Na cápsula

a) escores de imunomarcação: ao analisarmos os escores de imunomarcação, observamos que não houve diferença estatisticamente significativa entre as expressões de IFN- e TGF- 1 na cápsula dos CR (p=0,735) (Tabela 9);

b) percentuais de células imunopositivas: ao analisarmos os percentuais de células imunopositivas, observamos que não houve diferença estatisticamente significativa entre as expressões de IFN- e TGF- 1 na cápsula dos CR (p=0,370) (Tabela 9).

5.4.4 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 no epitélio e na cápsula dos CD (teste de Wilcoxon)

5.4.4.1 No epitélio

O teste estatístico de Wilcoxon revelou que não houve diferença estatisticamente significativa entre as expressões dos biomarcadores IFN- e TGF- 1 no epitélio dos CD (p=0,361) (Tabela 8).

5.4.4.2 Na cápsula

a) escores de imunomarcação: ao analisarmos os escores de imunomarcação, observamos que houve diferença estatisticamente significativa entre as expressões de IFN- e TGF- 1 na cápsula dos CD (p=0,018) (Tabela 9).

b) percentuais de células imunopositivas: ao analisarmos os percentuais de células imunopositivas, observamos que houve diferença estatisticamente significativa entre as expressões de IFN- e TGF- 1 na cápsula dos CD (p=0,001) (Tabela 9).

Tabela 8 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF- 1 nos epitélios dos CR e CD. Natal, RN - 2012.

Lesão Biomarcador Média* p**

CR IFN- 2,85 0,225

TGF- 1 2,7

CD IFN- 2,7 0,361

TGF- 1 2,8

*Média dos escores de imunomarcação **Teste de Wilcoxon

Tabela 9 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF- 1 nas cápsulas dos CR e CD, considerando-se as avaliações tanto através dos escores de imunomarcação (E) como através dos percentuais de células imunopositivas (P). Natal, RN - 2012.

Lesão Biomarcador Média* p**

CR IFN- E 2,75 0,735 TGF- 1E 2,8 IFN- P 79% 0,370 TGF- 1P 82% CD IFN- E 2,6 0,018 TGF- 1E 2,95 IFN- P 77% 0,001 TGF- 1P 90%

Legenda: IFN- E: avaliação do IFN- através dos seus escores de imunomarcação; TGF- 1E: avaliação do TGF- 1

através dos seus escores de imunomarcação; IFN- P: avaliação do IFN- através dos seus percentuais de células imunopositivas; TGF- 1P: avaliação do TGF- 1 através dos seus percentuais de células imunopositivas. *Média dos

6 DISCUSSÃO

Vários estudos buscam avaliar a participação de citocinas no processo de patogênese e desenvolvimento de cistos odontogênicos procurando relacionar seu crescimento, que é acompanhado pelo processo de reabsorção óssea, a atuação de citocinas inflamatórias que apresentam atividades osteorreabsortivas. Além disso, muitos deles procuram avaliar também a ocorrência de citocinas que desempenham um papel reparador do processo destrutivo ocasionado pela reação inflamatória na região periapical.

Sob esta perspectiva, muitas pesquisas têm utilizado o CR como objeto de investigação dessas citocinas, uma vez que é bem conhecido seu potencial destrutivo sobre os ossos gnáticos, e sua redução em tamanho ou mesmo completa regressão algumas vezes ocorrida após tratamentos endodônticos, sugerem a participação de citocinas que atuem sobre os processos reparadores dos tecidos periapicais (MORAES et al., 2011; MARÇAL et al., 2010; TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; HREN E IHAN, 2009; FUKADA et al., 2009; HAYASHI et al., 2008; MENEZES et al., 2006; KUSAFUKA et al., 2006; WALKER et al., 2000; DANIN et al., 2000; TYLER et al., 1999). Por outro lado, o CD tem sido utilizado apenas em escassos estudos de investigação dessas citocinas (PIATELLI et al., 2004; LI, BROWNE, MATTHEWS, 1997).

O contínuo fluxo de bactérias e seus produtos a partir de um canal radicular infectado provoca uma resposta imuno-inflamatória periapical, com a intenção de combater a disseminação microbiana. Essa resposta promove a síntese de inúmeras citocinas e fatores de crescimento que provocam a proliferação dos restos epiteliais de Malassez e a formação dos cistos radiculares. Os eventos imuno-inflamatórios relacionados à proliferação desses restos epiteliais concomitantemente induzem a secreção de fatores de reabsorção óssea (MORAES et al., 2011; HREN E IHAN, 2009; MENEZES et al., 2006; WALKER et al., 2000). A reação imuno- inflamatória nas lesões periapicais como o CR provoca a ativação da resposta imunológica Th1, caracterizada pela produção de citocinas pró-inflamatórias como IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-2 e IL- 12, e da resposta Th2, caracterizada pela síntese de citocinas anti-inflamatórias como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Além dessas citocinas, observa-se também a presença de fatores de crescimento como o TGF- . As respostas Th1 e Th2 apresentam atividades opostas entre si, e, no contexto das lesões periapicais, acredita-se que a resposta imunológica Th1 está relacionada com a progressão e o processo de reabsorção óssea da lesão, enquanto que a ação imunossupressora

do TGF- e das citocinas Th2 são de grande importância na modulação da resposta imuno- inflamatória e no processo de reparação do tecido ósseo lesado (STASHENKO et al., 2007; COLIC et al., 2006; TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; GAZIVODA et al., 2009; WALKER et al., 2000).

Kawashima e Stashenko (1999), avaliando lesões periapicais induzidas experimentalmente em ratos, observaram um aumento na expressão das citocinas Th1 (IL-2, IL- 12 e IFN-γ) durante todo o período estabelecido para a avaliação da progressão das lesões, enquanto que, apesar de ter havido um aumento da expressão das citocinas Th2 (IL-4 e IL-10), durante os últimos dias houve uma queda dessa expressão, o que levou os autores a conclusão de que a resposta imunológica Th1 deve predominar durante o processo de crescimento e reabsorção óssea nas lesões periapicais. Por sua vez, Teixeira-Salum et al. (2010), avaliando os níveis de IFN-γ, TNF-α, IL-4 e TGF- em cistos radiculares e granulomas periapicais, observaram que os cistos apresentaram maiores níveis de IFN-γ, TNF-α e IL-4, enquanto que os granulomas expressaram mais TGF- . Eles concluíram que os cistos radiculares apresentaram reações imunológicas Th1 e Th2 que se modulam reciprocamente (pois as lesões positivas para IL-4 eram negativas para IFN-γ e TNF-α), e que os granulomas, devido ao seu alto nível de TGF- , consistiam em um ambiente com atividades regulatórias (reparadoras). Além disso, eles sugeriram um papel osteorreabsortivo para o IFN-γ e TNF-α nessas lesões. Gazivoda et al. (2009), em um experimento in vitro, adicionaram IL-10 e TGF- a culturas de células inflamatórias de lesões periapicais e avaliaram a síntese de citocinas pró-inflamatórias. Eles mostraram que tanto o IL-10 como TGF- foram capazes de inibir a produção de IL-1, TNF-α e IL-8, porém o TGF- foi o que apresentou maior poder imunossupressor. Walker et al. (2000), investigando a expressão de citocinas pró e anti-inflamatória em cistos e granulomas periapicais, observaram que as células que expressavam IL-4 e IL-6 eram muito mais numerosas do que as que expressavam IL-2 ou IFN-γ. Eles encontraram, portanto, um maior número de células Th2 nas lesões estudadas e sugeriram que a presença de mecanismos anti-inflamatórios deva ser crucial para a resolução dessas lesões após a realização de tratamentos apropriados.

Muitos estudos têm relacionado o IFN-γ, que é a principal citocina produzida nas respostas imunológicas Th1, ao processo de reabsorção óssea nas lesões periapicais inflamatórias, enquanto que muitos outros têm associado o TGF- 1 a mecanismos imunorregulatórios de inibição da resposta Th1 e a processos de reparação das lesões periapicais (TEIXEIRA-SALUM

et al., 2010; STASHENKO et al., 2007; GAO et al., 2007; DANIN et al., 2000; TYLER et al., 1999). Portanto, sugere-se que a presença dessas duas citocinas em cistos odontogênicos indicaria a ocorrência de processos tanto favoráveis como desfavoráveis ao crescimento cístico, a saber, as ações osteorreabsortivas do IFN-γ, que seriam contrabalanceadas pela atuação osteoprotetora do TGF- 1, atuando na modulação da intensidade da reação inflamatória e nos processos de reparação da destruição óssea.

Apesar da vasta quantidade de estudos feitos a respeito do papel do IFN-γ no metabolismo ósseo, os resultados ainda são controversos, uma vez que em muitos trabalhos essa citocina tem revelado um papel inibidor da reabsorção óssea, enquanto que em outros ela tem mostrado um comportamento osteorreabsortivo. A ação inibitória do IFN-γ tem sido relacionada por muitos autores ao fato dele induzir a rápida degradação da TRAF6 nas células precursoras de osteoclastos, resultando em forte inibição das vias de sinalização NF-κB e JNK, essenciais para a síntese de genes da diferenciação osteoclástica (TAKAYANAGI, KIM, TANIGUCHI, 2002). De fato muitos trabalhos têm associado o IFN-γ a uma ação anti-osteoclastogênica (Ji et al., 2009; MERMUT et al., 2007; HUANG, O’KEEFE, SCHWARZ, 2003), porém muitas investigações têm atribuído a ele um potencial osteorreabsortivo em várias doenças inflamatórias. Kotake et al. (2005), aventando a hipótese de que células T produtoras de IFN-γ inibiriam a osteoclastogênese, cultivaram células T IFN-γ+ juntamente com monócitos precursores de osteoclastos oriundos de uma lesão inflamatória (artritre reumatóide). Eles observaram a diferenciação osteoclástica dos monócitos, assim como uma expressão aumentada de RANKL pelas células T IFN-γ+ , e concluíram que, ao contrário do que esperavam, as células T produtoras de IFN-γ induziram a osteoclastogênese através da expressão de RANKL. Teng et al. (2005) em seus experimentos, propuseram que o IFN-γ modularia positivamente a osteoclastogênese mediada por RANKL durante a progressão da doença periodontal induzida por A. actinomycetemcomitans em ratos e humanos. Eles observaram em todos os seus experimentos que houve uma expressão simultânea de IFN-γ e RANKL nas células T reativas ao microorganismo e sugeriram que a osteoclastogênese mediada pelo RANKL é modulada positivamente pelo IFN-γ. Por sua vez, Gao et al. (2007), investigando, em experimentos in vivo utilizando roedores, as ações contraditórias do IFN-γ sobre o tecido ósseo, constataram que ele apresenta o potencial tanto de inibir diretamente a diferenciação osteoclástica, por meio de uma atuação direta sobre as células precursoras de osteoclastos (através da degradação da TRAF6), como de promover a

osteoclastogênese indiretamente, através da estimulação da apresentação de antígenos pelos macrófagos e consequente ativação de linfócitos T para produzirem os fatores osteoclastogênicos RANKL e TNF-α, uma vez que o IFN- γ é o indutor fisiológico do MHC classe II nas células apresentadoras de antígeno. Eles concluíram que o efeito final do IFN-γ sobre o tecido ósseo se deve ao desequilíbrio entre suas ações osteoprotetora e osteorreabsortiva, que, sob condições inflamatórias e infecciosas, é favorável a reabsorção óssea. Portanto, pode-se inferir que o RANKL produzido nesses estudos seria o responsável pela diferenciação osteoclástica observada, e não o IFN-γ por si só, uma vez que, segundo Huang, O’Keefe e Schwarz (2003), quando o RANKL atua sobre as células precursoras de osteoclastos, as torna resistentes ao efeito inibitório do IFN-γ, por induzir diferenciação terminal dessas células em osteoclastos. Além disso, sabe-se que o IFN-γ é um potente estimulador de macrófagos na secreção de IL-1 e TNF-α, duas citocinas relacionadas com a destruição óssea periapical (GAZIVODA et al., 2009).

Diante do exposto, pode-se inferir que a presença do IFN-γ nos cistos odontogênicos sugere uma ação osteorreabsortiva dessa citocina, fundamental para o processo de crescimento desses cistos. Vários estudos têm observado sua ocorrência em CR, porém nenhum estudo que relatasse sua expressão em CD foi encontrado durante a revisão de literatura deste trabalho. Essa diferença na produção científica sobre o IFN-γ nesses dois cistos talvez se deva a diferença entre as naturezas dos mesmos, que tornaria a investigação dessa citocina pró-inflamatória mais atraente no cisto de natureza inflamatória, ou seja, o CR. Contudo, o fato de que os CD possuem um potencial de crescimento, e que muitos estão relacionados a processos inflamatórios, sugere a participação dessa citocina em seu processo de expansão, o que fundamenta a investigação do IFN-γ nos CD.

Com relação a imunomarcação do IFN-γ neste trabalho, as células marcadas foram principalmente células epiteliais e células inflamatórias como linfócitos, plasmócitos, neutrófilos e células de linhagem monocítico-macrofágica, além de fibroblastos e células endoteliais (Figuras 5, 7, 9 e 11). Os trabalhos na literatura relatam principalmente linfócitos, macrófagos e fibroblastos (KOGA, DUAN, FURUE, 2002; WALKER et al., 2000; HREN E IHAN, 2009). Foi observado ainda um padrão de imunomarcação da matriz extra-celular, o que corrobora com o trabalho de Koga, Duan, Furue (2002).

Os resultados deste trabalho mostraram não haver diferença estatisticamente significativa da imunoexpressão do IFN-γ entre os CR e CD, tanto entre seus epitélios como entre suas

cápsulas, o que sugere que ambos os grupos de lesões neste trabalho possuem o mesmo potencial osteolítico associado a essa citocina (Tabelas 6 e 7). O fato de não ter sido encontrado nenhum trabalho que relatasse a expressão do IFN-γ em cistos dentígeros impossibilitou a comparação desse achado, entre essas duas lesões, com algum outro trabalho parecido. No entanto, alguns trabalhos na literatura comparam a expressão do IFN-γ entre cistos e granulomas periapicais. Dentre estes, tem-se Fukada et al. (2009) que observaram que a expressão de IFN-γ foi semelhante entre cistos radiculares e granulomas periapicais; Teixeira-Salum et al. (2010) que mostraram prevalência de IFN-γ em cistos radiculares em relação a granulomas periapicais; e Ihan Hren e Ihan (2009), que, comparando a resposta inflamatória de cistos radiculares com a de granulomas periapicais (GP) ocasionados por Streptococcus (GP-S) ou por bactérias anaeróbias (GP-A), observaram que a produção de IFN-γ em cistos radiculares é maior que em GP-S, mas é semelhante a de GP-A. Todos esses trabalhos associaram o IFN- γ ao seu poder osteolítico nas lesões.

Da mesma forma que para o IFN-γ, os estudos feitos sobre as ações do TGF- 1 sobre o metabolismo ósseo têm mostrado resultados controversos. Muitos autores têm atribuído a esse fator de crescimento um efeito favorável a osteoblastogênese, e, portanto, indutor da formação óssea (TACHI et al., 2011; ZHOU, 2011; SMITH et al., 2011; RIPAMONT, RODEN, 2010), porém outros têm associado a ele um papel na osteoclastogênese e, portanto, um potencial osteolítico (YASUI et al., 2011; KAWAKATSU et al., 2010; MCGOWAN et al., 2003; FULLER et al., 2000). Porém, apesar desses achados conflitantes, tem sido constatada uma alta expressão de TGF- 1 durante a cicatrização de fraturas ósseas, o que sugere a sua participação no processo de reparo ósseo (SARAHRUDI et al., 2011; JANSSENS et al., 2005; CHO, GERSTENFELD, EINHORN, 2002). Janssens et al. (2005), em uma vasta revisão de literatura sobre o TGF- 1, analisaram 39 pesquisas que investigaram a ação dessa citocina sobre o tecido ósseo, e constataram que a maioria desses trabalhos concluíram que o TGF- 1 promove a cicatrização de fraturas ósseas e formação de osso in vivo. Eles relataram que o TGF- 1 é um fator de crescimento que pode ser considerado para uso como um agente osteogênico no reparo de fraturas ósseas ou na reversão da excessiva reabsorção óssea vista na osteoporose.

Apesar de não se ter encontrado nenhum trabalho que investigasse a ação osteogênica do TGF- 1 em cistos odontogênicos, sugere-se que, de alguma forma, essa ação do TGF- 1 poderia também estar operante durante o processo de expansão desses cistos. No entanto, ele tem sido

implicado no processo de reparo da perda óssea em cistos e granulomas periapicais, e sua importância nesse processo talvez se deva principalmente a sua atividade anti-inflamatória e imunorreguladora, que suprime a resposta imunológica Th1, além de outras ações como indução da angiogênese e síntese de componentes da matriz extra-celular como colágeno I e fibronectina. Somado a isso, alguns estudos têm sugerido que a reabsorção óssea é inibida na presença do TGF- 1 (TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; PIATTELLI et al., 2004; DANIN et al., 2000; TYLER et al., 1999). Portanto, a presença do TGF- 1 nos cistos odontogênicos supõe um mecanismo compensatório através do qual a resposta inflamatória atua na reparação e remodelação do osso lesado (TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; TYLER et al., 1999).

Quanto as células imunomarcadas pelo TGF- 1, este trabalho mostrou positividade de marcação principalmente para células epiteliais e células inflamatórias como linfócitos, plasmócitos, neutrófilos e células da linhagem monocítico-macrofágica, além de fibroblastos e células endoteliais (Figuras 6, 8, 10 e 12), o que corrobora com os achados de outros autores (DANIN et al., 2000; TYLER et al., 1999; LI, BROWNE, MATTHEWS, 1997). Além disso, foi observado um padrão de imunomarcação da matriz extra-celular (Figura 10), o que também foi observados em outros trabalhos (TYLER et al., 1999; LI, BROWNE, MATTHEWS, 1997).

De acordo com os resultados obtidos, não houve diferença estatisticamente significativa da imunoexpressão do TGF- 1 entre os CR e CD, tanto entre seus epitélios como entre suas cápsulas (Tabelas 6 e 7). No entanto, o teste estatístico revelou um p=0,056 quando da comparação dos percentuais de células imunopositivas para TGF- 1 entre as cápsulas dos CR e CD, que, por ser um valor muito próximo ao do nível de significância adotado por este trabalho (5%), pôde ser considerado como suficiente para sugerirmos que há uma tendência de haver maior expressão de TGF- 1 nas cápsulas dos CD, uma vez que a média dos percentuais de células imunopositivas do TGF- 1 nas cápsulas desse grupo de cistos (90%) foi maior que a do grupo dos CR (82%) (Tabela 7). Mesmo não tendo também havido diferença estatisticamente significativa (p=0,429) quando foram analisados os escores de imunomarcação do TGF- 1 nas cápsulas dos CR e CD, essa conclusão foi admitida por considerar-se que a análise de dados feita por meio dos percentuais de células imunopositivas é soberana quando comparada a análise feita por meio dos escores, uma vez que esta última possui menor riqueza de informação (Tabela 7).

Tyler et al. (1999) encontraram TGF- 1 em cistos e granulomas periapicais e atribuíram a ele um papel no processo de reparo da destruição periapical nas duas lesões. Por sua vez, Piattelli

et al. (2004) observaram maior expressão de TGF- 1 em ceratocistos odontogênicos do que em CR e CD, e associaram esse fato ao maior potencial de crescimento dos ceratocistos através da intensa proliferação celular, que seria regulada pelo TGF- 1.

Ainda de acordo com os resultados, não houve diferença estatisticamente significativa entre as imunoexpressões do IFN-γ e do TGF- 1 nem no epitélio nem na cápsula dos CR, o que sugere que a ação inflamatória e osteolítica do IFN-γ é contrabalanceada em igual proporção pela ação anti-inflamatória e reparadora do TGF- 1 neste grupo de lesões (Tabelas 8 e 9). Isto implicaria dizer que ocorre um estado de equilíbrio entre as “forças” osteorreabsortiva e osteoprotetora exercidas pelo CR (referentes a essas duas citocinas) no osso que o circunda, de maneira que a influência dessas citocinas sobre o crescimento ou a diminuição da lesão se encontraria a mercê da sobreposição de uma das forças sobre a outra.

Por sua vez, apesar de não ter havido diferença estatisticamente significativa entre as imunoexpressões do IFN-γ e do TGF- 1 no epitélio dos CD, essa diferença ocorreu na cápsula dessas lesões, o que foi verificado tanto por meio da análise dos escores de imunomarcação (p=0,018), como pela análise dos percentuais de células imunopositivas (p=0,001) (Tabelas 8 e 9). Ao verificarmos as médias dos escores de imunomarcação e as dos percentuais de células imunopositivas dos dois biomarcadores nas cápsulas dos CD, vemos que ambas as médias do TGF- 1 são maiores que as do IFN-γ (Tabela 9). Esses resultados sugerem que os mecanismos anti-inflamatórios, imunorreguladores e reparadores do TGF- 1 estão predominando sobre as ações inflamatórias e osteolíticas do IFN-γ no grupo dos CD. Supõe-se com isto, que o grupo dos CD apresenta um maior potencial reparador, relacionado ao TGF- 1, do que o grupo dos CR.

Teixeira-Salum et al. (2010), avaliando os níveis de IFN-γ, TNF-α, IL-4 e TGF- em cistos radiculares e granulomas periapicais, observaram que os cistos apresentaram maiores níveis de IFN-γ, TNF-α e IL-4, enquanto que os granulomas expressaram maiores níveis de TGF-

e menores de citocinas pró-inflamatórias. Eles concluíram que os cistos radiculares apresentaram reações imunológicas Th1 e Th2 que se modulam reciprocamente (pois as lesões positivas para IL-4 eram negativas para IFN-γ e TNF-α), e que os granulomas, devido ao seu alto nível de TGF- , consistiam em um ambiente com atividades regulatórias. Com isso, eles atribuíram um maior potencial reparador aos granulomas.

Diante dos resultados encontrados neste trabalho, pode-se concluir que tanto os CR como os CD apresentam expressão das citocinas IFN-γ e TGF- 1, o que sugere a participação dessas

proteínas no processo de expansão destes dois tipos de cisto odontogênico. Além disso, pode-se inferir ainda que o fato do grupo dos CD terem apresentado a tendência de exibir maior expressão de TGF- 1 nas suas cápsulas, quando comparado ao grupo dos CR, somado ao fato de que a expressão dessa citocina foi maior do que a do IFN-γ na cápsula dos CD, não havendo diferença entre as expressões do IFN-γ e TGF- 1 no grupo dos CR, sugerem a predominância de mecanismos imunorreguladores e reparadores no grupo dos CD quando comparado ao grupo dos CR.

7 CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que:

1. Não houve diferença estatisticamente significativa da imunoexpressão do IFN- e do TGF- 1 entre os cistos dentígeros e radiculares, considerando-se os epitélios e as cápsulas das referidas lesões;

2. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as imunoexpressões do IFN- e