Neoformação óssea

A Tabela 6 mostra os resultados da neoformação óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação, classificando-a em: 1) leve, 2) leve-moderada, 3)

moderada, 4) moderada-intensa, 5) intensa e 6) completa. Não houve diferenças

Tabela 6 – Neoformação óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação

Grupo

Período/ Grupo Neoformação óssea I II Valor de p

N % n % • 15 dias Experimental Leve 1 20,0 1 16,7 p(1) _{= 0,740} Leve-moderada 2 40,0 4 66,7 Moderada 2 40,0 1 16,7 TOTAL 5 100,0 6 100,0 Controle Leve 4 66,7 5 83,3 p(1) _{= 1,000} Leve-moderada 1 16,7 1 16,7 Moderada 1 16,7 - - TOTAL 6 100,0 6 100,0 • 30 dias Experimental Leve-moderada 2 33,3 4 66,7 p(1) = 0,481 Moderada 2 33,3 2 33,3 Moderada-intensa 2 33,3 - - TOTAL 6 100,0 6 100,0 Controle Leve 4 80,0 4 66,7 p(1) = 1,000 Leve-moderada 1 20,0 2 33,3 TOTAL 5 100,0 6 100,0 • 45 dias Experimental Moderada 4 66,7 2 33,3 p(1) _{= 0,610} Moderada-intensa 1 16,7 2 33,3 Intensa 1 16,7 2 33,3 TOTAL 6 100,0 6 100,0 Controle Leve 1 16,7 3 50,0 p(1) _{= 0,766} Leve-moderada 2 33,3 2 33,3 Moderada 3 50,0 1 16,7 TOTAL 6 100,0 6 100,0

(1) Através do teste Exato de Fisher.

Na tabela 7, após a obtenção da média dos escores da neoformação óssea, observou-se que nos períodos de 15 e 30 dias os valores dos subgrupos experimentais foram maiores no grupo 1. Após 45 dias, o grupo 2 apresentou uma média superior no subgrupo experimental. No entanto, não foi possível identificar diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (p > 0,05).

Tabela 7 – Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação

Tipo de enxerto

Avaliação Subgrupo I II Valor de p

(Média ± DP) (Média ± DP) % • 15 dias Experimental 2,20 ± 0,84 2,00 ± 0,63 p(1) = 0,604 Controle 1,50 ± 0,84 1,17 ± 0,41 p(1) = 0,727 • 30 dias Experimental 3,00 ± 0,89 2,33 ± 0,52 p(1) = 0,275 Controle 1,20 ± 0,45 1,33 ± 0,52 p(1) = 1,000 • 45 dias Experimental 3,50 ± 0,84 4,00 ± 0,89 p(1) = 0,470 Controle 2,33 ± 0,82 1,67 ± 0,82 p(1) = 0,316

(1) Através do teste de Mann-Whitney.

A Tabela 8, evidencia a média da área (µm2) da matriz óssea neoformada na avaliação de 45 dias, sendo os valores correspondentemente mais elevados nos subgrupos experimental e controle do grupo 1, entretanto, sem diferenças estatisticamente significante (p > 0,05) (Gráfico 1).

Tabela 8 – Média e desvio padrão da área (µm2) da matriz óssea neoformada segundo o grupo e o subgrupo na avaliação de 45 dias

Grupo

Subgrupo I II Valor de p

(Média ± DP) (Média ± DP)

• Experimental 14872,88 ± 5826,09 10598,37 ± 3071,55 p(1) = 0,222

• Controle 5952,89 ± 3899,53 3689,09 ± 2194,10 p(1) = 0,222

Gráfico 1 – Média da área (µm2) da matriz óssea neoformada segundo o grupo e o subgrupo na avaliação de 45 dias

14872,88 10598,37 5952,89 3689,09 0 4000 8000 12000 16000 Enxerto I Enxerto II · Experimental · Controle

7 DISCUSSÃO

A reconstrução do complexo Buco-Maxilo-Facial decorrente de perdas ósseas, preferencialmente deveria ser realizada pela técnica que utilizasse o enxerto autógeno. Isto ocorre quando o tecido ósseo vital é removido de uma área doadora e, no mesmo tempo cirúrgico, transferido para a região a ser reconstruída. No entanto, nem sempre esse procedimento pode ser realizado devido à dificuldade de obtenção de tecido ósseo suficiente da área doadora, além do potencial aumento da morbidade com um procedimento cirúrgico adicional (TAGA et al., 1997).

Por essas razões, uma série de pesquisas tem sido realizada com o intuito de desenvolver materiais que possuam propriedades de biocompatibilidade e osteocondução (ZAMBUZZI et al., 2005). Desta forma, biomateriais xenógenos como a matriz orgânica e inorgânica de osso bovino, assim como de origem sintética, a hidroxiapatita e o tricálcio fosfato, apresentam-se como substitutos ósseos viáveis nas cirurgias reconstrutivas de pequenas áreas.

Para o tratamento de defeitos ósseos do complexo Buco-Maxilo-Facial, vários modelos animais têm sido propostos no desenvolvimento de um protocolo padrão (TAGA et al., 1997; BUCHAIM et al, 2002; LIMEIRA JÚNIOR, 2004; FELLAH et al., 2008). A calvária de animais é usualmente utilizada para avaliação de materiais osteopromotores (HANDSCHEL et al., 2002; LAUREANO FILHO et al., 2007; TUDOR et al, 2008). Neste trabalho, o uso da calota craniana de ratos adultos

Wistar foi devido à disponibilização de um osso de origem embrionária, semelhante

externa e interna compactas, relativamente espessas, com faixa intermediária estreita de osso medular e com ossificação intramembranosa (CRUMP et al., 1996; FROTA, 2006). Adicionado a isso, além do baixo custo, o modelo permite um manejo relativamente fácil na avaliação da reparação óssea (JONES et al., 2007).

Para obter resultados confiáveis dos materiais testados, o modelo animal deve permitir a reprodutibilidade de seus resultados e possível comparação entre as amostras. A reparação nos defeitos ósseos do modelo não deve realizar-se espontaneamente durante o período de observação, sendo, portanto, definido como tamanho crítico (HOLLINGER; KLEINSCHMIDT, 1990; SCHLEGEL et al, 2006).

Para esta pesquisa, foi utilizado o defeito ósseo de 5,0 mm de diâmetro, definido como limite crítico para o osso parietal de ratos Wistar (BOSH; MELSEN; VARGEVIK, 1998; JONES et al., 2007). Isto permitiu um estudo pareado, pois a ostectomia pôde ser realizada bilateralmente à sutura mediana, o que evitou o seio sagital, prevenindo a sua ruptura e conseqüente possibilidade de morte do animal por hemorragia. Adicionalmente, o acesso cirúrgico foi único e não houve dificuldades no manuseio dos biomateriais quanto a sua inserção nas cavidades ósseas, assim como no fechamento da ferida.

Os biomateriais utilizados na presente pesquisa foram o composto de hidroxiapatita e tricálcio fosfato (Gen-phos®) e o enxerto de matriz orgânica e inorgânica de osso bovino (Gen-mix®). Estes biomateriais são de micro partículas com características osteocondutoras e reabsorção relativamente lenta. Estas propriedades foram observadas ao longo da pesquisa e revelaram-se positivas, uma vez que foi

observado um melhor processo de reparo do experimento em comparação ao controle.

Para Sicca et al. (2000), o tamanho dos grânulos dos diferentes tipos dos biomateriais é um fator importante para o sucesso do reparo ósseo. Contudo, os autores acreditam não haver uma definição clara de qual tamanho é adequado para cada tecido ou condição clínica, uma vez que as características físico-químicas de cada biomaterial e/ou do defeito ósseo também afetam a resposta tecidual. Este fato foi observado por Mankani et al. (2001) que demonstraram que partículas de hidroxiapatita / tricálcio fosfato com 0,1 - 0,25 mm de tamanho resultavam em maior formação óssea. Em outro estudo, Moreira et al. (2003) observaram a influência sobre a integração óssea da hidroxiapatita (HA) em relação ao tamanho dos grânulos do biomaterial, onde as partículas de menores dimensões (212µm) promoveram uma maior velocidade e melhor qualidade do processo de reparo ósseo. No entanto, o efeito do tamanho dos grânulos quando da utilização de matriz inorgânica e orgânica de osso bovino parece não interferir na reparação óssea. Sicca et al. (2000) observaram não haver diferença na resposta celular ao osso cortical bovino implantados em subcutâneo de ratos na forma micro (0,25 – 1,0 mm) e macro granular (1,0 – 2,0 mm). Em outro estudo, sobre o processo de reparo de defeitos ósseos preenchidos por osso medular bovino, Carneiro et al. (2005) constataram resultados semelhantes para ambas as formas das partículas do biomaterial.

No presente estudo, o composto hidroxiapatita sintética / tricálcio fosfato (HA/TCP) utilizado foi o microgranular com partículas de 0,5 a 0,75 mm, ou seja, entre 500 a

750 µm. Este fato pode explicar o melhor desempenho do biomaterial de origem bovina sobre o HA/TCP, uma vez que para o primeiro, o tamanho dos grânulos parece não influenciar no processo de reparo. Embora os resultados não tenham sido estatisticamente significantes e ambos os biomateriais tenham tido resultados superiores ao controle, partículas menores de HA (< 0,5 mm) possivelmente contribuiriam na reparação óssea.

Buchaim et al. (2002) observaram que o Gen-phos® apresentou baixa neoformação óssea no período de 10 dias, onde foi evidenciada exuberante reação inflamatória induzida pelo material. O processo de reparo do defeito ósseo em tíbia de ratos foi mais significativo a partir dos 20 dias, provavelmente devido à incorporação do cálcio e do fosfato nos tecidos fagocitados pelos osteoblastos, observando uma diminuição do infiltrado inflamatório.

O declínio da resposta inflamatória, em relação ao tempo, também foi observado por Zambuzzi et al. (2006), que verificou, ainda, o aumento da vascularização do tecido conjuntivo após a utilização da matriz inorgânica bovina em tecido subcutâneo de ratos. Resultados estes que corroboram com Carneiro et al. (2005) em relação a matriz orgânica bovina, tanto na forma micro quanto macro granular.

Os grupos 1 e 2 desta pesquisa apresentaram comportamento semelhante aos estudos acima mencionados. Ambos os grupos exibiram uma reação inflamatória inicialmente leve a moderada, que diminuiu de intensidade quando se prolongava o tempo de observação, e um tecido conjuntivo com grau moderado de vasos sanguíneos, cuja vascularização se maximizou com o tempo. Em um primeiro

momento, de acordo com Frota (2006), a reação inflamatória ao biomaterial é esperada e pode inibir a resposta à reparação inicial pela perpetuação da sua fase inflamatória. No entanto, a inflamação tecidual não é decorrente, exclusivamente, do biomaterial utilizado, mas também inerente ao próprio processo de reparação tecidual. Portanto, os resultados do presente estudo corroboram com as observações de Frota (2006), visto que o processo inflamatório foi evidenciado em ambos os subgrupos, experimental e controle, entretanto, com graus variáveis de intensidade.

Segundo Al Ruhaimi (2000), a presença de células gigantes multinucleadas, caracterizando uma reação inflamatória do tipo corpo estranho é claramente conhecida como inibidora da neoformação óssea. Este fato foi evidenciado por Marins et al. (2004), após o uso de osso bovino orgânico em calvária de ratos. Os autores observaram, em alguns espécimes com um e três meses, a presença de focos de corpo estranho e de reação granulomatosa próximos do biomaterial, juntamente com aglomerados de macrófagos e células gigantes multinucleadas rodeados por linfócitos e quase nenhuma formação óssea. Aos poucos casos constatados foram atribuídos a provável descalcificação incompleta do biomaterial durante sua produção.

Por outro lado, Fujita et al. (2003), após a implantação de blocos de hidroxiapatita (HA) e β-tricálcio-fosfato (β-TCP) sobre o osso parietal de ratos, entre o periósteo e a superfície óssea, identificaram a presença de reação de corpo estranho (RCE) junto ao biomaterial, no entanto, sem proximidade da matriz óssea neoformada. Isto se deve ao fato que os biomateriais de origem bovina ou sintética, quando

implantados em tecido subcutâneo, induzem reação granulomatosa do tipo corpo estranho devido à tentativa do organismo em promover a reabsorção dos mesmos. Ressalta-se que este fato não implica necessariamente na inexistência de biocompatibilidade.

Desta forma, parece comum este tipo de reação ao material quando implantado em tecido mole, sendo a reação minimizada no uso em defeitos ósseos (FELLAH et al, 2007). Em conformidade com tais observações, nesta pesquisa chamou bastante atenção o fato de não ter sido observada a reação de corpo estranho em nenhum dos grupos, seja no experimento ou controle, independente do período observado.

O tecido conjuntivo fibroso (TCF) foi identificado em todos os espécimes desta amostra, evidenciando variações quanto à sua celularidade do tecido ao longo do tempo, o que corrobora com os achados de Thorwarth et al. (2006) que observaram uma ampla quantidade de tecido conjuntivo fibroso com potencial osteogênico após o uso da matriz bovina inorgânica. Diferentemente de Handschel et al. (2002), em seu estudo sobre o tricálcio fosfato, no qual não houve presença de fibrose entre as partículas do biomaterial, possibilitando uma maior integração do mesmo ao osso.

Em todos os animais deste estudo, foi visualizada a atividade osteoblástica nos grupos 1 e 2, entretanto a atividade osteoblástica esteve, nos subgrupos experimentais, mais fortemente presente em comparação ao controle. Os achados histológicos mostraram pavimentação osteoblástica em trabéculas ósseas neoformadas, tanto a partir das bordas do defeito quanto da superfície das partículas do biomaterial, o que vai de encontro aos resultados de Handschel et al. (2002) que

atribuiram ao tricálcio fosfato (TCP) a ausência de osteocondutividade quando implantados na calvária de ratos Wistar. No entanto, esta propriedade do TCP foi relatada por Frota (2006), assim como da hidroxiapatita por Limeira Júnior (2004).

A neoformação óssea esteve presente em todos os espécimes da amostra. No entanto, exibiu maior intensidade nos subgrupos experimentais, principalmente nos períodos de 30 e 45 dias. O padrão da reparação óssea foi muito semelhante nos grupos 1 e 2, ou seja, houve um aumento gradativo da reparação com o tempo, sendo tal aumento sempre mais elevado em comparação aos subgrupos controles. Estes resultados estão em conformidade com os achados de autores que trabalharam com matriz óssea bovina (TAGA et al, 1997; MARINS et al., 2004; TUDOR et al., 2008) e com Hidroxiapatia / tricálcio fosfato (BUCHAIM et al., 2002; MIRANDA et al, 2005; FELLAH et al., 2007).

No presente estudo, a matriz óssea neoformada foi submetida à análise morfométrica através do método de segmentação de imagens (QUEIROGA et al., 2008). Para a segmentação, foi utilizado o algoritmo k-médias com 7 clusters (classes) a partir das bandas “a” e “b” do sistema L*a*b*. No entanto, nos períodos de 15 e 30 dias, as imagens segmentadas não apresentaram classes que pudessem ser aproveitadas no cálculo de área (µm²). Desta forma, apenas o período de 45 dias foi considerado. Este fato pode ter ocorrido em função da neoformação óssea incipiente e da presença marcante das partículas dos biomateriais nos períodos de 15 e 30 dias que provavelmente dificultaram uma dissociação efetiva das imagens.

Segundo a tabela 7, os subgrupos experimentais tiveram as médias dos escores da neoformação óssea ligeiramente maiores para o grupo 1 aos 15 e 30 dias e para o grupo 2 aos 45 dias. Estes valores foram muito próximos e não foi possível determinar diferença estatisticamente significante entre os grupos. No entanto, a tabela 8 mostra que a média das áreas da matriz óssea neoformada (µm²) foi maior para o grupo 1 aos 45 dias. Isto evidencia uma melhor tendência do grupo 1 para reparação óssea, porém não se pôde também constatar diferença significante.

A reparação óssea nos subgrupos controles ocorreu basicamente a partir das bordas do defeito e de forma incipiente em comparação aos subgrupos experimentais. Estes, por sua vez, apresentaram neoformação óssea entre as partículas do biomaterial, principalmente aos 30 e 45 dias. Neste último período, foi possível a identificação do preenchimento de toda extensão do aspecto basilar do defeito ósseo na maioria dos animais dos grupos 1 e 2.

Diante do exposto acima, a presente pesquisa evidenciou que os biomateriais testados apresentaram características semelhantes com relação à influência sobre o metabolismo do tecido ósseo, sendo, portanto, osteocondutores. Desta forma, estão indicados como substitutos do tecido ósseo na reparação de defeitos ósseos.

8 CONCLUSÃO

De acordo com os dados obtidos nesta pesquisa, pode-se concluir que:

• Os defeitos ósseos submetidos aos biomateriais de origem bovina (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica esponjosa e colágeno bovino) e sintética (cerâmica de hidroxiapatita + β -tricálcio-fosfato) apresentaram uma melhor reparação óssea em comparação ao controle nos períodos de 15, 30 e 45 dias.

• O biomaterial de origem bovina apresentou uma reparação mais precoce e uma maior deposição de matriz óssea neoformada (µm2).

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