Neuroquímica TH

Na ZI do mocó, células e fibras IR-TH foram detectadas na ZIr, sendo possível visualizar poucas células marcadas (Figura 5A). Estes neurônios apresentam formato triangular e irregular, com axônios de pequeno tamanho (Figura 5B).

Figura 5: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, mostrando a imunorreatividade para TH em A (tracejado em preto) e em B detalhando a morfologia dos neurônios e das extensões IR-TH. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra: 100μm em A e 30μm em B.

33

NOS

A ZI do mocó apresenta neurônios IR-NOS em todas as subdivisões da ZI, com formato ovoide e fusiforme, com pequenas varicosidades (Figura 6D). Na ZIr são visualizadas células IR-NOS concentradas na porção medial (Figura 6A). A ZIv possui mais células marcadas em comparação com a ZId, localizados principalmente na região lateral, próximo ao rt (Figura 6B). Na ZIc, neurônios IR-NOS concentram-se na região lateral, com poucas células presentes na região medial (Figura 6C).

Figura 6: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, mostrando a imunorreatividade contra NOS nas subdivisões da ZI (tracejado em preto) seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). D representa a caixa delimitada em B. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra: 300μm (A-C), 40μm (D).

34

5-HT

Na ZI do mocó identificamos a marcação de fibras e varicosidades IR-5-HT em todas as subdivisões (Figura 7 A-C). Na ZId e ZIv, uma maior quantidade de fibras e varicosidades foram detectadas (D).

Figura 7: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, mostrando a imunorreatividade contra 5-HT nas subdivisões da ZI (tracejado em preto) seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). Em D, ampliação da caixa em B detalhando as fibras IR-5-HT na ZId. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra: 1mm A-C e 40μm em D.

35

GFAP

Células IR-GFAP foram encontradas na ZIr (Figura 8A), ZId (Figura 8B) e ZIc (Figura 8C), enquanto que na ZIv a marcação foi negativa (Figura 8B). Células estreladas com pequenas radiações estão presentes nas 3 regiões marcadas, mas na ZIr também detectamos células maiores, de formato ovoide (Figura 8D).

Figura 8: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, mostrando a imunorreatividade contra GFAP nas subdivisões da ZI (tracejado em preto) seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). D representa a caixa delimitada em A. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra 300μm A-C e D 40μm.

36

CB

Células IR-CB foram detectadas na ZIr (Figura 9A), apresentando formato alongado e irregular (Figura 9B). Na ZId, ocorre uma grande quantidade de neurópila, enquanto a ZIv há uma menor quantidade (Figura 9B). Na ZIc, ocorre uma concentração de neurópila na porção lateral, mesma região onde encontra-se a projeção retiniana (Figura 9C).

Figura 9: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, mostrando a imunorreatividade contra CB nas subdivisões da ZI (tracejado em preto) seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). D representa a caixa delimitada em A. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra 100μm em A, 300μm em B e C, D em 40μm.

37

CR

Neurônios IR-CR apresentam formato ovoide, localizados na ZIr, ZId e ZIc. Na ZIr, ocorre uma concentração desses neurônios próximos ao mt (Figura 10A). Na ZId detectamos grande marcação por toda sua extensão. Em contrapartida, a ZIv não apresenta nenhuma imunorreatividade para CR (Figura 10B e D). Na ZIc, os neurônios estão esparsamente distribuídos em toda sua extensão (Figura 10C).

Figura 10: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, mostrando a imunorreatividade contra CR nas subdivisões da ZI (tracejado em preto) seguindo a sequência rostral (A), médio (B) e caudal (C). D representa a caixa delimitada em B. Abreviações: vide lista de abreviações. Barra: 500μm (A-C), 120μm (D).

38

PV

Células e neurópila IR-PV foram detectadas na região medial da ZIr (Figura 11A) e intermédia da ZIc (Figura 11C), apresentando formato ovoide e irregular (Figura 11B).

Figura 11: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do mocó, mostrando a imunorreatividade contra PV na ZIr em A e ZIc em C. Em B corresponde ampliação da caixa delimitada A.Abreviações: vide lista de abreviações. Barra: _100μm (A e C), 40μm (B).

39 Tabela 2: Resumo esquemático da distribuição das substâncias neuroativas nas subdivisões da ZI do mocó.

Substância/Divisão ZIr ZId ZIv ZIc

Projeção da retina(CTb) - - - + TH + - - - NOS + - + + 5-HT (fibras) + + + + GFAP + - + - CB + - - - CR + + - + PV + - - +

40

5. DISCUSSÃO

5.1 Citoarquitetura

A ZI do mocó está dividida em 4 porções, de acordo com a análise citoarquitetônica observada em nossos resultados. Devido a grande diversidade celular da ZI e algumas dificuldades em delimitar claramente suas subdivisões, o número destas varia de autor para autor: de 2 a 6 em ratos, entretanto, os estudos mais recentes consideram apenas 4, de 2 a 4 em macacos e superior a 5 em gatos (Mitrofanis, 2005).

Em rato, a ZI é classicamente subdividida em quatro regiões: rostral, dorsal, ventral e caudal. Na região rostral corre uma predominância de células fusiformes, com raras células ovoides. A região dorsal possui células ovoides com tamanho médio, enquanto que na ventral as células são densamente agrupadas e com formato fusiforme. Por fim, a região caudal apresenta células de tamanho pequeno a médio com formatos fusiforme, ovoide e multipolar, podendo também apresentar células multipolares com grande tamanho (Kolmac e Mitrofanis, 1999; Power et al, 2001) Em um estudo que focou somente as porções dorsal e ventral, foram detectados neurônios com morfologia bipolar e fusiforme, com grandes dendritos (Trageser e Keller, 2006).

Na ZI do cachorro, foram delimitadas 5 regiões, rostral, dorsal, ventral, caudal, e uma extensão do nível rostral, denominada porção dorsolateral. Esta porção dorsolateral é típica em carnívoros, apesar de não ter sido identificada no furão. Os neurônios têm diversos formatos e tamanhos em todas as porções, mas com prevalência de neurônios de tamanho intermediário e formato fusiforme na porção rostral, formato ovoide de pequeno tamanho na porção dorsal, formato triangular de tamanho intermediário na porção ventral, e nas porções dorsolateral e caudal não houve uma prevalência de um tamanho ou formato específico (Gorbachevskaya e Chivileva, 2008).

Apesar de haver diferenças entre as células, a delimitação dessas porções é complicada, sobretudo nas porções rostral e caudal (Mitrofanis, 2005). Devido a essa dificuldade de delimitação, vários autores consideram caracteríticas neuroquímicas e funcionais para delimitar a ZI (Kuzemensky, 1977; Kawana e Watanabe, 1981; Romanowskiet al, 1985; Nicolelis et al, 1995). A ZI apresenta uma riquíssima diversidade neuroquímica, sendo detectadas mais de 20 substâncias neuroativas, e por isso estas vem sendo utilizadas para auxiliar a delimitação das bordas e subdividir a ZI em porções. Por exemplo, a PV é encontrada em células localizadas na porção ventral da ZI, enquanto que a NOS é encontrada na porção dorsal no rato (Mitrofanis, 2005).

41 Aspectos funcionais, como já dito anteriormente, também auxiliam na delimitação da ZI. Estudos realizados com traçadores neuronais retrógrados e anterógrados demonstram que a região dorsal da ZI apresenta grande conexão com o CS (Mitrofanis, 2005), enquanto que a regiaão ventral conecta-se com o núcleo rubro (Mitrofanis, 2002a) e com regiões centrais no processamento auditivo (Mitrofanis, 2002b). A divisão da ZI, levando em conta apenas aspectos funcionais, mostra a delimitação de subsetores funcionais específicos. Os subsetores mais bem estudados são o visual (Power et al, 2001) e o auditivo (Mitrofanis, 2002b), e esses subsetores são delimitados de acordo especificamente com os estudos de projeção levando em conta outras regiões encefálicas envolvidas com a respectiva função, como por exemplo o CS, GLD e córtex occipital para a visão, e o núcleo coclear, GLV, Coliculo inferior e córtex temporal para a audição, todas essas se projetando para a ZI, e mostrando um padrão convergente para regiões específicas. Isso mostra que a ZI é um importante centro de convergência de diversas informações sensoriais, uma característica muito importante para uma estrutura envolvida em tantas funções distintas de controle hormonal, fisiológico e locomotor. É importante ressaltar que outros subsetores também foram encontrados, como o somatossensorial, motor e límbico, além das conexões entre os setores da ZI, além da conexão com a ZI contralateral (Mitrofanis, 2005), mostrando a enorme complexidade dessa estrutura, e talvez por isso explicando sua riqueza citoarquitetônica e neuroquímica.

42

5.2 Projeção retiniana

Os estudos sobre projeções retinianas fornecem uma melhor definição do trajeto axonal, além de possibilitar uma visualização detalhada dos terminais, algo fundamental para compreensão do funcionamento de diversos sistemas que utilizam a informação visual (Rouiller e Welker, 2000). A CTb, a subunidade B da toxina colérica, é um traçador axonal, altamente sensível, que atual tanto retrogradamente como anterogradamente (Angelucci et al, 1996; Gaillard et al, 2013). Sua utilização como traçador das vias retinianas tem sido amplamente empregada em diversos animais, como pombo (Schimizu et al, 1994), primatas (Nakagawa et al, 1998; Costa et al, 1999; Mitrofanis et al, 2004; Cavalcante et al, 2005; Engelberth et al, 2008; Lima et al, 2012) e roedores (Youngstrom, 1991; Abrahamson e Moore, 2001;Mitrofanis, 2005; Gaillard

et al, 2013). No mocó, vários alvos retinianos já foram detectados utilizando CTb, como

o NSQ e FIG (Nascimento Jr et al, 2010a), MD (Sousa, 2013; Nascimento Jr et al, 2010b), PVT (Nascimento Jr et al, 2008), trabalhos estes que comprovam a eficácia da CTb para estudos de traçados axonais nesta espécie. Em relação à ZI, detectamos a presença de fibras e terminais IR-CTb na porção lateral da ZIc.

Em gatos, Matteau (2003) detectou fibras e terminais imunorreativos nas porções medial e lateral da ZI. A morfologia dos axônios neste núcleo variou dependendo se a entrada foi localizada no lado contralateral ou ipsilateral. Na ZI contralateral, as fibras possuem configuraçãosemelhante a cordas, com varicosidades de tamanho médio, enquanto que a ZI ipsilateral continham fibras curtas e varicosidades ao longo de seu eixo. Em ambos os lados da ZI, os axônios apresentam pequeno calibre. Em roedores, vários estudos demonstram projeções retinianas alcançando a ZI. Em hamster, a porção medial da ZI recebe projeções da retina em forma de fascículos. O autor sugere que a ZI recebe informações fóticas da retina e as integra com informações do sistema de temporização circadiana, ambos atuando na modulação do comportamento e da fisiologia (Youngstrom et al, 1991). Em camundongos, fibras retinianas na ZI foram mostradas, mas não delimitaram a porção retinorecipiente (Abrahamson e Moore, 2001). Em ratos, um estudo utilizando traçadores retrógrados e anterógrados mostrou que região lateral das porções dorsal e caudal são retinorrecipientes da ZI, além das outras principais regiões visuais como o córtex occipital, CS e GLD. Este estudo comprovou a existência de um subsetor específico da ZI para a visão, localizado na porção lateral da porção dorsal e caudal. Acerca deste

43 achado, sugere-se uma participação da ZI no processamento visual, especificamente em relação aos movimentos dos olhos e da cabeça e de comportamentos sócio-sexuais (Power et al, 2001). No rato do Nilo (Arvicanthis niloticus), uma pequena projeção retiniana foi encontrada na porção dorsolateral da ZI (Gaillard et al, 2013). No sagui, fibras e terminais IR-CTb foram detectadas na região ventral da porção caudal da ZI, apresentando varicosidades (Lima, 2008).

Como já destacado na introdução, a ZI apresenta conexão com os principais centros visuais, como o CS, GLD e córtex occipital. Entretanto, os estudos apontam que a ZI é um ponto de integração em que a informação fótica atua para modular os movimentos dos olhos e da cabeça, relacionada com a focalização ideal da imagem na retina (Moschovakis, 1996; Mitrofanis, 2005), ou seja, não está diretamente ligado à formação de imagem. Diversos estudos com o mocó (Nascimento Jr et al, 2010a; Nascimento Jr et al, 2010b; Nascimento Jr et al, 2008) verificaram várias semelhanças hodológicas, neuroquímicas e de projeções retinianas com outros roedores em outras regiões do sistema nervoso, entretanto estudos comportamentais e estudos hodológicos mais específicos são necessários para a compreensão desse mecanismo visuomotor, bem como auxiliar a responder sobre aspectos evolutivos e ecológicos do mocó em seu habitat natural. Além de estudos dessa natureza, um estudo anatômico do olho e do crânio mostram diversas características que permite a identificação de adaptações de cada espécie ao seu campo visual, o qual é peculiar para cada nicho temporal. O mocó tem olhos laterais situados em órbita óssea bem constituída e musculatura extrínseca bem diferenciada, pupila em fenda vertical e cristalino com ~45% do diâmetro axial do olho. Características estruturais, neuroquímicas, bem como a distribuição de cones S e L sugerem quem o mocó apresenta um maior ganho de sensibilidade à luz em detrimento de uma melhor resolução da imagem, sendo compatível com seu padrão de atividade crepuscular (Oliveira, 2013), dados comportamentais encontrados no trabalho de Sousa e Menezes (2006). O estabelecimento dessa informação reforça a importância de descrever a funcionalidade da ZI em função do nicho temporal explorado pelo mocó. Vale novamente o destaque que as fibras IR-CTb foram encontradas na ZIc, um indício inicial que caso exista um subsetor visual no mocó, este é localizado em uma região diferente do rato, mostrando uma variabilidade no contexto morfológico entre esses roedores.

44 No contexto das características sobre como as informações aferentes chegam em seus alvos, diversos estudos demonstraram que a morfologia das fibras axonais e dos terminais sinápticos apresentam diferenças importantes, e que essas diferenças também refletem em diferenças funcionais, sobre como as informações são transportadas e processadas. Fibras Classe I, ou Drivers, possuem terminais de grande tamanho, com alta capacidade de potenciais excitatórios pós-sinápticos (PEPS) e ativam receptores ionotrópicos, e no sistema visual, estas fibras são presentes em núcleos talâmicos específicos para a formação de imagens, como o GLD, enquanto que Fibras classe II, ou modulators, possuem terminais de pequeno tamanho, baixa capacidade de disparo de PEPS e que ativam receptores glutamatérgicos metabotrópicos (Shermam e Guillery, 2011). As fibras retinianas da ZI do mocó são de pequeno calibre, e mais de 60% de suas varicosidades encontram-se no eixo dessas fibras, ou seja, essa projeção retiniana é composta por fibras do tipo II, com predominância de varicosidades do tipo botões de passagem. Esses dados demonstram que a ZI recebe informação direta da retina, mas não está envolvida com a formação de imagem, usando esta informação para outras finalidades.

A ZI é uma importante estação de processamento e retransmissão de informações, e essa projeção retiniana é um indício de que a ZI utiliza informação fótica de forma a orientar e regular comportamentos, juntamente com outras propriedades inerentes de disparo espontâneo enquanto o animal está em atividade (Mitrofanis, 2005; Trageser e Keller, 2004; Trageser et al, 2006). Isso é interessante principalmente quando consideramos o aspecto de locomoção, onde a ZI pode ter uma maior atividade durante o período crepuscular, ajustando e otimizando as atividades do mocó nesse período onde o mocó apresenta pico de atividade, e tendo menor atividade durante os períodos com atividade locomotora reduzida. Como já dito, o mocó apresenta uma visão que privilegia a detecção de luz em sacrifício de uma melhor resolução da imagem, e considerando o nicho temporal explorado pelo mocó e seu nível trófico na cadeia alimentar da caatinga, onde ocupa níveis primários, é importante para a sobrevivência do animal que centros regulatórios temporais, fisiológicos, locomotores e comportamentais, como a ZI, obtenham uma importante pista ambiental como a luz para orquestrar o funcionamento do animal, e veremos adiante como a complexa rede neuroquímica da ZI pode auxiliar nesse funcionamento.

45

5.3 Neuroquímica TH

A DA é uma substância resultante da ação da enzima DOPA-descarboxilase sobre a di-hidroxi-fenilalanina (DOPA), a qual deriva da tirosina por ação da TH (Marín

et al., 2005; Chen et al., 2008). É importante considerar que, nos últimos anos, a

expressão de TH em amostras encefálicas tem sido amplamente utilizada como marcador molecular de DA neuronal, embasado por evidências provenientes de estudos com ferramentas fisiológicas, hodológicas, farmacológicas, clínicas e de biologia molecular, permitem assegurar que os grupamentos neuronais imunorreativos a TH no mesencéfalo, diencéfalo, telencéfalo e retina são constituídos por neurônios produtores de DA e, portanto, a imunorreatividade a TH pode ser considerada um marcador molecular confiável para identificação de grupamentos dopaminérgicos (Prakash e Wurst, 2006).

Neste estudo, foram visualizados neurônios IR-TH na região A13, que está medialmente à ZIr, e também de poucos neurônios IR-TH na ZIr. Esses neurônios possuem formato triangular e irregular (Figura 5A e B). De acordo com Abrahamson e Moore (2001), a ZI é considerada um grupamento dopaminérgico (região A13), que recebe projeção do PVT, ou região A14. Todas essas regiões apresentam conectividade e propriedades farmacológicas dos sistemas dopaminérgicos nigroestriatal e mesolímbico (Tonelli e Chiaraviglio, 1995). Outros estudos sugerem que esses neurônios são responsáveis pelo controle de diversas funções hormonais, como a inibição da liberação de prolactina, a secreção do hormônio luteinizante e do hormônio de concentração de melanina, além de ser modular a ingestão hídrica e alimentar (Sita et

al, 2003). Alguns trabalhos mostram que a ZI apresenta conectividade dopaminérgica

com regiões hipotalâmicas laterais através de estudos com fluorescência (Bjorklund et

al, 1975) e que ratos com lesão na ZI comem menos que ratos controle (McDermott e

Grossman, 1980). Assim, é provável que neurônios IR-TH da ZI possam estar envolvidos no controle de ingestão alimentar.

Desde o estudo de Mundinger em 1965, que verificou que a lesão cirúrgica da ZI alivia os déficits motores característicos da doença de Parkinson, alerta-se para o interesse desta região com esta doença. Estudos mais recentes, com estudos eletrofisiológicos e com citocromo oxidase, um marcador de atividade metabólica, que

46 existe uma hiperatividade da ZI em ratos parkinsonianos (Perier et al, 2000). Além disso, a estimulação de alta frequência da ZI melhora o tremor em pacientes com esclerose múltipla, bem como a acinesia e bradicinesia em Parkinsonianos. Esses resultados iniciais indicam que esta é uma região chave na geração de circuitos de movimentos, e que a sua atividade anormal contribui para os sintomas da doença de Parkinson. No entanto, há muito que não entendemos desse circuito emcasos normais, sendo assim necessário um maior conhecimento acerca de ser funcionamento (Heise e Mitrofanis, 2004), e expandir o conhecimento acerca das células IR-TH, bem como suas características, citoarquitetura e projeções, é fundamental.

Um trabalho realizado em nosso laboratório delimitou os núcleos dopaminérgicos do mocó, com maior ênfase nos núcleos dopaminérgicos mesencefálicos: Zona retrorubral, SN pars compacta e Área Tegmentar Ventral. Através da tecnica de imunohistoquímica, viu-se que neurônios IR-TH nessas regiões apresentam formato bipolar, multipolar, ovoide e triangular (Cavalcanti, 2011), características semelhantes aos neurônios IR-TH da ZI. O achado de neurônios IR-TH, bem como a descrição da conexão entre a ZI e os núcleos da base são outros importantes indicativos da influência da ZI na motricidade. Os núcleos da base são estruturas chave no processamento da informação motora consciente, e que a lesão desses núcleos provocam uma série de distúrbios como as coréias e o parkinsonismo. Estudos mais recentes mostram que uma das possibilidades de tratamento ou de amenizar os sintomas do parkinsonismo consiste na ativação da ZI, o que torna ainda mais relevante do ponto de vista clínico.

47

NOS

A NOS é a enzima responsável pela conversão de L-arginina em óxido nítrico (NO), que tem ação em processos inflamatórios e, no sistema nervoso, atua como um neurotransmissor, mesmo sem preencher todos os requisitos básicos que caracterizam um neurotransmissor convencional. De natureza gasosa e lipofílica, o NO no sistema nervoso atua na modulação de transporte das monoaminas e na nitrosilação de receptores glutamatérgicos N-Metil-D-Aspartato, ou NMDA (Pierucci et al, 2011), influencia a síntese e liberação de outros neurotransmissores, desempenha um importante papel na potenciação a longo prazo, na depressão de longo prazo e na secreção neuroendócrina (Simon et al, 2013). Na ZI do mocó, encontramos células IR- NOS na ZIr, ZIv e ZIc, e sem imunorreatividade na ZId. Em ratos, células IR-NOS são abundantes na ZId e ausentes nas demais regiões (Kolmac e Mitrofanis, 1999; Mitrofanis, 2005), mais uma vez mostrando variabilidade, agora no contexto neuroquímico, entre esses roedores.

Como já discutido, a ZI apresenta um importante papel na motricidade e na regulação visceral do organismo, que sua lesão promovem um série de disfunções e que sua eletroestimulação auxilia no tratamento do parkinson e da esclerose múltipla, e muito discute-se sobre a participação dos neurônios dopaminérgicos da ZI nesses fatores (Heise e Mitrofanis, 2004; Sita et al, 2003). Recentes estudos mostraram que o NO tem papel chave na transmissão dopaminérgica, influenciando diretamente em seu funcionamento, sendo também alvo de estudos neuroquímicos e no tratamento de Parkinson. No trabalho de Del-Bel et al (2007), a administração de fármacos agonistas e antagonistas para a NOS encefálica promovem aumento e diminuição, respectivamente, da atividade locomotora em diversas espécies, e que existe uma pequena colocalização neuroquímica entre NOS e TH, sugerindo que neurônios IR-TH sintetizam a NOS, que acaba por modular a transmissão dopaminérgica (Pierucci et al, 2011). É importante destacar a presença de células IR-NOS na ZIr do mocó, onde também existe neurônios IR- TH, e que o NO pode estar modulando a ação dos neurônios dopaminérgicos.

48

5-HT

Estudos apontam que a ZI recebe informações de diversos sistemas neuronais, que influenciam a liberação de gonadotrofina, entre eles, o sistema serotonérgico. Verificou-se que a ativação de receptores serotonérgicos 5-HT1A e 5-HT7 nos neurônios IR-5-HT da ZI exercem ação inibitória sobre a liberação do hormônio luteinizante