L’un des principaux rôles du zinc dans la phase de prolifération est de contrôler la formation de la MEC par les fibroblastes conditionnant à la fois :
la migration des kératinocytes pour le remodelage de l’épithélium
l’angiogenèse par les cellules endothéliales pour la formation du tissu de granulation Il a également été démontré que le zinc protège les cellules endothéliales de l’apoptose dans un environnement pro-inflammatoire (Meerarani et al. 2000). Enfin, la dégradation de la matrice de fibrine, permettant la prolifération et la migration des fibroblastes, des macrophages, des kératinocytes et des cellules endothéliales, est conduite par les MMPs (Caley, Martins, and O'Toole 2015). Bien que le mécanisme de régulation des MMPs par le zinc ne soit pas à ce jour totalement compris in vivo, il semblerait qu’une déficience en zinc entraine une expression plus importante de certaines MMPs au sein du tissu lésé. Cette augmentation en MMPs induit une dégradation excessive de la MEC et, de ce fait, une déficience en collagène I et III délétère pour une réparation tissulaire optimale (Grommes et al. 2011).
Certaines études démontrent que, suite à une lésion tissulaire, le niveau de zinc dans le sérum est fortement diminué (Lin et al. 2017). L’utilisation d’une compresse contenant des ions zinc semble donc présenter un avantage intéressant pour le contrôle de l’hémostase. Segal et al. ont d’ailleurs démontré dans une étude que l’association d’alginate de calcium et de zinc augmente les propriétés thrombotiques de la compresse avec une formation plus
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importante de thrombine et une meilleure activation des plaquettes (Segal, Hunt, and Gilding 1998).
En conclusion, il parait clair qu’une balance finement contrôlée entre la libération de calcium et de zinc au niveau de la plaie est une condition essentielle pour conduire à une
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Le sang est un tissu conjonctif liquide qui circule à travers tout l’organisme afin d’alimenter chaque cellule en oxygène et en nutriments, indispensables à leur survie. Toutes atteintes tissulaires entrainent des lésions vasculaires conduisant à l’écoulement du sang en dehors de la circulation sanguine normale. Cet évènement déclenche immédiatement le processus hémostatique visant à arrêter les saignements. Obtenir une hémostase rapide et efficace est essentielle pour la survie de l’organisme. Ainsi, depuis l’Égypte antique, l’homme emploie différents moyens pour stopper les saignements.
Si l’hémostase est un prérequis indispensable pour la survie de l’organe lésé, la réparation tissulaire en est tout aussi essentielle. Ainsi, au-delà de son efficacité à arrêter un saignement, il semble primordial qu’un hémostatique ne soit pas délétère pour la formation du nouveau tissu voire même qu’il la favorise. Pourtant, il est aujourd’hui reconnu que l’utilisation d’hémostatiques implantables peut générer, en raison de leur maintien in situ
associé à une résorption incomplète, des évènements indésirables graves (nécrose, hypersensibilité, allergie, sténose, complication thromboembolique, sepsis…). Pour répondre à cette problématique, les Laboratoires BROTHIER ont donc développé un nouvel hémostatique non implantable, HÉMO-IONIC®, présenté sous la forme d’une compresse de polyuronate de calcium enrichie en ions zinc.
Ainsi, mon travail de thèse s’est défini autour de 3 axes principaux dont les objectifs ont été les suivants :
Démontrer qu’HÉMO-IONIC®, hémostatique non implantable, peut être tout aussi efficace que des hémostatiques implantables actuellement sur le marché.
Étudier les effets in vitro d’HÉMO-IONIC® sur une population cellulaire clé impliquée tout au long des phases de la réparation tissulaire, les cellules endothéliales (ECFCs), en comparaison à deux hémostatiques couramment utilisés en chirurgie : TachoSil® et Surgicel®.
Évaluer les effets in vivo d’HÉMO-IONIC® versus TachoSil® et Surgicel® sur l’ensemble des phases de la réparation tissulaire : de l’hémostase jusqu’à la phase de maturation.
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Isolement, culture et caractérisation des ECFCs
Les échantillons de sang de cordon ombilical sont collectés suite à des naissances menées à terme de nouveaux nés en bonne santé et après consentement éclairé de la mère en accord avec les directives institutionnelles (Assistance Publique des Hôpitaux de Paris). Les ECFCs sont isolées à partir des cellules mononuclées du sang de cordon (CMSCs) obtenues après centrifugation du sang sur un gradient de Ficoll de densité de 1,077 g/mL (Dutscher) et resuspendues dans du milieu de culture des cellules endothéliales EGM-2-MV (Lonza) comme décrit précédemment (Chevalier et al. 2014; Lavergne et al. 2011). Brièvement, les CMSCs sont platées dans des plaques de culture 12 puits (BD Falcon) pré-coatées avec 50 µg/mL de collagène de type I de queue de rat (Corning) et cultivées dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2. Après 24h, les cellules non adhérentes et les débris cellulaires sont éliminés par aspiration. Les cellules adhérées sont lavées au PBS 1X (Gibco) puis le milieu EGM-2-MV est ajouté à tous les puits. Le milieu est changé tous les jours pendant 7 jours puis tous les deux jours. Les colonies de cellules endothéliales apparaissent après 7 à 14 jours de culture et sont identifiées comme une monocouche ronde de cellules pavimenteuses. Après le premier passage les ECFCs forment un tapis cellulaire puis à partir du deuxième passage, le pré-coating de collagène de type I n’est plus nécessaire. Pour toutes les expériences, les ECFCs sont utilisées à des passages 3 à 5.
Pour la caractérisation des ECFCs, les cellules sont détachées à la trypsine-EDTA et les immunomarquages sont réalisés à l’aide des anticorps primaires suivants : CD31-FITC (1:25, BD Pharmingen), CD144-PE (1:10, Beckman Coulter), KDR-APC (1:5, R&D Systems). Les anticorps et les isotypes contrôles (mIgG1-FITC, mIgG1-PE et mIgG1-APC ; Beckman Coulter) sont incubés à 4°C pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS/BSA 0,5%, les données sont enregistrées et analysées sur un cytomètre en flux Accuri C6 (Bd Biosciences).
Préparation des milieux conditionnés
Pour évaluer les effets des hémostatiques sur la fonctionnalité des ECFCs, des milieux conditionnés (MC) sont préparés pour éviter l’hypoxie des cellules. Les milieux conditionnés sont préparés par incubation des hémostatiques (HÉMO-IONIC®, TachoSil®, Surgicel® et Polyuronate de calcium) dans l’EGM-2-MV ou dans l’EBM-2 (pour les expériences de migration en chambre de Boyden et les ELISAs) à une concentration de 1 cm2/2 mL pendant 10 min (temps d’application recommandé par les Laboratoires BROTHIER pour HÉMO-IONIC®). Pour enlever les fibres dues à la décomposition des hémostatiques, les milieux
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conditionnés sont filtrés à 0,45 µm. Le pH du milieu conditionné par Surgicel® a été rétabli à un niveau physiologique (pH = 7) par addition de soude (NaOH) 1M.
Tests de diffusion ionique des compresses à base de polyuronate de calcium
Cinétique de libération des ions calcium et zinc
HÉMO-IONIC® et la compresse de polyuronate de calcium sans zinc sont incubées dans les milieux NaCl 0,9 % et EGM-2-MV à 1 cm2/2 mL pendant 2 min, 5 min, 10 min, 30 min, 24h ou 48h. A chaque temps, les milieux conditionnés sont filtrés à 0,45 µm pour éliminer les fibres résiduelles. Les concentrations en Ca2+ et Zn2+ libérées dans les milieux sont mesurées par un laboratoire externe, Flandres-Analyses, selon la norme NF EN ISO 11885.
Cinétique de captation des ions calcium et zinc par les ECFCs
Les ECFCs sont ensemencées à 10.103 cellules/cm2 à 37°C et 5 % de CO2. Après 24h, les cellules sont incubées dans les milieux conditionnés 10 min avec HÉMO-IONIC® ou la compresse de polyuronate de calcium sans zinc pendant 10 min, 30 min, 24h ou 48h. Aux différents temps, les milieux sont récupérés et centrifugés à 1200 rpm pendant 10 min afin d’éliminer les débris cellulaires. Les concentrations en Ca2+ et Zn2+ sont ensuite mesurées par un laboratoire externe, Flandres-Analyses, selon la norme NF EN ISO 11885.
Cinétique des signaux calcique intracytoplasmique
Les ECFCs sont ensemencées sur lamelles en verre à une densité de 10.103 cellules/cm2 à 37°C et 5 % de CO2 et cultivées en EGM-2-MV. Après 48h, les cellules sont incubées avec la sonde FURA-2-AM à 3 µM diluée dans du milieu d’imagerie, dont la composition est résumée dans le Tableau 8, pendant 30 minutes à TA, à l’obscurité. Le surplus de FURA-2-AM est éliminé grâce à un lavage de 10 minutes dans le milieu d’imagerie. Les lamelles sont ensuite installées dans une chambre adaptée au microscope puis du milieu de culture EGM-2-MV est ajouté sur les cellules. Une fois sous le microscope, un système de flux est actionné afin de changer le milieu des cellules de manière progressive sans risquer d’induire des signaux calciques intracytoplasmiques dus à une activation mécanique des cellules. L’intensité de fluorescence de la sonde FURA-2-AM est mesurée à deux longueurs d’onde d’excitation (340 nm et 380 nm), toutes les 3 secondes à l’aide d’une caméra ultra-sensible EM-CCD (Hamamatsu).
Le ratio des intensités de fluorescence mesurées après excitation à 340 nm et 380 nm (F340/F380) permettent de réaliser une courbe représentant les signaux calciques
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intracytoplasmiques pour chaque cellule du champ observé. Les concentrations de calcium intracytoplasmique ([Ca2+]i) sont calculées de la manière suivante :
Où : = concentration de calcium intracytoplasmique = F340 / F380
= R dans des conditions où la est minimale, obtenue grâce à l’utilisation d’un chélateur du calcium, l’EGTA (20 mM )
= R dans des conditions la est maximale, obtenue grâce à l’utilisation d’un ionophore, la Ionomycine (2 µM)
= constante de dissociation entre le calcium et la sonde FURA-2-AM = 225 nM = F380 dans des conditions où la est minimale / F380 dans des conditions la est maximale
Tableau 8 : Composition du milieu d’imagerie (1X).
Composé mmol/L Osmolatité
NaCl 115,5 231 KCL 5,6 11,2 MgCl2 1,2 2,4 NaH2PO4 1,2 2,4 NaHCO3 5000 10 CaCl2 1,8 3,6 HEPES 20000 20 Glucose 5,551 5,551
Test de fonctionnalité des cellules endothéliales
Evaluation de la mort cellulaire par marquage Annexine V / Iodure de Propidium
La mortalité des ECFCs a été évaluée par un double marquage à l’Annexine V / Iodure de Propidium (IP) à l’aide d’un kit de détection de l’apoptose et selon les recommandations du fabricant (Clinisciences). Brièvement, les ECFCs sont incubées pendant 45 min avec les différents milieux conditionnés à 37°C et 5 % de CO2. Les cellules sont ensuite détachées à la trypsine, resuspendues dans le tampon de blocage (500 µL) et marquées à l’annexine V et au
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Iodure de Propidium pendant 5 min, à température ambiante (TA) et à l’obscurité. La mortalité cellulaire a été enregistrée et analysée sur un cytomètre en flux Accuri C6 (Bd Biosciences).
Tests ELISAs
Les ECFCs sont ensemencées à une densité de 5.103 cellules/cm2 à 37°C et 5 % de CO2 et cultivées en EGM-2-MV. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, les puits sont lavés au PBS 1X et les cellules sont incubées dans du milieu de base EBM-2-SVF 0,2 % sur la nuit. Les cellules sont ensuite cultivées dans les différents milieux conditionnés pendant 10 min, 1h, 2h, 4h et 6h. À chaque temps de la cinétique, les surnageants de culture sont collectés et centrifugés à 1200 rpm pendant 5 min pour être clarifiés. Les quantités d’endothéline-1 et de vWF sont quantifiées par kit ELISA selon les recommandations du fabricant (endothéline-1 : R1D Systems et vWF : Sigma).
L’expression du facteur tissulaire est quantifiée sur lysats cellulaires totaux. Brièvement, après récupération du surnageant, les cellules sont lavées deux fois au PBS 1X froid et lysées après ajout de tampon RIPA froid (20 mM Tris HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Sodium Deoxycholate, 1% Triton X100, 0,1% SDS, 1 mM EDTA) pendant 30 min à 4°C. Les lysats sont clarifiés par centrifugation (20 000 g pendant 20 min à 4°C). Le facteur tissulaire est quantifié par kit ELISA selon les instructions du fabricant (R&D Systems).
Expression des molécules d’adhérence ICAM-1 et VCAM-1 en réponse à un environnement pro-inflammatoire (TNF-α)
Après culture des ECFCs dans les différents milieux conditionnés pendant 48h, la condition pro-inflammatoire est induite en ajoutant ou non 10 ng/mL de TNF-α (Bio-Techne) pendant 16h à 37°C et 5 % de CO2. Les activations sont stoppées par un lavage des cellules au PBS 1X froid puis les cellules sont détachées à la trypsine et resuspendues dans un tampon PBS / BSA 0,5 %. Les immunomarquages sont effectués avec les anticorps primaires dirigés contre ICAM-1 (1:50, Ozyme), VCAM-1 (1:20, Ozyme) et les isotypes contrôles (Beckman Coulter) pendant 30 min à 4°C. Après deux lavages au PBS 1X froid, les données sont enregistrées et analysées sur un cytomètre en flux Accuri C6 (Bd Biosciences).
Prolifération cellulaire
Les ECFCs sont ensemencées en milieu EGM-2-MV à une densité de 5.103 cellules/cm2 à 37°C et 5 % de CO2. Après 24h, les cellules sont incubées avec le CFSE (Invitrogen) à 0,5 µM dilué dans du PBS 1X pendant 15 min. Le surplus de CFSE est éliminé par aspiration et les
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cellules sont cultivées dans les milieux conditionnés pendant 48h, 72h et 96h. L’intensité de fluorescence du CFSE est mesurée sur un cytomètre en flux Accuri C6 (Bd Biosciences). Le nombre de division cellulaire, noté est calculé de la manière suivante :
Où : = nombre de division cellulaire = intensité de fluorescence à t0
= intensité de fluorescence au temps étudié
Activité métabolique
Les ECFCs sont ensemencées à une densité de 5.103 cellules/cm2 dans une plaque 96 puits (BD Falcon), puis laissées 6h à 37°C et 5% CO2 le temps que les cellules adhèrent. Les cellules sont ensuite incubées avec les différents milieux conditionnés pendant 48h, 72h et 96h. Le dérivé formazan produit à travers la réduction du MTS par les mitochondries cellulaires a été quantifié à tous les temps selon les recommandations du fabricant. La valeur à t0 a servi de base. Brièvement, à chaque temps de la cinétique, les milieux conditionnés sont retirés par aspiration et 200 µL de RPMI-1640-SVF 10% contenant 30 µL de MTS sont ajoutés aux cellules. Les cellules sont incubées pendant 2h à 37°C, 5 % CO2. L’absorbance à 490 nm est mesurée sur un lecteur de plaque Multiskan Ex (Thermo Fisher Scientifique). Une mesure à la longueur d’onde de référence 630 nm est soustrait pour éliminer le bruit de fond. Après chaque analyse, les cellules sont rincées au RPMI-1640-SVF 10 % et du milieu conditionné frais est rajouté.
Test de blessure
Les blessures ont été créées à l’aide d’inserts de culture 2 puits Ibidi (Biovalley) selon les instructions du fabricant. Brièvement, les ECFCs sont ensemencées à 21 000 cellules/puits dans l’EGM-2-MV pendant 24h à 37°C et 5 % de CO2. À confluence des cellules, les inserts de culture sont retirés et les puits sont lavés au PBS 1X pour éliminer les cellules non adhérées et les débris cellulaires. Les milieux conditionnés (500 µL) sont ajoutés à chaque puits. La fermeture de la blessure est observée à l’aide d’un microscope inversé couplé à une caméra
m m= ln It0 It æ è ç ç ö ø ÷ ÷ ln2 m It 0 It
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vidéo et une chambre de culture pour garder les cellules à 37°C et 5 % de CO2 et quantifiée toutes les heures pendant 24h à l’aide du logiciel ImageJ (NIH Software).
Migration en chambre de Boyden
La migration des ECFCs a été évaluée à l’aide de chambres de Boyden (taille 24 puits) possédant des membranes de polycarbonate dont les pores ont une taille de 8 µm et qui ont été pcoatées avec 20 µg/mL de fibronectine (Sigma) toute la nuit à TA. Après 1h de ré-hydratation des inserts avec de l’EBM-2 supplémenté avec du SVF 0,2 % à 37°C, les ECFCs sont ensemencées à 2.105 cellules/insert dans le compartiment du haut de l’insert en présence de milieu basal EBM-2-SVF 0,2 %. Le milieu de base EBM-2-SVF 0,2 % ou les milieux conditionnés contenant ou non 10 µg/mL de VEGF (chimio-attractant connu des cellules endothéliales) sont ajoutés dans le compartiment sous les inserts. Les ECFCs sont incubées 5h à 37°C et 5 % CO2. Après 1 lavage au PBS 1X, les cellules sont fixées en PFA 4% pendant 10 min à TA et colorées au bleu de méthylène à l’aide du kit RAL 555 (RAL Diagnostics). Les cellules qui n’ont pas migré à travers la membrane sont éliminées à l’aide d’un coton tige. Les membranes sont ensuite découpées et montées entre lames et lamelles dans un milieu de montage 50 % ddH2O / 50 % Glycergel (Dako). Chaque condition a été analysée en triplicate et 3 photographies par membrane ont été prises. Les cellules des 9 champs par condition sont comptées à l’aide du logiciel ImageJ (NIH Software).
Formation de structure de type tubulaire en Matrigel™
Pour déterminer le potentiel des ECFCs à former des structures de type capillaire, le Matrigel™ (Corning) a été coaté à froid dans des plaques 12 puits et incubé à 37°C pendant 30 min pour permettre la polymérisation du gel. Les ECFCs sont pré-incubées pendant 30 min à 37°C avec les milieux conditionnés dans le but de pré-conditionner les ECFCs par les différents hémostatiques avant leur pénétration (et protection) dans le Matrigel™. 150 000 cellules sont incubées par puits et la formation de réseaux structurés est observée et photographiée à l’aide d’un appareil photo numérique (Nikon) monté sur un microscope inversé après 4h, 8h et 24h. Les nombres de « master segments » (segments terminés par deux intersections), de « master junctions » (jonctions d’où partent au minimum 3 master segments) et de réseaux fermés sont quantifiés sur chaque photographie à l’aide du logiciel ImageJ (NIH Software) et de la macro Angiogenesis Analyzer développé par Gilles Carpentier (Figure 38) (http://image.bio.methods.free.fr/ImageJ/?Angiogenesis-Analyzer-for-ImageJ, G. Carpentier, Image J News, 20 October 2012).
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Figure 38 : Représentation schématique d’un réseau en Matrigel™.
Jaune : master segments, rouge : master junctions, bleu clair : réseau fermé. (D’après Gilles Carpentier)
Modèles murins in vivo
Toutes les expériences ont été réalisées après autorisation du projet par le Comité d’Éthique en Expérimentation Animale (CEEA) agréé de l’Université de Paris Sud n°26 et le ministère de l’Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l’Innovation.
Modèle d’hémostase: excision de l’artère fémorale
Les souris mâles C57BL/6JRj de 8 semaines sont anesthésiées par injection intra-péritonéale de xylazine (20 mg/kg, Bayer) et de kétamine (100 mg/kg, Virbac). Lorsque les souris ne présentent plus de signe de réveil, une incision est effectuée au niveau de l’aine afin d’accéder à l’artère fémorale. La plaie est entièrement recouverte à l’aide de morceaux de Gaze préalablement pesés. Une fois isolée de la veine fémorale et du nerf qui l’entoure, l’artère est excisée générant une hémorragie sévère. Des morceaux de Gaze (Contrôle), d’HÉMO-IONIC®, de TachoSil® ou de Surgicel®, préalablement pesés, sont alors appliqués sur la brèche vasculaire jusqu’à arrêt complet du saignement. Une fois l’hémostase obtenue, les morceaux de Gaze tapissant la plaie et des hémostatiques contenant le sang sont de nouveau pesés. Enfin, la quantité de sang perdu est calculée de la manière suivante :
qsang perdu = poidshémostatique + Gaze final – poidshémostatique + Gaze initial
La perte de sang pouvant être importante, les souris sont euthanasiées avant réveil, à la fin de la procédure, afin d’éviter toute souffrance inutile de l’animal.
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Modèle de réparation tissulaire : excision cutanée (Figure 39)
Les souris mâles C57BL/6JRj de 8 semaines sont anesthésiées par inhalation d’isoflurane maintenue à l’aide d’un masque. Après avoir administrée une dose d’antidouleur en sous cutanée (Buprénorphine à 0,05 mg/kg), la peau du dos de la souris est rasée à l’aide d’une tondeuse et traitée avec de la bétadine. Une excision circulaire de la peau, d’un diamètre de 1 cm2 est ensuite réalisée au milieu du dos. Un dispositif, destiné à maintenir les bords de la plaie et favoriser la réparation tissulaire par réépithélialisation en limitant le phénomène de contraction, est fixé sur le dos des souris à l’aide de colle cutanée et d’agrafes chirurgicales. Ce dispositif, muni d’une ouverture centrale, permet un accès direct à la plaie (Figure 40-A). De plus ce dernier est composé d’une fine plaque de métal pour limiter le « grignotage » et la destruction du dispositif par les souris. Après nettoyage de la plaie à l’aide de NaCl 0,9 %, un morceau de Gaze (Contrôle), d’HÉMO-IONIC®, de TachoSil® ou de Surgicel® est appliqué pendant une durée de 10 minutes (temps recommandé par les Laboratoires BROTHIER pour HÉMO-IONIC®) ou laissé in situ. La chambre du dispositif est ensuite fermée par un anneau amovible pour protéger la plaie. Cet anneau est muni de pores laissant passer l’air pour permettre les échanges gazeux (Figure 40-B).
Après 7, 14, 21, 28 jours ou 2 mois, les souris sont euthanasiées et les échantillons de peau prélevés puis :
fixés au paraformaldéhyde 4%, déshydratés dans des bains successifs d’alcool à concentrations croissantes et incluent en paraffine pour analyses histologiques et immunohistochimiques
congelés à sec dans de l’azote liquide pour l’analyse de l’activité des 2 et MMP-9 par zymographie
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Figure 40 : Représentation schématique du dispositif utilisé dans le modèle d’excision cutanée chez la souris.
A. Dispositif en siliconedestiné à maintenir les bords de la plaie et favoriser la réparation tissulaire par ré-épithélialisation en limitant le phénomène de contraction, B. Anneau amovible.
Histologie et Immunohistochimie
Les échantillons de peau incluent en paraffine sont coupés à une épaisseur de 5 µm puis séchés avant déparaffinage dans des bains de xylène et réhydratation dans des bains successifs d’alcool de concentrations décroissantes. Une coupe de chaque échantillon est ensuite colorée à l’Hématoxyline-Éosine-Safran (HES). Le reste des coupes est préparé pour les marquages immunohistochimiques. Après un démasquage antigénique HIER