UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
ÁLVARO BEZERRA CARDOSO
ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO COMPARATIVO DA REPARAÇÃO ÓSSEA EM RATOS APÓS O USO DE BIOMATERIAIS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA
João Pessoa – PB 2008
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
ÁLVARO BEZERRA CARDOSO
ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO COMPARATIVO DA REPARAÇÃO ÓSSEA EM RATOS APÓS O USO DE BIOMATERIAIS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA
Tese apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal da Paraíba e Universidade Federal da Bahia para obtenção do título de Doutor em Odontologia
Área de Concentração: Estomatologia
Orientadores: Fabiano Gonzaga Rodrigues
Francisco de Assis Limeira Júnior
João Pessoa – PB 2008
DATA DA DEFESA DE TESE: 12 de dezembro de 2008
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________ Prof. Dr. Fabiano Gonzaga Rodrigues
Orientador
_______________________________________ Profª. Drª. Tânia Lemos Coelho Rodrigues
Examinadora Interna
_______________________________________ Profª. Drª. Andressa Feitosa Bezerra de Oliveira
Examinadora Interna
_______________________________________ Prof. Dr. Riedel Frota
Examinador Externo
_______________________________________ Prof. Dr. José Rodrigues Laureano Filho
Examinador Externo
_________________________________________ Prof. Dr. Francisco de Assis Limeira Júnior
Suplente Interno
_________________________________________ Prof. Dr. José Ivo Queiroz do Amaral
A Deus, por estar sempre do meu lado em todos os momentos da minha vida, dando-me forças e sabedoria para tantas conquistas.
À minha família que sempre apoiou minhas escolhas, em especial aos meus irmãos (Germano, Henrique e Rafael), por fazerem parte da minha vida, e juntamente comigo, comemorarem mais um trabalho realizado.
Aos meus pais, Paulo e Ismênia, exemplos constantes de amor aos filhos, por me ensinarem carinhosamente a enfrentar cada etapa da vida, incentivando e apoiando todos os meus projetos. Meu eterno amor e gratidão.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Aos Professores Dr. Fabiano Gonzaga Rodrigues e Dr. Francisco de Assis
Limeira Júnior, exemplos de dedicação, seriedade e profissionalismo na pesquisa
odontológica; por acreditarem em meu potencial e pelo apoio em todos os momentos, minha imensa gratidão por orientarem este trabalho e pelos valiosos ensinamentos durante o curso de pós-graduação.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal da Paraíba, por me acolher nos últimos cinco anos, durante os cursos de mestrado e de doutorado, nesta instituição de bases educacionais sólidas.
Aos Professores do Programa Integrado de Pós-Graduação em Odontologia da
Universidade Federal da Paraíba e Universidade Federal da Bahia, em especial
ao Dr. Ricardo Cavalcanti Duarte (coordenador do programa), ao Dr. Lino João da
Costa (Coordenador da área de concentração em Estomatologia), à Dra. Tânia Lemos Coelho Rodrigues e à Dra. Maria Sueli Marques Soares, pela
oportunidade de realizar o curso de Doutorado em Estomatologia, assim como pelas sinceras amizades conquistadas.
Ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica e ao Laboratório de
Experimentação Animal, ambos da Universidade Federal da Paraíba, por permitir a
realização da parte experimental do trabalho, cedendo os animais e o ambiente dentro de condições idéias de criação e manutenção, assegurando a confiabilidade desta pesquisa.
Ao Senhor Luis Crispim, funcionário do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba, pela colaboração no cuidado e manutenção dos animais utilizados durante todo o trabalho.
Aos Acadêmicos Carol, Lariane, Suennya e Thiago (Odontologia – UFPB), em especial a Isa (Ciências Biológicas – UFPB) e ao Adelmo (Odontologia – UFPE), pelo carinho e ajuda no trato com os animais, a participação de todos vocês foram de fundamental importância na fase experimental deste trabalho.
À Faculdade de Odontologia de Pernambuco – FOP/UPE, em especial ao Prof.
Dr. Emanuel Sávio de Souza Andrade, pela disponibilização do laboratório de
Patologia Bucal, colaborando no desenvolvimento desta pesquisa.
Aos técnicos em patologia Armando (FOP/UPE) e Catarina, pela valiosa contribuição no processamento das lâminas.
Ao Laboratório de Patologia Geral do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, por ceder os microscópicos para análise histológica, em especial à Profa. Dra. Cláudia Roberta Leite Vieira de Figueiredo, pela orientação na interpretação dos dados histológicos, sua participação foi de extrema valia, engrandecendo a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Leonardo Vidal Batista e ao acadêmico Thallys do Departamento de Informática da Universidade Federal da Paraíba, por tornarem possível a realização da análise morfométrica desta pesquisa.
A todos os amigos do doutorado em Estomatologia (UFPB), em especial, Allan
Ullisses, Marcos Paiva, Luís Carlos, Andréa Queiroga e Giliara Carol, pela
convivência e amizade.
Ao grande amigo Ricardo Gurgel, pela amizade sincera e apoio desde os tempos da especialização em cirurgia e mestrado em Diagnóstico Bucal. Esse trabalho também é fruto de todo seu empenho e compromisso com o conhecimento científico, com sua ajuda pudemos vencer diversos obstáculos e comemorar juntos mais essa conquista.
A todos os professores da Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da Universidade de Pernambuco, em especial, Dr. Belmiro Vasconcelos, Dr. Caubi
Figueiredo, Dr. Emanuel Dias, Dr. Laureano Rodrigues e Dr. Ricardo Holanda,
pela amizade e todos os ensinamentos na área de cirurgia; exemplos a serem seguidos.
Ao fraterno amigo Riedel Frota, sempre disposto a ajudar, exemplo de dedicação e profissionalismo na construção do conhecimento científico, pela amizade e apoio constantes, minha eterna gratidão pelo incentivo e convívio em família.
Ao meu primo Pedro Paulo, à sua querida esposa Luciana e seus filhos Pedro
Filho e Nádia, por todos os momentos de alegria e descontração em família,
acolhendo-me fraternalmente em sua casa.
À família Oliveira Buril, por me acolher carinhosamente, em especial a Juliana
Buril, por toda compreensão e amor, a sua dedicação e companhia vem sendo
muito especial na construção de mais uma etapa de minha vida.
Aos amigos de plantão do Hospital Getúlio Vargas, em especial, Bruno de Lira,
Nelson Studart, Jorge Orestes, Jorge Luís, Lauro, Sérgio e Selenildo, pelos
momentos de descontração e amizade sincera.
A todos os Amigos, que de forma direta ou indiretamente, contribuíram e torceram em favor da realização deste trabalho.
"É melhor tentar e falhar,
que preocupar-se e ver a vida passar;
é melhor tentar, ainda que em vão,
que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar,
que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco,
que em conformidade viver ..."
RESUMO1
A presente pesquisa é um estudo experimental que avaliou a reparação óssea em ratos, utilizando biomateriais de origem bovina (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica esponjosa e colágeno bovino) e sintética (cerâmica de hidroxiapatita + β -tricálcio-fosfato). Foram utilizados 36 ratos, machos e wistar albinos, distribuídos aleatoriamente em dois grupos com 18 animais cada e com a denominação G1 (bovino) e G2 (sintético). Foi confeccionado um defeito de 5,0 mm de diâmetro no osso parietal em cada lado da sutura sagital do animal, onde o lado esquerdo correspondeu ao experimento (preenchido por biomaterial de origem bovina ou sintética) e o lado direito ao controle (preenchido por coágulo sanguíneo). Após os períodos de 15, 30 e 45 dias do procedimento cirúrgico, os espécimes foram enviados para processamento histológico e analisados em microscopia óptica. As imagens obtidas foram segmentadas e submetidas à análise morfométrica para avaliação da reparação óssea (quantificação de matriz óssea neoformada). Os dados foram processados no programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 13.0 para Windows, sendo a análise estatística com nível de significância de 5%. Os resultados demonstraram que, embora sem diferença estatisticamente significante, os defeitos ósseos submetidos aos biomateriais de origem bovina e sintética apresentaram uma melhor reparação óssea em comparação ao controle, sendo a matriz óssea neoformada (µm2
1
Este trabalho está de acordo com as normas de documentação da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS (ABNT), a saber: NBR 6022, Informação e Documentação – Referências – Elaboração, ago. 2002. NBR 14724, Informação e Documentação – Trabalhos acadêmicos – Apresentação, 2006.
) maior nos defeitos ósseos preenchidos por osso de origem bovina. Conclui-se que os biomateriais utilizados contribuíram no processo de reparação dos defeitos ósseos.
ABSTRACT
This present experimental study evaluated the bone repair in rats following the use of bovine (cortical organic matrix, cancellous inorganic matrix e bovine collagen) and synthetic (hydroxiapatite + β-tricalcium-phosphate) origin biomaterials. Thirty six
Wistar albinus male rats were studied in two randomized groups with eighteen
animals: G1 (bovine) and G2 (synthetic). A 5,0 mm in diameter defect was confectioned in both parietal bones in each side of the sagital medium suture of the animal, where the left side corresponded to the experiment (filled with bovine or synthetic bone) and the right side to the control (empty surgical cavity). The specimens at 15, 30 and 45 days after the surgical procedure were sent for histological processing and analyzed by optical microscopy. The images were segmented and subjected to morphometric data analysis for evaluation of bone repair (neoformed bone matrix quantification). The statistics analysis was performed by the statistical program SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 13.0 for Windows, considering significance of 5%. The results showed that, although there was no statistically significant difference between groups, the defects submitted to bovine and synthetic origin biomaterials presented better bone repair, being the neoformed bone matrix (µm2) greater to bovine bone. Therefore, we concluded that the biomaterials used in this study contributed to the bone healing process.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Rato Wistar, macho albino, adulto jovem 56 Figura 2 Animais acondicionados em gaiolas plásticas 57 Figura 3 Tricotomia e imobilização em mesa cirúrgica específica 59 Figura 4 Anti-sepsia e infiltração anestésica local 60 Figura 5 Incisão linear através da pele e periósteo 61 Figura 6 Exposição da calvária após descolamento e afastamento do
retalho 61
Figura 7 Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo: biomaterial bovino (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica
esponjosa e colágeno bovino) 62
Figura 8 Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo: biomaterial sintético (cerâmica de hidroxiapatita + β
-tricálcio-fosfato) 62
Figura 9 Sutura interrompida simples do periósteo (mononylon 5-0) 63 Figura 10 Sutura contínua festonada da pele (mononylon 5-0) 63 Figura 11 Incisão trapezoidal de espessura total para obtenção dos
espécimes 65
Figura 12 Espécime obtido após ressecção parcial da calota craniana 66 Figura 13 Imagem do defeito ósseo do grupo G2A (biomaterial de origem
sintética – experimento) com 45 dias 69
Figura 14 Imagem extraída correspondente ao conteúdo do defeito ósseo
Figura 15 Classe utilizada para cálculo da área (µm2) da matriz óssea
neoformada 69
Figura 16 Grupo 1A - 15 dias. Defeito ósseo em toda extensão. Partículas
do biomaterial (*). Bordas do defeito (>). H.E. 75 Figura 17 Grupo 1A - 15 dias. Neoformação óssea a partir da borda do
defeito (>). H.E. 75
Figura 18 Grupo 1A - 15 dias. Detalhe da figura 17, evidenciado neoformação óssea (*) significativa a partir da borda do defeito.
H.E. 75
Figura 19 Grupo 1A - 15 dias. Formação de trabécula óssea (*) entre as
partículas do biomaterial. H.E. 75
Figura 20 Grupo 1A - 30 dias. Neoformação de tecido ósseo (*) entre o
biomaterial implantado. Bordas do defeito (>). H.E. 77 Figura 21 Grupo 1A - 30 dias. Neoformação óssea na borda do defeito (>).
H.E. 77
Figura 22 Grupo 1A – 30 dias. Maior aumento da figura 21, evidenciando a
formação da trabécula óssea (*). H.E. 77
Figura 23 Grupo 1A – 30 dias. Formação de tecido ósseo no interior do
defeito (*).H.E. 77
Figura 24 Grupo 1A – 30 dias. Pavimentação osteoblástica (>) a partir da
trabécula óssea neoformada. H.E. 77
Figura 25 Grupo 1A – 45 dias. Extensa neoformação de tecido ósseo (*).
Bordas do defeito (>). H.E. 79
Figura 26 Grupo 1A – 45 dias. Neoformação óssea (*) nas adjacências das
Figura 27 Grupo 1A – 45 dias. Trabécula óssea incipiente (*), evidenciando
pavimentação osteoblástica (>). H.E. 79
Figura 28 Grupo 1B – 15 dias. Ausência de neoformação óssea no interior
da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 83 Figura 29 Grupo 1B – 15 dias. Neoformação óssea (>) incipiente na borda
do defeito. H.E. 83
Figura 30 Grupo 1B – 15 dias. Detalhe da figura 29, exibindo a neoformação da trabécula óssea (*). H.E. 83 Figura 31 Grupo 1B – 30 dias. Defeito ósseo sem evidência de
neoformação óssea no interior da cavidade (*). Bordas do defeito
(>). H.E. 85
Figura 32 Grupo 1B – 30 dias. Presença de neoformação óssea incipiente (*) a partir da borda do defeito. Vasos sanguíneos congestos (>)
em meio a tecido conjuntivo fibroso. H.E. 85 Figura 33 Grupo 1B – 30 dias. Detalhe da figura 32, evidenciando a
neoformação óssea incipiente (*) a partir da borda do defeito.
H.E. 85
Figura 34 Grupo 1B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando neoformação incipiente de tecido ósseo (*) no interior da cavidade. Bordas do
defeito (>). H.E. 87
Figura 35 Grupo 1B – 45 dias. Neoformação óssea a partir da borda do
defeito (>). H.E. 87
Figura 36 Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da trabécula óssea neoformada (*)
Figura 37 Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da figura 35, exibindo a neoformação de tecido ósseo a partir da borda do defeito (*).
H.E. 87
Figura 38 Grupo 2A – 15 dias. Defeito ósseo, exibindo as partículas do
biomaterial (*) no interior da cavidade. Bordas do defeito (>). H.E. 91 Figura 39 Grupo 2A – 15 dias. Neoformação óssea incipiente (>) na borda
do defeito. H.E. 91
Figura 40 Grupo 2A – 15 dias. Detalhe da figura 39, evidenciando a pavimentação osteoblástica (>) envolta da trabécula óssea. Presença de vasos sanguíneos congestos (*). H.E. 91 Figura 41 Grupo 2A – 30 dias. Defeito ósseo, exibindo neoformação óssea
a partir das bordas do defeito (>). H.E. 93 Figura 42 Grupo 2A – 30 dias. Neoformação óssea (>) a partir da borda do
defeito e das partículas do biomaterial. H.E. 93 Figura 43 Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a
trabécula óssea neoformada (*) entre as partículas do
biomaterial. H.E. 93
Figura 44 Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a neoformação óssea a partir da borda do defeito (*). H.E. 93 Figura 45 Grupo 2A – 45 dias. Neoformação óssea em toda extensão da
cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 95 Figura 46 Grupo 2A – 45 dias. Tecido ósseo neoformado (*) a partir da
borda do defeito (>), estendendo-se para o interior do defeito.
Figura 47 Grupo 2A – 45 dias. Trabéculas ósseas no interior do defeito (*)
nas adjacências das partículas do biomaterial. H.E. 95 Figura 48 Grupo 2B – 15 dias. Defeito ósseo sem evidência de
neoformação óssea no interior da cavidade (*). Bordas do defeito
(>). H.E. 99
Figura 49 Grupo 2B – 15 dias. Neoformação óssea incipiente a partir da
borda do defeito (>). H.E. 99
Figura 50 Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 49, exibindo trabécula óssea neoformada (*) e atividade osteoblástica nas adjacências
(>). H.E. 99
Figura 51 Grupo 2B – 30 dias. Ausência de neoformação óssea no interior
da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 101 Figura 52 Grupo 2B – 30 dias. Tecido conjuntivo no interior do defeito
ósseo com presença de vasos sanguíneos congestos (>). H.E. 101 Figura 53 Grupo 2B – 30 dias. Osso neoformado a partir da borda do
defeito (*). H.E. 101
Figura 54 Grupo 2B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando tecido conjuntivo fibroso no interior da cavidade (*) e presença de neoformação óssea incipiente (>) a partir das bordas do defeito.
H.E. 103
Figura 55 Grupo 2B – 45 dias. Detalhe da figura 54, exibindo a neoformação óssea incipiente a partir da borda do defeito (>).
H.E. 103
Figura 56 Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 54, evidenciando tecido
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Média da área (µm2
112 ) da matriz óssea neoformada segundo o
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Infiltrado inflamatório segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação 105
Tabela 2 Vascularização segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação 106
Tabela 3 Reação de corpo estranho (RCE) segundo o grupo, o subgrupo e
o tempo de avaliação 107
Tabela 4 Tecido conjuntivo fibroso segundo o grupo, o subgrupo e o tempo
de avaliação 108
Tabela 5 Atividade osteoblástica segundo o grupo, o subgrupo e o tempo
da avaliação 109
Tabela 6 Neoformação óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de
avaliação 110
Tabela 7 Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação
óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação 111 Tabela 8 Média e desvio padrão da área (µm2
111 ) da matriz óssea neoformada segundo o grupo e o subgrupo na avaliação de 45 dias
LISTA DE QUADROS
Quadro 01 Divisão dos grupos de acordo com a origem do biomaterial e o
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BMP ... Proteína morfogenética óssea Ca ... Cálcio
Ca10(PO4)6(OH)2 ...
CCS ... Centro de ciências da saúde Hidroxiapatita
CFB ... Cálcio fosfato bifásico
EEB ... Encefalopatia espongiforme bovina
FOP ... Faculdade de Odontologia de Pernambuco G1 ... Grupo - enxerto de origem bovina
G1A ... Subgrupo experimental do G1 G1B ... Subgrupo controle do G1
G2 ... Grupo - enxerto de origem sintética G2A ... Subgrupo experimental do G2 G2B ... Subgrupo controle do G2 HA ... Hidroxiapatita
HE ... Hematoxilina / eosina
IGF ... Fatores de crescimento semelhante à insulina IL-1 ... Interleucina-1
IL-2 ... Interleucina-2
L*a*b* ... Sistema de cores definidas pelo brilho (L*) e pelas coordenadas de cromaticidade (a* e b*)
LEA ... Laboratório de experimentação animal LTF ... Laboratório de tecnologia farmacêutica
n ... Número
OA ... Osso autógeno
P ... Nível de significância
PDGF ... Fator de crescimento derivado de plaquetas PGA ... Ácido poliglicólico
PLGA ... Ácido poli-lático-co-ácido glicólico PLLA ... Ácido Poli-L-lático
RCE ... Reação de corpo estranho
RGB ... Sistema de cores aditivas formado por vermelho (Red), verde (Green) e Azul (Blue)
rpm ... Rotações por minuto
SID ... Submucosa de intestino delgado porcina SPSS ... Statistical Package for the Social Sciences TCF ... Tecido conjuntivo fibroso
TCP ... Tricálcio fosfato
TGF-β ... Fator transformador de crescimento β UFBA ... Universidade Federal da Bahia
UFPB ... Universidade Federal da Paraíba UPE ... Universidade de Pernambuco
LISTA DE SÍMBOLOS
% ... Percentual
β ... Letra grega “beta” µm ... Micrômetro ® ... Marca registrada : ... Razão + ... Sinal de mais < ... Menor que > ... Maior que = ... Igual a
± ... Sinal de mais ou menos cm ... Centímetros g ... Grama Kg ... Quilograma mg ... Miligrama ml ... Mililitro mm ... Milímetro N-cm ... Newton centímetro ºC ... Grau Celsius
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 27
2 REVISÃO DE LITERATURA 31
2.1 REGENERAÇÃO ÓSSEA 31
2.1.1 Resposta Biológica aos Biomateriais Substitutos Ósseos 33
2.2 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS 34
2.2.1 Origem 35
2.2.2 Composição Química 36
2.2.3 Mecanismo de Ação 37
2.3 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA 38 2.4 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM SINTÉTICA 43
3 PROPOSIÇÃO 51
3.1 OBJETIVO GERAL 51
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 51
4 HIPÓTESES 53
5 MATERIAIS E MÉTODOS 55
5.1 SELEÇÃO E TAMANHO DA AMOSTRA 55
5.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO DA AMOSTRA 56
5.3 ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS 56
5.4 ALIMENTAÇÃO DOS ANIMAIS 57
5.5 GRUPOS DE ESTUDO 57
5.6 IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS 58
5.7.1 Anestesia Geral 59
5.7.2 Técnica Cirúrgica 60
5.8 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA E
SINTÉTICA UTILIZADOS 64
5.9 CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS 65
5.10 OBTENÇÃO DOS ESPÉCIMES APÓS OS PERÍODOS DE 15, 30 E
45 DIAS 65 5.11 ANÁLISE HISTOLÓGICA 66 5.12 ANÁLISE MORFOMÉTRICA 68 5.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA 69 5.14 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 70 5.15 FONTE DE FOMENTOS 70 6 RESULTADOS 72 6.1 ANÁLISE HISTOLÓGICA 72
6.1.1 Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento) 72
6.1.2 Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle) 80
6.1.3 Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento) 88
6.1.4 Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle) 96
6.2 ANÁLISE MORFOMÉTRICA 104
6.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA 104
6.3.1 Infiltrado Inflamatório 104
6.3.2 Vascularização 105
6.3.3 Reação de Corpo Estranho (RCE) 107
6.3.4 Tecido Conjuntivo Fibroso (TCF) 107
6.3.6 Neoformação óssea 109 7 DISCUSSÃO 114 8 CONCLUSÃO 123 REFERÊNCIAS 125 APÊNDICE 132 ANEXO 133
1 INTRODUÇÃO
O tecido ósseo possui características biológicas que promovem sua regeneração espontânea quando lesionado, repondo a porção perdida (TAGA et al., 1997). Em grande parte, isto se deve a habilidade dos fatores de crescimento em direcionar as células-tronco para as vias condrogênica e osteogênica, e ao papel das forças mecânicas que estimulam a remodelação óssea (SICCA et al., 2000; CARNEIRO et al., 2005).
Há situações em que a capacidade de reparo é limitada pelo tamanho da perda óssea como aquelas causadas por trauma, patologias ou conseqüência de procedimentos cirúrgicos diversos. Nestes casos, o defeito ósseo torna-se crítico a reparação espontânea, onde se faz necessário o uso de enxertos para um correto tratamento e bom prognóstico (CARNEIRO et al., 2005).
A reconstrução do tecido ósseo tem despertado grande interesse por parte das diversas especialidades cirúrgicas (MARQUES et al., 1982; VOLPON, XAVIER, GONÇALVES, 1982; RIOS et al., 1996; LIRA, 1998), onde nos métodos tradicionais de tratamento tem-se utilizado o enxerto ósseo autógeno. Isto se deve a sua propriedade osteogênica e facilidade de incorporação em comparação aos tipos homógenos e xenógenos. No entanto, a utilização dos enxertos ósseos autógenos agrega riscos ao paciente, incluindo a realização de mais um sítio operatório com incisão cirúrgica adicional, aumento da morbidade pós-operatória, debilitação da área doadora e quantidade óssea disponível limitada, principalmente em crianças e
adultos que se submeteram a procedimentos cirúrgicos anteriores (FIGUEIREDO et al., 2001, SANADA et al., 2003; 2004; SASSIOTO et al., 2004; TUDOR et al., 2008).
Desta forma, tem-se procurado criar ou extrair da natureza materiais que substituam o osso ou que, associados a ele ou a outros materiais, promovam o incremento da reparação e neoformação óssea, sendo assim, biocompatíveis, osteocondutores, osteogênicos e/ou osteoindutores (FROTA, 2006). Dentro deste contexto, observam-se diversos trabalhos sobre o estudo da reparação ósobservam-sea, utilizando os mais diversos biomateriais, tais como: polímero de mamona (JACQUES, J. W. et al., 2004; LAUREANO FILHO, J. R. et al., 2007), hidroxiapatita sintética (LIMEIRA JÚNIOR, 2004; SOCCOL et al, 2006), β-tricálcio fosfato (FROTA, 2006), osso bovino orgânico (MARINS et al, 2004; GERBI et al., 2003; PINHEIRO et al., 2003) e inorgânico (PINHEIRO et al., 2003; LIMEIRA JÚNIOR et al., 2003; ZAMBUZZI et al., 2005, 2006).
Os derivados inorgânicos sintéticos como a hidroxiapatita e fosfato tricálcio, têm recebido grande atenção como materiais de preenchimento, espaçadores e substitutos para os enxertos ósseos, principalmente devido a sua biocompatibilidade, bioatividade e características de osteocondução em relação ao tecido hospedeiro (DAMIEN, PARSONS, 1991; SICCA et al., 2000; MOREIRA et al., 2003; SANADA et al., 2003).
O papel de carreador dos fatores de indução óssea pode ser desempenhado pelo osso bovino cortical ou medular, macro ou microgranular, desproteinizado. Além de fornecerem uma estrutura de suporte e osteocondução, podem prover também um
alto conteúdo de cálcio e fósforo, essenciais para a neoformação do tecido ósseo (SCIADINI et al., 1997; YUKNA et al., 1998; SICCA et al., 2000; ZAMBUZZI et al., 2005, 2006).
Neste sentido, este estudo tem como finalidade contribuir para o conhecimento do comportamento da reparação óssea quanto à utilização dos biomateriais de origem bovina e sintética.
2 REVISÃO DE LITERATURA
Defeitos ósseos de origem genética e/ou subseqüentes a traumas, bem como ressecções tumorais ou reabsorção óssea após perda dentária, tem constituído uma barreira primária nas reconstruções ósseas antes de reabilitações orais (TUDOR et al, 2008).
O tratamento de lesões ósseas extensas do complexo buco-maxilo-facial deve ser realizado pela técnica do enxerto autógeno, quando o tecido ósseo vital é retirado de uma área doadora e rapidamente transferido para o local da lesão. Entretanto, esse procedimento nem sempre pode ser realizado pelo cirurgião devido à dificuldade de obtenção de tecido ósseo suficiente da área doadora (TAGA et al, 1997).
O desenvolvimento dos biomateriais, especialmente dos substitutos ósseos, é atualmente objeto de intensa pesquisa para utilização em cirurgia ortopédica, traumatológica e buco-maxilo-facial. Desta forma, com intuito de suprir as limitações conseqüentes ao uso de enxerto autógeno e/ou de bancos de osso, os biomateriais vêm sendo utilizados com perspectiva de uma reconstituição do tecido ósseo, seja no reforço de uma estrutura ou preenchimento de um defeito (GUTIERRES et al., 2006).
2.1 REGENERAÇÃO ÓSSEA
Os eventos que ocorrem durante a cicatrização normal de feridas de tecidos moles também ocorrem na reparação de um osso lesado e dividem-se basicamente em
três estágios (inflamatório, fibroblástico e remodelador). Embora não ocorram mutuamente exclusivos, participam dessa seqüência de forma bem definida e interdependente. O estágio inflamatório inicia-se no momento que ocorre a lesão tecidual, e na ausência de fatores que prolonguem a inflamação, dura de 3 a 5 dias, apresentando duas fases: a vascular e a celular. O estágio fibroblástico inicia-se a partir da formação dos fios de fibrina que derivam da coagulação sanguínea e se entrecruzam nas feridas, formando uma rede sobre a qual os fibroblastos podem iniciar a precipitação de substância fundamental e tropocolágeno. No estágio final da reparação (remodelador), muitas das fibras colágenas depositadas aleatoriamente são destruídas à medida que são substituídas por novas fibras orientadas para melhor resistir às forças de tensão sobre a ferida (HUPP, 2005).
A resposta adaptativa do osso após um trauma se expressa basicamente pela instalação de um processo inflamatório, similar ao de outros tecidos, contudo, devido a consistência elevada do osso, o edema e os mecanismos vasculares são limitados e restritos. O tecido ósseo exacerba outros mecanismos, também presentes nos tecidos moles, mas não com a mesma magnitude. Assim, destaca-se a presença de uma reatividade celular proeminente e a formação do calo ósseo como fenômeno reparativo fundamental. Também é destacado o fato de haver um processo hemorrágico inicial importante, seguido de coagulação e formação de trombo intra-ósseo (DOUGLAS, 2006)
Os osteoblastos e osteoclastos estão envolvidos na reconstrução e remodelação do tecido ósseo lesado. As células osteogênicas (osteoblastos), importantes para a reparação óssea, são derivadas de três fontes: periósteo, endósteo e células
mesenquimais pluripotentes indiferenciadas circulantes. Os osteoclastos, derivados de células precursoras de monócitos, funcionam para reabsorver osso necrótico e osso que necessita ser remodelado. Os osteoblastos depositam o osteóide que, se mantido completamente imóvel durante o processo de cicatrização, chega à calcificação (HUPP, 2005).
2.1.1 Resposta Biológica aos Biomateriais Substitutos Ósseos
A incorporação de biomateriais substitutos ósseos apresenta 5 estágios: 1) inflamatório, promovendo uma resposta celular do hospedeiro; 2) revascularização do tecido; 3) osteocondução, na qual o enxerto tem a função de arcabouço para o crescimento de vasos e formação de osso; 4) osteoindução, em que as células mesenquimais do hospedeiro são induzidas por proteínas morfogenética óssea (BMP) encontradas no biomaerial a se transformarem em osteoblastos e 5) remodelação óssea com características de formação e reabsorção contínua de osso (SOCCOL et al., 2006).
Após a implantação de um biomaterial, ocorre a formação de um hematoma com uma resposta do tipo inflamatória com aderência e revestimento de glicoproteínas ao material. Por processo de quimiotaxia, numerosas células são recrutadas para o local: neutrófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos (reação de corpo estranho). Estas últimas exercem atividade fagocitária e estimulam a ação dos linfócitos, fibroblastos, osteoclastos e células polimorfonucleares. Em seguida, inicia-se a angiogênese, com a migração e proliferação de células endoteliais. Estas irão formar uma rede de capilares que constituíra o suporte vascular. Posteriormente, a ação de
citoquinas (IL-1 e IL-2) e de diversos fatores de crescimento (TGF-β, PDGF, IGF, BMP’s) vão promover a diferenciação das células mesenquimais pluripotentes com a formação de matriz óssea e de osso imaturo. Por fim, a maturação e a remodelação encerram este processo (GUTIERRES, 2006).
O processo de incorporação do osso cortical difere do esponjoso devido a lenta revascularização do primeiro, o que diminui a possibilidade de anastomoses término-terminais, levando o dobro do período de tempo para este processo. O retardo é proveniente da estrutura arquitetônica do osso cortical, uma vez que a atividade osteoclástica precede a revascularização. Desta forma, os osteoclastos promovem o aumento da porosidade, podendo chegar a 50%, fazendo o material perder a resistência mecânica. Outra diferença é a tendência do osso cortical em permanecer com uma parte viável e outra necrótica, enquanto o esponjoso tende a ser completamente substituido com o tempo (PINTO, MIYAGUSKO, PEREIRA, 2003).
2.2 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS
Na busca de desenvolver substitutos biológicos para restaurar, manter ou melhorar a função de diversos tecidos, várias estratégias tem sido utilizadas, tais como: 1) reposição com biomaterial sintético; 2) biomateriais xenógenos submetido à ligação cruzada para estabilização; 3) células presas em câmeras de difusão, micro-cápsulas ou que cresceram sobre substratos reabsorvíveis; 4) substâncias capazes de induzir a proliferação celular e tecidual (fatores de crescimento e morfogenes), destinadas e/ou implantadas em local adequado (SICCA et al., 2000).
Neste contexto, é crescente o interesse no desenvolvimento de biomaterias que possuam propriedades biológicas e físico-químicas adequadas para o tratamento de perdas ósseas (SANADA et al, 2003). Desta forma, as características desejadas de um material ósseo-substituto são: biocompatibilidade, previsibilidade, aplicação clínica sem riscos trans-operatórios e mínimas reações pós-operatórias, além de aceitação por parte do paciente (SICCA et al, 2000).
2.2.1 Origem
Os biomateriais podem ser obtidos de diferentes origens e classificados como: autógeno, alógeno, aloplástico e xenógeno.
1) Autógeno – Origina-se do mesmo individuo. É considerado a referência (padrão
ouro) devido as suas vantagens biológicas e potencial osteogênico, mas apresenta desvantagens, tais como: morbidade da área doadora e disponibilidade limitada (CONZ; GRANJEIRO; SOARES, 2005; SCHLEGEL et al, 2006; ADEYEMO et al, 2008).
2) Alógeno – Obtido de uma mesma espécie através de banco de ossos humanos.
Apresenta risco de contaminação, necessidade de armazenamento especial e controle rígido de infecção (American Academy of Periodontology - AAP, 2001; SANADA et al, 2003; CONZ;GRANJEIRO; SOARES, 2005).
3) Aloplástico – derivados inorgânicos como o fosfato tricálcio e a hidroxiapatita
esterilização e armazenamento. Já as suas desvantagens incluem graus variáveis de reabsorção, pouca ação em defeitos diafisários, entre outros (SOCCOL et al, 2006).
4) Xenógeno – Obtido de outra espécie. Usualmente de origem bovina, vem
apresentando resultados promissores e mostra-se como uma alternativa à intervenção cirúrgica de uma área doadora (autógeno) ou aos riscos de contaminação e custos com exames laboratoriais (alógeno). No entanto, a capacidade de reparo pode variar de acordo com a forma e tamanho das partículas do material (SANADA et al, 2003; CONZ;GRANJEIRO; SOARES, 2005).
2.2.2 Composição Química
Segundo Gutierres (2008), quanto a sua composição química, os biomateriais podem ser divididos em 4 classes:
1) Metais e ligas metálicas - p. ex.: titânio (ELIAS, 2008).
2) Cerâmicas - p. ex.: materiais cerâmicos à base de fosfato de cálcio, tais como:
fofato tricálcio – TCP (FROTA, 2006) e hidroxiapatita – HA (LIMEIRA JÚNIOR, 2004).
3) Polímeros - p. ex.: poliuretana de mamona (LAUREANO FILHO et al., 2007),
PLLA (ácido poli-L-lático), PGA (ácido poliglicólico) e PLGA (ácido poli-lático-co-ácido glicólico) (SAKATA; ALBERTO-RINCON; DUEK, 2004).
4) Compósitos – p. ex.: compósito de biovidro-polihidroxibutirato (GUERRA NETO;
PAIVA; COSTA, 2005)
2.2.3 Mecanismo de Ação
Quanto ao mecanismo da ação, os biomateriais podem ser classificados em: osteocondutores, osteogênicos, osteopromotores e osteoindutores.
1) Osteocondução – É a habilidade para suportar o crescimento ósseo ao longo de
uma superfície de contato. A capacidade osteocondutora é atribuída ao material, geralmente inorgânico, que orienta a proliferação celular, permitindo a aposição de tecido ósseo originado de células osteoprogenitoras já existentes (SANADA et al, 2003; TUDOR et al, 2008).
2) Osteopromoção – É a habilidade para atuar separando células com
características distintas, como fibroblastos e osteoblastos. Na regeneração tecidual guiada os materiais osteopromotores buscam impedir que fibroblastos proliferem para dentro da região do defeito ósseo em detrimento dos osteoblastos que proliferam mais lentamente (SANADA et al, 2003).
3) Osteoindução – É a habilidade para induzir células mesenquimais indiferenciadas
4) Osteogênese – É a habilidade para estimular a formação de osso diretamente a
partir de osteoblastos, o que é feito geralmente por materiais orgânicos (SICCA et al, 2000).
2.3 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA
Materiais xenógenos vêm sendo pesquisados como biomateriais desde os anos 60, incluindo ensaios clínicos para o preenchimento de defeitos ósseos (MELCHER; DENT, 1962; SCOOP; KASSOUNY; MORGAN, 1966).
O advento de novos biomateriais xenógenos, como o osso bovino que se comporta como promotor da reparação e carreador de fatores de indução óssea, parece representar o futuro da reconstrução de defeitos ósseos. Entretanto, há uma preocupação constante com a apresentação destes biomateriais, tais como: forma e tamanho. O papel de carreador dos fatores de indução óssea potencialmente pode ser desempenhado pelo osso bovino medular ou cortical, macro ou microgranular, desproteinizado ou desmineralizado (CARNEIRO et al, 2005).
O processamento do osso bovino pode resultar em dois tipos distintos de material: o inorgânico e o orgânico. 1) O osso bovino inorgânico é livre de proteínas e células, e está caracterizado pelo elevado conteúdo de hidroxiapatita. A desproteinização é obtida através de tratamento térmico a temperaturas superiores a 3000C, mas quanto mais alta a temperatura, menor a possibilidade de bioabsorção do material. Por outro lado, o tratamento com solventes orgânicos, álcalis e ácidos com concentração e temperatura controlada leva à remoção de células, detritos celulares
e várias proteínas não colágenas, bem como a porção mineral, deixando um arcabouço protéico constituído basicamente de colágeno tipo I e pequena quantidade de fatores de crescimento, como a proteína morfogenética óssea. 2) O osso bovino orgânico, adequadamente processado e desmineralizado, proporciona um material de enxerto poroso constituído principalmente de colágeno bovino tipo I, que apresenta grande homologia com o colágeno humano. Possui, ainda, traços de fatores de crescimento que podem estimular a osteogênese (SANADA et al, 2003).
Wenz; Oesch; Hortst (2001) avaliaram o risco de transmissão da encefalopatia espongiforme bovina - EEB (“doença da vaca louca”) através de biomateriais derivados de osso bovino. Os autores utilizaram o Bio-Oss® e o Osteograf® e concluíram através de evidência teórica e experimental que estes biomateriais não apresentam risco de transmissão de EEB para os pacientes.
Indovina e Block (2002) avaliaram a reparação óssea em alvéolo após a extração de pré-molares superiores e inferiores em cães, utilizando biomateriais derivados de osso bovino inorgânico (Bio-Oss®) e de fosfato de cálcio (embarc® e Bone Source®). Os autores realizaram avaliações clínica e radiográfica com 2, 4, 6 e 8 semanas e, após oito semanas, o osso alveolar foi removido e submetido à avaliação histológica. Todos os alvéolos cicatrizaram sem sinais de infecção. Clinicamente, não houve diferenças entre os grupos. Radiograficamente, o grupo com osso bovino apresentou, juntamente com o controle, uma maior radiopacidade em comparação com os grupos que utilizaram material a base de fosfato de cálcio. Estes pareciam permanecer intactos sem reabsorção e substituição. Na análise histológica, foi observada eventual reação de corpo estranho nos dois grupos com fosfato de cálcio,
onde o alvéolo permanecia predominantemente preenchido pelo material implantado. No grupo controle observou-se formação óssea, assim como no grupo com osso bovino que apresentou neoformação óssea entre as partículas do material remanescente. Portanto, histologicamente, houve diferença significativa dos grupos controle e com osso bovino em comparação aos dois grupos com fosfato de cálcio.
Sanada et al. (2003) avaliaram a biocompatibilidade de blocos de osso bovino esponjoso acelular e desmineralizado (Gen-Ox®). Foram utilizados 30 ratos albinos (Wistar) divididos aleatoriamente em grupos com períodos de 3, 7, 14, 21 e 28 dias. Blocos de 5,0 x 12,0 mm do material foram implantados no músculo abdutor da coxa dos animais. Tomadas radiográficas foram realizadas antes do sacrifício dos animais. Na avaliação histológica dos períodos de 3 e 7 dias, foi evidenciado processo inflamatório agudo, caracterizado pela presença de neutrófilos, reabsorção do coágulo sanguíneo e angiogênese. Entre 14 e 21 dias, houve reabsorção do material implantado e sua substituição por tecido conjuntivo fibroso. Com 28 dias, na maioria dos casos, observaram-se apenas pequenos fragmentos da matriz implantada envolto por tecido conjuntivo. Radiograficamente, não foi evidenciada presença de mineralização. Com base nos resultados, os autores concluíram que o biomaterial derivado da matriz de osso esponjoso bovino desmineralizado em bloco é biocompatível quando implantado em tecido conjuntivo intramuscular de ratos, sendo absorvido e substituído por tecido conjuntivo característico da região, sem qualquer indício de ocorrência de osteogênese ectópica.
Num estudo experimental, Marins et al. (2004), avaliaram a reparação óssea em defeitos de 8,0 mm no osso parietal de ratos, utilizando o osso bovino orgânico
(Gen-Ox®). Os animais foram divididos em dois grupos, onde no primeiro, os defeitos ósseos eram preenchidos por matriz bovina orgânica e no segundo grupo, por coágulo sanguíneo. Os resultados demonstraram que o material testado foi lentamente reabsorvido, favorecendo angiogênese, adesão e migração celular e neoformação óssea a partir das bordas da lesão. Entretanto, alguns animais apresentaram reação granulomatosa de corpo estranho com a presença de inúmeras células gigantes que impediram a neoformação óssea local. Os autores atribuíram este fato, à ausência de desmineralização e à falta de remoção de fatores antígenos durante o processamento do biomaterial. Foi concluído que o osso bovino orgânico, quando bem controlada a qualidade da produção do material, apresenta uma ótima alternativa para a reparação óssea devido à sua alta capacidade osteocondutora.
Thorwarth et al. (2006), num estudo experimental prospectivo, avaliaram a formação óssea da matriz bovina inorgânica (Bio-Oss®) associada ou não ao osso autógeno numa proporção de 3:1. Foram criados defeitos ósseos de 8,0 mm na calota craniana de porcos. A análise histológica identificou osseointegração em ambos os grupos nos tempos avaliados, no entanto, a avaliação microradiográfica demonstrou um significante aumento da neoformação óssea no grupo que fez uso da matriz inorgânica associada ao enxerto autógeno após 6 e 8 semanas. Os autores concluíram que a melhor reparação óssea aconteceu devido à osteoindução promovida por elementos celulares transplantados com o osso autógeno.
Serra-Silva; Albergaria-Barbosa; Mazzonetto (2006) avaliaram clinica e radiograficamente o comportamento da associação de matriz orgânica de osso
bovino (Gen-Ox®) com proteína morfogenética de osso bovino (Gen-Pro®), na proporção 5:1, em comparação ao enxerto de osso autógeno proveniente do ramo mandibular na promoção da reparação óssea no levantamento do seio maxilar. Foram utilizados 10 pacientes com a necessidade de levantamento bilateral do seio menor que 6,0 mm determinado por tomografia computadorizada. Em todos os pacientes, um lado foi determinado como experimental (associação de enxerto bovino) e o outro controle (enxerto autógeno). Após o período de 6 a 11 meses, os implantes eram colocados. A avaliação foi através de radiografia panorâmica e avaliação trans-operatória da formação óssea da área enxertada e estabilidade dos implantes. Os resultados mostraram uma melhor formação óssea e estabilidade inicial dos implantes no grupo controle, embora no grupo experimental, o torque para colocação dos implantes tenha sido maior que 30 N-cm.
Tudor et al. (2008) avaliaram a regeneração óssea em defeitos de 10,0 mm realizados no osso frontal de porcos. Foram utilizados nove animais onde cada um teve dez defeitos, sendo nove divididos para a formação de três grupos experimentais: 1 - osso autógeno, 2 - osso alógeno (Puros®) e 3 - osso bovino (Navigraft®); e um defeito para o grupo controle. Os animais foram observados com 1, 8 e 12 semanas. Com base nos resultados, após 12 semanas, todos os materiais testados promoveram a completa formação óssea do defeito e o grupo controle apresentou aproximadamente 75% de preenchimento ósseo. Através da microradiografia, observou-se, entre os materiais testados, uma taxa de mineralização de 5 a 10% menor em comparação ao enxerto de osso autógeno. Entretanto, não se observou diferença estatística entre os grupos experimentais.
2.4 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM SINTÉTICA
Materiais aloplásticos vêm sendo utilizados no preenchimento de cavidades ósseas na tentativa de induzir reparação óssea. No início dos anos 70, muitos pesquisadores começaram a estudar um grupo de materiais sintéticos constituídos de cerâmicas de fosfato de cálcio. Nos anos 80, uma série de artigos foi publicada, avaliando os diversos aspectos destas cerâmicas. Estes materiais são biocompatíveis, pois não induzem qualquer reação adversa, além de conter cálcio e fosfato, os quais são presentes no tecido ósseo (BUCHAIM et al, 2002).
É possível produzir materiais cerâmicos sintéticos com uma composição semelhante à matriz óssea inorgânica e sem limitações em termos de quantidade disponível. Entre eles, temos: 1) sulfato de cálcio, 2) biovidros e 3) materiais cerâmicos à base de fosfato de cálcio (fosfato tricálcio – TCP, hidroxiapatita – HA, biocompósitos à base de fosfato de cálcio e cimentos de cerâmica injetáveis) (GUTIERRES et al., 2006).
A cerâmica de hidroxiapatita tem sido estudada por tratar-se de uma substância bioativa não tóxica, que provoca pouca reação tecidual, apresentando-se como um importante recurso para a substituição óssea (MOREIRA et al, 2003).
Materiais de fosfato de cálcio podem ser encontrados na natureza (hidroxiapatita de coral) ou sintetizados por métodos de precipitação que utilizam reagentes químicos. A hidroxiapatita, Ca10(PO4)6(OH)2, é a biocerâmica de fosfato de cálcio mais
muitas vezes usado para descrever os materiais de fosfato de cálcio. Geralmente, estas biocerâmicas são aceitas como osteocondutoras e não osteoindutoras (CONZ; GRANJEIRO; SOARES, 2005).
Tem sido mostrado que materiais denominados como hidroxiapatita pura apresentam biocompatibilidade diferente daqueles formados pela mistura de hidroxiapatita e fosfato tricálcio. Resultados preliminares utilizando cultura de células sugerem que a presença de maior porcentagem de microporos (< 10 µm) interfere negativamente com a biocompatibilidade da hidroxiapatita. Tais evidências sugerem que o comportamento biológico destas cerâmicas é dependente de vários fatores, tais como: composição química e características físicas finais do produto (ROSA; SHAREEF; NOORT, 2000).
A hidroxiapatita sintética consiste em um material inorgânico comumente usado em falha óssea e constituinte da fase mineral dos tecidos calcificados. Pode ser utilizada em defeito ósseo sem carga ou em falha onde a carga, estresse de torção ou cisalhamento é neutralizado por implante rígido, como placa e parafusos (SOCCOL et al, 2006).
Orr et al. (2001) avaliaram propriedades mecânicas compressivas de defeitos ósseos de 3,5 mm de diâmetro por 8,0 mm de profundidade confeccionados na porção distal do fêmur de coelhos. Foram utilizados os biomateriais derivados de osso bovino inorgânico (Bio-Oss®) e de hidroxiapatita sintética (Calcitek®) comparados com o grupo controle (sem preenchimento do defeito) e com o grupo anatômico (sem o defeito). Os grupos foram avaliados nos seguintes períodos: osso
bovino inorgânico (2, 6 e 26 semanas), hidroxiapatita sintética (6 e 26 semanas), grupo controle (2, 6 e 26 semanas) e o grupo anatômico (2 semanas). Os resultados mostraram não haver diferença das forças compressivas no período de 2 semanas entre o grupo que utilizou o osso bovino inorgânico e o grupo anatômico. Nos períodos de 2, 6 e 26 semanas, o grupo do osso bovino inorgânico apresentou força compressiva maior que o grupo controle. O grupo da hidroxiapatita sintética teve força compressiva bem maior que o grupo controle e o grupo do osso bovino inorgânico nos tempos de 6 e 26 semanas, apresentando diferença estatística significante. Quanto ao módulo de elasticidade, o grupo do osso bovino inorgânico apresentou valores bem próximos do grupo controle, portanto sem diferença estatística, enquanto que o grupo da hidroxiapatita sintética obteve valores significativamente maiores que os citados grupos.
Buchaim et al. (2002) analisaram a reparação óssea em defeitos ósseos realizados na tíbia de ratos Wistar submetidos ao alcoolismo crônico experimental. No grupo experimental, os animais recebiam álcool etílico diluído a 6% como dieta líquida, sendo subdivididos em experimental-1 onde o defeito permanecia sem preenchimento e experimental-2 quando preenchido por hidroxiapatita sintética associada ao β-tricalcio-fosfato (Gen-Phos®), na proporção de 70 e 30%, respectivamente. O grupo controle diferiu do experimental apenas na dieta líquida constituída por água, apresentando controle-1 (defeito sem preenchimento) e controle-2 (preenchido por Gen-Phos®). Os animais do grupo experimental foram gradualmente adaptados ao álcool, recebendo uma dieta líquida de álcool etílico a 2% na primeira semana, a 4% na segunda e 6% na terceira. Após o período de adaptação, os ratos receberem a dieta líquida de álcool etílico a 6% por 60 dias para
serem submetidos aos procedimentos cirúrgicos. Todos os grupos foram avaliados microscopicamente nos tempos de 10, 20 e 40 dias. Os resultados mostraram que uma dieta alcoólica conduziu a uma neoformação óssea mais discreta de todos os espécimes em todos os períodos observados, causando preenchimento ósseo incompleto da cavidade cirúrgica após 40 dias de reparo. A neoformação óssea foi mais favorável em alguns animais que tiveram a implantação do Gen-Phos® após 20 dias de reparo.
Horch et al. (2006) estudaram o efeito a longo prazo da cerâmica de beta-tricálcio fosfato (β-TCP - Cerasorb®
) em diferentes sítios da reconstrução alveolar. Cento e cinqüenta e dois (152) pacientes foram avaliados, onde a maioria das indicações para o β-TCP foi para o preenchimento de cistos mandibulares (n=52), seguido de fissura alveolar (n=38), defeitos periodontais (n=24) e aumento de assoalho do seio maxilar (n=16). Nos defeitos maiores que 2,0 cm de diâmetros, o β -TCP foi combinado com enxerto autógeno esponjoso, na proporção de 1:1, proveniente da região retro-molar, da tuberosidade ou do mento mandibular. Avaliação clínica, radiológica e por ultrasonografia (na verificação da presença de micropartículas do material nos nódulos linfáticos regionais) foi realizada com 4, 12 e 52 semanas no pós-operatório. Em 16 casos, foram realizadas biópsias que demonstraram completa regeneração óssea. Este fato foi possível devido à necessidade de um segundo procedimento cirúrgico para remoção de material de fixação (placas e parafusos) e/ou para inserção de implantes dentários. Distúrbios na cicatrização foram observados em 9,2% dos pacientes, perda parcial do material em 5,9%, enquanto que a perda total em 2%. Devido à sua versatilidade, baixa taxa de complicações e
bons resultados ao longo prazo, o β-TCP sintético apresentou-se como adequado material para o preenchimento de defeitos ósseos em região alveolar.
Fujita et al. (2003) analisaram as diferenças na osteogênese e reabsorção da hidroxiapatita (HA) e do β-tricálcio-fosfato (β-TCP ) sob a forma de blocos com macro e microporos. Os materiais foram implantados entre o osso parietal e o periósteo de ratos Wistar e avaliados com 1, 2, 4, 8 e 24 semanas. Os resultados obtidos demonstraram que a força compressiva foi maior para a HA e a concentração de íons Ca foi maior para o β-TCP nos períodos de 4 e 8 semanas. Na análise histomorfométrica, observou-se que a neoformação óssea aumentou com o tempo, porém foi significantemente maior nos poros do bloco de HA em comparação ao β-TCP em 24 semanas. No mesmo período, houve uma grande diminuição na quantidade remanescente do bloco de β-TCP, apresentando diferença significativa quando comparado a HA que se manteve praticamente estável durante todo este período. Os autores concluíram que os blocos de HA são mais adequados, considerando o modelo utilizado, para implantação do tipo onlay.
Miranda et al. (2005) realizaram um estudo experimental comparativo de enxerto ósseo orgânico (osso autógeno – crista ilíaca) e material inorgânico (Osteosynt® - hidroxiapatia + tricálcio-fosfato) em fraturas de rádio em coelhos. Foram utilizados 20 animais, divididos em 2 grupos, que se submeteram a remoção de um segmento osteoperiosteal em todo seu diâmetro com 1 cm de comprimento. No grupo 1, colocaram-se fragmentos de enxerto orgânico e no grupo 2, fragmentos do material inorgânico. Os animais foram sacrificados com 15, 30, 45, 60 e 75 dias. Na avaliação radiográfica, foi possível observar a completa reparação óssea em todos
os grupos, sendo de forma mais rápida com menor tempo de evolução no grupo 2 que utilizou o osso inorgânico; fato esse confirmado pela análise histológica. Como conclusão, os autores afirmam que o material ósseo inorgânico pode ser usado de rotina em cirurgia ortopédica, proporcionando uma cicatrização óssea precoce.
Soccol et al. (2006) avaliaram os biomateriais de hidroxiapatita de cálcio sintético (HA) e submucosa de intestino delgado porcina (SID) no preenchimento de defeitos ósseos de 0,75 x 1,5 cm criados em mandíbula de ratos Wistar. Foram utilizados 24 animais divididos aleatoriamente em dois grupos: 1 (HA) e 2 (SID), sendo padronizado à esquerdo o preenchimento do defeito com o material e à direita o não preenchimento serviu de controle. Após 40 dias, procedeu-se a eutanásia dos animais e por conseqüente a análise macroscópica e histomorfométrica das peças. Os resultados evidenciaram uma melhor neoformação óssea com a utilização da hidroxiapatita (76,64%) quando comparado ao grupo da submucosa de intestino delgado porcina (63,64%). Entretanto, os dois biomateriais mostraram-se efetivos quando comparados ao controle.
Fellah et al. (2008) estudaram a osteogenecidade da cerâmica de cálcio fosfato bifásico - CFB (MBCP®), constituída por hidroxiapatita + β -tricálcio fosfato na proporção de 60/40, em comparação ao osso autógeno (OA). A cerâmica foi sinterizada nas temperaturas de 1050, 1125 e 1200 oC, produzindo diferentes micro-porosidades. Os materiais foram implantados em locais ectópicos (músculo para-espinhal) e ortotópicos (osso femural) de cabras e analisados nos períodos de 6 e 12 semanas. Para implantação intramuscular, foram criados 4 diferentes grupos: 1) OA, 2) CFB 1050 oC, 3) CFB 1125 oC e 4) CFB 1200 oC. No preenchimento dos
defeitos ósseos além dos grupos anteriormente citado foi adicionado um quinto para controle (sem preenchimento) Com base nos dados obtidos, a propriedade de osteoindução não foi observada em nenhum dos grupos estudados após os períodos de observação nos locais ectópicos (musculatura para-nasal). Nos ossos femorais, os materiais foram colocados dentro de um cilindro de politetrafluoroetileno e implantados em defeitos críticos de 9,0 mm de diâmetro por 10,0 mm de profundidade. Para os grânulos de CFB 1050 e 1125 oC, observou-se formação óssea tanto no período de 6 quanto de 12 semanas. Para o grânulo de 1200 oC, houve presença de mineralização discreta apenas em 12 semanas. Os defeitos sem preenchimento não apresentaram formação óssea. Os enxertos autógenos foram completamente reabsorvidos nos dois locais estudados. Desta forma, os autores concluíram que o biomaterial ósseo de origem sintética pode apresentar estabilidade e propriedades osteogênicas superiores que o enxerto autógeno em defeitos críticos confeccionados em osso femoral de cabras.
3 PROPOSIÇÃO
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar histomorfometricamente a reparação óssea após a utilização de biomateriais de origem bovina e sintética em defeitos de 5,0 mm de diâmetro na calvária de ratos
Wistar nos períodos de 15, 30 e 45 dias.
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Avaliar comparativamente o processo de reparo de defeitos ósseos padronizados em calvária de ratos Wistar, submetidos a:
1) Biomaterial de origem bovina (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica esponjosa e colágeno bovino).
4 HIPÓTESES
HIPÓTESE H0
Os biomateriais de origem bovina e sintética não estimulam reparação óssea em defeitos de 5,0 mmde diâmetro confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.
HIPÓTESE H1
Os biomateriais de origem bovina e sintética estimulam reparação óssea em defeitos de 5,0 mmde diâmetro confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.
HIPÓTESE H2
O biomaterial de origem bovina estimula uma melhor reparação óssea em comparação ao de origem sintética em defeitos de 5,0 mm de diâmetro confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.
HIPÓTESE H3
O biomaterial de origem sintética estimula uma melhor reparação óssea em comparação ao de origem bovina em defeitos de 5,0 mm de diâmetro confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.
5 MATERIAIS E MÉTODOS
A presente pesquisa baseou-se num estudo experimental que foi realizado no Laboratório de Experimentação Animal do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba – LEA / CCS / UFPB.
5.1 SELEÇÃO E TAMANHO DA AMOSTRA
Foram utilizados 36 ratos machos albinos (Rattus norvegicus da família Muridae, da variedade Wistar), adultos jovens, com massa corporal variando entre 270 e 370g, advindos do Biotério do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba – LTF / UFPB (Figura 1). O tamanho da amostra configurada foi baseado na literatura científica correlata, na qual se pôde constatar um número de animais compatível com a necessidade de resultados confiáveis, do ponto de vista de significância estatística, bem como com o respeito às questões bioéticas (LIMEIRA JÚNIOR et al., 2003; LIMEIRA JÚNIOR, 2004).
Figura 1 – Rato Wistar, macho albino, adulto jovem.
5.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO DA AMOSTRA
Clinicamente, os animais que apresentassem lesão da dura-máter, infecção, deiscência da sutura e exposição do enxerto, bem como, alguma patologia no transcorrer dos períodos de experimentação seriam excluídos e substituídos. Do ponto de vista histológico, seriam excluídos os espécimes que apresentassem perda do material testado durante o processamento da amostra e os com interposição de tecido mole (tecido intracraniano) na área avaliada.
5.3 ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS
Os animais foram acondicionados em gaiolas plásticas atapetadas com maravalha de pinus, sendo 3 animais por gaiola (Figura 2). Os animais foram mantidos no Laboratório de Experimentação Animal do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba – LEA / CCS / UFPB na temperatura de 23ºC ±
2ºC, ciclo claro-escuro de 12 horas. A limpeza das gaiolas foi efetuada segundo o protocolo do Laboratório.
Figura 2 - Animais acondicionados em gaiolas plásticas
5.4 ALIMENTAÇÃO DOS ANIMAIS
Os animais receberam ração sólida peletizada2
Os 36 ratos foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos G1 (bovino) e G2 (sintético) com 6 animais para os períodos de 15, 30 e 45 dias (Quadro 1). Em cada animal, foram confeccionados dois defeitos de 5,0 mm de diâmetro no osso parietal em cada lado da sutura sagital, de forma que o lado esquerdo correspondeu ao experimento (G1A - preenchido pelo osso de origem bovina ou G2A – osso de
com alto teor de proteína (20 a 27%) e água ad libitum.
5.5 GRUPOS DE ESTUDO
2
origem sintética) e o lado direito ao controle (G1B ou G2B - preenchido pelo coágulo sanguíneo).
Quadro 1 – Divisão dos grupos de acordo com a origem do biomaterial e o período de observação
G 1 G 2
DIAS (Origem Bovina) (Origem Sintética)
15 6 6
30 6 6
45 6 6
TOTAL 18 18
5.6 IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS
Cada gaiola foi identificada individualmente, bem como cada animal, onde constaram: nome do experimento, responsável pela pesquisa, grupo, massa corporal do animal, datas do nascimento, cirurgia e sacrifício. A identificação foi realizada em formulário especifico e com lápis pincel na cauda do rato, onde cada animal conteve marcações específicas, identificando seu grupo (Apêndice).
5.7 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Os procedimentos de anestesia geral e técnica cirúrgica seguiram os princípios descritos por Frota (2003, 2006), a saber:
5.7.1 Anestesia Geral
Para a anestesia geral dos animais, foi utilizado Cloridrato de Quetamina a 5% (60-90 mg/kg)3 e Cloridrato de Xilazina a 2% (4-8 mg/kg)4
Figura 3 - Tricotomia e imobilização em mesa cirúrgica específica
e aplicados no músculo da coxa do animal, obtendo-se um período de aproximadamente duas horas de anestesia. Imediatamente após a anestesia, foi realizada a tricotomia da região mediana da calota craniana dos ratos e os animais foram imobilizados em uma mesa cirúrgica específica pela região temporal através de pinos de contensão lateral, bem como pelos incisivos superiores e inferiores em local específico (Figura 3). 3 Vetanarcol® - König 4 Dorcipec® - Vallée
5.7.2 Técnica Cirúrgica
Primeiramente, foi realizada a anti-sepsia da região da calota craniana, com Polivinilpirrolidona-iodo5 a 10% na região a ser incisada. Após aposição dos campos operatórios, promoveu-se a infiltração anestésica local de 0,1ml de Cloridrato de Lidocaína com Adrenalina6
Figura 4 - Anti-sepsia e infiltração anestésica local
, na concentração de 1:200.000 (Figura 4). Este procedimento foi adotado, com o intuito de diminuir o sangramento no trans-operatório e promover um maior conforto no pós-trans-operatório imediato.
Em seguida, realizou-se uma incisão linear através da pele e do periósteo, indo da região fronto-nasal a protuberância occipital externa, com o uso de uma lâmina de bisturi7 número 15, montada em cabo de bisturi8 do tipo Bard-Parker número 3 (Figura 5). Com o destaca-periósteo9
5
Povidine Degermante® - Ceras Johnson
6
Xylocaína® com Epinefrina 1:200.000 – Astra Zeneca
7
Feather Safety Razor CO., LTD. Medical Division
8
Bard-ParkerTM
9
Quinelato Schobell Industrial Ltda
de Molt, efetuou-se o descolamento do retalho e o seu afastamento através de descoladores delicados (Figura 6).
Figura 5 - Incisão linear através da pele e periósteo
Figura 6 – Exposição da calvária após descolamento e afastamento do retalho
Através de uma broca trefina10 de 5,0 mm de diâmetro, foi realizada uma ostectomia, utilizando uma peça de mão reta para micro motor elétrico11 acionado a uma velocidade de 30.000 rpm. A irrigação foi externa com uso de soro fisiológico12
10 Sistema de implantes PPMM 11 Beltec® - modelo LB 100 12
Soro Fisiológico® - Darrow
0,9%, evitando, assim, um superaquecimento e subseqüente necrose óssea. A ostectomia criou um defeito ósseo circular de 5,0 mm de diâmetro e de espessura total (aproximadamente 0,5 mm), no lado esquerdo (localização mais caudal) e direito
(localização mais cefálica), na região parietal, tendo-se o cuidado de não comprometer a dura-máter. O preenchimento do defeito ósseo no lado esquerdo (experimento) foi feito com biomaterial de origem bovina (grupo G1) ou sintética (grupo G2) e no lado direito (controle) com coágulo sanguíneo. (Figuras 7 e 8).
Figura 7 – Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo: biomaterial bovino (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica esponjosa e colágeno bovino)
Figura 8 – Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo: biomaterial sintético (cerâmica de hidroxiapatita + β-tricálcio-fosfato)
Por último, foi confeccionada a sutura interrompida simples para o periósteo e a sutura contínua simples para a pele foi confecionada com o fio de poliamida13
Figura 9 – Sutura interrompida simples do periósteo (mononylon 5-0) (mononylon 5-0) (Figuras 9 e 10).
Figura 10 – Sutura contínua simples da pele (mononylon 5-0)
13
5.8 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA
Os biomateriais substitutos ósseos de origem bovina e sintética utilizados apresentavam a seguinte composição, respectivamente:
Gen-mix®14
Gen-phos®
Material composto, microgranular (0,25 - 1,0 mm), liofilizado, contendo osso bovino desproteinizado e osso bovino desmineralizado.
Composição:
1. Matriz orgânica de osso bovino cortical (0,5 cc) 2. Matriz inorgânica de osso bovino esponjoso (0,5 cc) 3. Colágeno bovino aglutinante (0,5 cc)
15
Material ósseo cerâmico bifásico, biocerâmica sintética, de alta pureza, porosa e microgranular (0,5 – 0,75 mm)
Composição:
1. Hidroxiapatita porosa absorvível (60 - 70%) 2. β-tricálcio-fosfato (30 - 40%)
14
Genius - Baumer S.A., Mogi Mirim/SP.
15
5.9 CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS
Os animais foram mantidos a temperatura corpórea, sendo acondicionados em ambiente sem ar condicionado, com o intuito de o ambiente permanecer aquecido no período pós-anestésico, evitando assim, hipotermia corporal, depressão cardio respiratória e óbito (HARKNESS, WAGNER, 1993). Foi efetuada a limpeza da ferida cirúrgica, para que os animais que despertassem primeiro da anestesia não ficassem estimulados a praticar o canibalismo, devido ao odor exalado pelo sangue presente na ferida cirúrgica. A dieta foi mantida (FIGUEIREDO, TAKITA, GOLDENBERG, 1997).
5.10 OBTENÇÃO DOS ESPÉCIMES APÓS OS PERÍODOS DE 15, 30 E 45 DIAS
Após a realização da anestesia geral, o procedimento cirúrgico para obtenção dos espécimes iniciou com uma incisão trapezoidal de espessura total, abrangendo os tecidos moles da região parietal da calota craniana (Figura 11).
