• Caracterização molecular dos isolados de sp. coletados em amostras do solo de Monte Negro, RO, utilizando as sequências completas dos ITS e do rRNA 5.8S
• Caracterização molecular das bactérias simbiontes isoladas, utilizando as seqüencias completas do rRNA 16S.
• Após alinhamento das sequências obtidas, realizar análise filogenética analisar a congruência ou não das árvores resultantes para cada conjunto de dados obtidos. • Uso de abordagem integrada incluindo caracteres morfológicos de modo a identificar
os nematoides entomopatogênicos isolados até a espécie.
• Estudar a biologia de um dos isolados bacterianos, levando em consideração fatores # Localização de um dos conjuntos (“clusters”) de rRNA no genoma de TT01
como a dinâmica de crescimento, resistência a antibióticos, metabolismo e possíveis produtos de secreção ou estruturas para a interação entre as bactérias e os nematoides.
2.1 BACTÉRIAS
α αα
α ( 44 D U169 17 1 1 96 1 1 – DAVIS;
YOUNG, 1983); (F 1 1 15 16 lacX74 φ80
lac ZM15 araD139 [ara, leu] 7697 mcrA D[mrr hsdRMS mcrBC] λ-); ! (genótipo desconhecido; cedida pelo Dr. Thomas Blumenthal – University of Colorado, Boulder); " (genótipo desconhecido; derivada de linhagem de BB, auxotrófica para uracila e originalmente derivada da coleção de linhagens do Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Inglaterra – (DUSENBERY; SHERIDAN; RUSSELL, 1975).
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Uma colônia individual de das linhagens DH5 α ou DH10B crescidas em foi inoculada em 3 ml de . O tubo contendo o meio foi mantido em agitação e temperatura de 37 oC constantes por aproximadamente 18 horas. 500 l deste pré inóculo foram adicionados a 100 ml de outra preparação do mesmo meio. A nova cultura também foi submetida a agitação e temperatura de 37 oC constantes por aproximadamente duas horas até atingir A600nm=0,5, sendo então centifugada a 4000 por 10 minutos a 4 oC. As células foram ressuspendidas em CaCl2 50 mM e incubadas a 4 oC por 20 minutos. As suspensões foram novamente centrifugadas sob as mesmas condições e os precipitados de células
ressuspendidos em volume adequado de CaCl2 50 mM adicionado de glicerol 15% (v/v). As células bacterianas competentes foram então aliquotadas e congeladas em nitrogênio líquido, sendo armazendas a – 70 oC ou em tanques de nitrogênio líquido até a sua utilização.
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Aproximadamente 200 ng de DNA plasmidial eram adicionados a 90 µl de suspensão de células bacterianas quimio competentes e mantida a mistura a 4 oC por 30 a 40 minutos. A mistura então era submetida a choque térmico a 42 oC durante um minuto e rapidamente tranferida para 4 oC, onde era mantida por dois minutos. Foram adicionados 900 l de
bactérias transformadas de modo a obter colônias foram empregados os métodos correspondentes para as marcas de seleção presentes nos plasmídeos empregados.
Para os plasmídeos comuns e Invitrogen PCR TOPO 2.1 (Carslbad, CA, U.S.A.) com marca de antibiótico e o operon , 50 l da mistura de células bacterianas e plasmídeo eram plaqueados em adicionado do antibiótico apropriado, 122 mM e !"# 100 mM e incubadas por 18 horas a 37 oC para a identificação dos clones recombinantes.
Para os plasmídeos pJET 1.2® (Fermentas, Canadá), 50 l da mistura de células bacterianas e plasmídeo eram plaqueados em adicionado do antibiótico ampicilina ou carbenicilina. As colônias viáveis eram todas transformadas.
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A linhagem da bactéria simbionte dos nematoides entomopatogênicos estudados nesta tese foram extraídas do tubo digestivo dos juvenis infectantes (JI) nematoides pertecentes a espécie $ % % & linhagem LPP7. Os JIs foram lavados com Merthiolate 0,1% (v/v) e estreptomicina 100 g/ l ou Hipoclorito de sódio 1,5% (v/v) para esterilizar o seu exterior. Após o tratamento os JI foram lavados em água estéril e colocados sobre placas de Petri contendo (BOEMARE et al., 1997; WINTZINGERODE; GÖBEL; STACKEBRANDT, 1997; WILKINSON; HAY, 1997).
Após um período de incubação de aproximadamente 72 horas, os JI morriam e regurgitavam o conteúdo de seu tubo digestório no meio, permitindo a proliferação das
bactérias e a formação de colônias isoladas. Posteriormente essas colônias foram repicadas em
' (MACCONKEY, 1908) e ( # de modo a distinguir as enterobactérias. As colônias isoladas nesta segunda passagem foram novamente crescidas em LB e submetidas à extração de DNA para posterior identificação e estocagem.
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A linhagem de " % ) subsp. ) isolada a partir dos NEPs da espécie $ % % & linhagem LPP7 foram denominadas
respectivamente MN7 seguindo o critério de praxe na literatura, onde as linhagens bacterianas são denominadas em homenagem ao local de isolamento, no caso a localidade de Monte Negro – RO (DOLINSKI et al., 2008).
A partir da identificação por sequenciamento do SSU rRNA dos isolados bacterianos, estes foram mantidos tanto em cultura líquida e placas dos e ou ( . Aliquotas também foram congeladas em ) suplementado com Glicerol 15% (v/v) em nitrogênio
líquido e se encontram estocadas em nosso Departamento. Adicionalmente foram preparados stabs de para estocagem a temperatura ambiente.
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A caracterização bioquímica foi realizada empregando o kit EPM MILi (Newprov, Brasil).
A determinação de resistências a antibióticos da linhagem MN7 permitiu observar suscetibilidade dessas bactérias, nas culturas em LB agar crescidas na presença do multidisco de antibióticos Laborclin®, Curitiba, Brasil.
2.2 NEMATOIDES
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Os *! (juvenis infectantes) que emergiram das larvas de lepidóptero infectadas foram eluídos em água destilada, através do método modificado das armadilhas de White (WHITE, 1927) (6 # 0) e novamente apresentados à larvas sadias e assim subsequentemente. A
suspensão de *! em água destilada era filtrada em pré filtro Millipore (Billerica, MA, EUA7 AP 20 de 47 mm, os vermes eram ressuspendidos em água destilada e armazenados em garrafas plásticas de cultura de tecidos. Os juvenis eram mantidos por periodos de até três meses em + à temperatura constante de 15 oC.
2.3 INSETOS
Durante o trabalho foram utilizados os lepidópteros ) Linnaeus 1785 (Família Pyralidae), que foram gentilmente cedidos pela Doutora Claudia Dolinski do
6 # 0 Armadilha
Laboratório de Entomologia e Fitopatologia do CCTA da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF).
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As larvas de ) foram mantidas em alimento % ), com
composição modificada a partir da descrição em Kaya e Woodring (1988). Utilizaram se frascos distintos para o acondicionamento das larvas e dos adultos. As colônias foram mantidas em B.O.D. à temperatura constante de 28 oC. A adição de mais meio de cultura foi realizada conforme as necessidades. Os adultos foram colocados em caixas de cruzamento que continham folhas de papel de filtro dobradas, onde eram feitas as posturas. Os ovos foram coletados e tranferidos para outro recipiente contendo alimento novo recentemente preparado, onde ocorria a eclosão e o desenvolvimento inicial das larvas.