropilfenazona e 30 mg de cafeína. É recomendado para dor de cabeça, enxaqueca, dor de dente, dor associada ao reumatismo, etc. (MUSSHOFF, 2000; GREENHILL et al., 2003; RODRIGUEZ et al., 2004).
Figura 1.6. Estrutura da famprofasona (EMBL-EBI, 2016).
A famprofasona é, entretanto, biotransformada principalmente a metanfetamina e anfetamina após o uso (Figura 1.7), o que tem demonstrado ser a causa de testes positivos para essas drogas na urina (TSEN et al., 2007; CHAN et al., 2010).
Figura 1.7. Esquema do metabolismo da famprofasona (adaptado de RODRIGUEZ et al., 2004).
No presente estudo, focado no desenvolvimento de metodologia analítica para determinação de anfetamina e metanfetamina em sangue e fígado, optou-se por não administrar esses fármacos aos animais por questões de dificuldade de aquisição, visto serem substâncias
proscritas (Portaria SVS/MS nº. 344, de 12 de maio de 1998), e de alto custo de importação. A famprofazona, por outro lado, é um fármaco de venda livre que, ao sofrer biotransformação, produz as anfetaminas de interesse, e no presente estudo foi a escolha para contornar as questões aquisição e administração aos animais de substâncias ilícitas.
1.4.DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALITICA: PRE-TRATAMENTO DE AMOSTRAS
Nas últimas décadas houve muitos avanços tecnológicos em instrumentação e técnicas para preparo de amostras. Entre as técnicas analíticas modernas, a cromatografia líquida associada à espectrometria de massa (LC-MS) é considerada como referência para a pesquisa qualitativa/quantitativa, conferindo especificidade, sensibilidade e velocidade às análises (CHEN et al., 2008; KOLE et al., 2011).
No caso de uma matriz semirrígida, a primeira etapa do preparo é o aumento da superfície de contato com o solvente extrator, alcançado por meios mecânicos (trituração ou moagem), sendo usual o emprego de homogeneizadores de tecidos (OSSELTON et al., 1978; POSYNIAK et al., 2001; BERRADA et al., 2007; CHEN et al., 2008; SHEN et al., 2009; CRUM et al., 2013; HASEGAWA et al., 2015). Estes equipamentos exigem uma descontaminação química entre uma amostra e outra, portanto envolvem processos lentos e passíveis de contaminações cruzadas quando não realizados adequadamente.
Métodos que incluem a digestão enzimática, onde o tecido picado sofre ação de uma ou mais enzimas, têm apresentado resultados promissores (OSSELTON et al., 1978; POSYNIAK et al., 2001; YU et al., 2004; BERMEJO et al., 2004). Esses procedimentos tornam a matriz mais fluida, sem o risco de contaminação cruzada quando se usa homogeneizadores de tecidos. Porém, a escolha das enzimas para esta etapa deve ser cuidadosa, pois a digestão pode gerar mais artefatos no meio, que poderão interferir na técnica analítica escolhida (KELLER et al., 2008).
Os componentes da matriz biológica geram o chamado efeito de matriz, provocados usualmente por proteínas, lipídeos, açúcares ou sais, e podem afetar a técnica analítica adotada, como por exemplo na cromatografia, co-eluindo com os analitos, interferindo na ionização (KAUFMANN et al., 2008; MARCHI et al., 2007). Isto significa que uma amostra carregada de muitos componentes de sua matriz pode invalidar todo o ensaio (EECKHAUT et al., 2009).
Por conseguinte, o pre-tratamento visa minimizar a complexidade da amostra e eliminar a maioria das interferências da matriz antes da injeção no instrumento analítico, para facilitar a
separação dos analitos, antes de serem introduzidos no detector (REJCZAK & TUZIMSKI, 2015; FUMES et al., 2015).
O preparo da amostra é, portanto, a etapa na qual é mais provável a ocorrência de problemas e dificuldades (por exemplo, consumo de tempo, custo, contaminação, pouca reprodutibilidade e baixos rendimentos de extração) (REJCZAK & TUZIMSKI, 2015; FUMES et al., 2015). Além disso, o pre-tratamento pode levar até 80% do tempo total de um processo analítico, que normalmente inclui etapas como amostragem, preparação de amostras e separação (CHEN et al., 2008).
Outro procedimento de pre-tratamento envolve a desproteinização, que consiste em aplicar um agente que promova a precipitação das proteínas. A precipitação proteica através da adição de sais ou ácidos costuma minimizar o efeito de matriz (STIMPFL & VYCUDILIK, 2004). No geral, é considerada uma técnica muito eficaz usada para a recuperação de analitos de matrizes biológicas, porque ela pode atuar nos locais de ligação da proteína, deslocando a substância mesmo em alta interação de proteína (WELLS, 2003).
A extração direta é um procedimento utilizado, tanto para sangue como para tecidos semirrígidos. Esse procedimento consiste no contado direto do solvente de extração com a amostra, em geral em meio tamponado, sendo necessário às vezes uma re-extração antes de um procedimento de clean-up (KOVES & WELLS, 1992; DRUMMER & GEROSTAMOULOS, 2002). A extração em fase sólida (SPE) permite que extração e clean-up ocorram em um mesmo dispositivo, ao mesmo tempo que promove a concentração da amostra (BERENDSEN et al., 2013; HERNÁNDEZ-MESA et al., 2014).
Considerando a necessidade de metodologias de pre-tratamento para amostras de origem biológica, especialmente quando se emprega LC-MS, conhecida como uma técnica sensível de análise (YU et al., 2004), este trabalho consistiu:
(1) Na otimização dos processos de dispersão enzimática e desproteinização, para obtenção de um resíduo limpo, com teor substancial dos analitos;
(2) Na prevenção de contaminação cruzada de amostras, por meio do desenvolvimento de um método que permita a desagregação do tecido em tubos individuais e descartáveis e que permita uma eventual automação;
(3) No emprego de pequenas quantidades de amostra de fígado (≤ 1 g), permitindo a aplicação do método na análise de material fetal.
(5) Na utilização da LC-MS para doseamento da famprofasona, anfetamina e metanfetamina em amostras de fígado e sangue.
O método desenvolvido e validado foi aplicado em amostras reais, coletadas de suínos após a administração da famprofasona em doses (mg/kg peso) semelhantes às utilizadas em seres humanos.