2.1. Geral
Tendo em vista a importância dos macrófagos no reconhecimento, resposta e resolução na inflamação, e o fato de que, até o momento, não há uma investigação detalhada do efeito da LAAO sobre este tipo celular, propomos, neste projeto, investigar a ação da LAAO sobre macrófagos de rato, avaliando sua citotoxicidade e atividade apoptótica, bem como a capacidade desta enzima de estimular a formação de radicais livres. Nesta investigação, usamos a LAAO da peçonha de B. jararaca e macrófagos alveolares de rato como ferramenta biológica.
2.2. Específicos
Avaliar a citotoxicidade da LAAO em macrófagos alveolares de ratos.
Avaliar a capacidade da LAAO em estimular a produção de H2O2, ânion
superóxido e NO em macrófagos e o envolvimento destes mediadores nas alterações celulares causadas pela enzima.
Avaliar a atividade apoptótica da LAAO e o envolvimento tanto da via intrínseca quanto da via extrínseca no processo apoptótico.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. REAGENTES E PEÇONHA
Os reagentes para cromatografia e eletroforese foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, EUA) e GE LifeSciences (Piscataway, NJ, EUA). Garrafas e placas de cultura estéreis foram obtidas da Nunc (Copenhague, Dinamarca), Corning (Corning, NY, EUA) e similares. O meio de cultura celular (RPMI) foi obtido da Cultilab (Campinas, SP, Brasil). O isofluorano foi obtido da Cristália (Itapira, SP, Brasil). O neutral red (vermelho neutro), O-dianisidina, L-leucina, peroxidase, substratos para caspases 3, 8 e 9, superóxido dismutase (SOD), catalase, Nɷ-L- nitroarginina metil éster (L-NAME) e L-aminoguanidina foram obtidos da GE Lifesciences, Calbiochem ou Sigma. O kit comercial para a quantificação de lactato desidrogenase (LDH) foi adquirido da Bioclin (Belo Horizonte, MG, Brasil) e o kit para quantificação de NO da Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, EUA). Os outros reagentes foram obtidos da Sigma, Millipore ou Merck (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). A peçonha liofilizada de B. jararaca de espécimes adultos de ambos os sexos foi obtida do Centro de Extração de Toxinas Animais (CETA, Morungaba, SP) e da Fundação Ezequiel Dias (FUNED, Belo Horizonte, MG).
3.2. ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos (~300 g), provenientes do Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP. Os ratos foram mantidos a 22 oC com acesso livre a ração e água e em ciclos de luz (claro/escuro) de 12 h. Os experimentos com animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UNICAMP, protocolo no. 2694-1) e realizados em conformidade com os princípios éticos gerais para uso de animais da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), em consonância com a Lei Federal no. 11.794 de 08 de outubro de 2008.
3.3. PURIFICAÇÃO DA LAAO DA PEÇONHA DE BOTHROPS JARARACA
A LAAO foi purificada usando uma combinação de cromatografias de gel filtração e troca iônica, seguindo protocolos já descritos na literatura74.
3.3.1. Cromatografia de gel filtração (Superdex 75)
A peçonha de B. jararaca (100 mg) foi dissolvida em 1 ml de Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5) contendo 0,01 M de CaCl2 e mantida por 20 minutos em temperatura
ambiente. A amostra foi centrifugada a 13.000 rpm por 12 minutos em uma ultracentrífuga MiniSpinplus (Eppendorf). O sobrenadante resultante foi aplicado a uma coluna Superdex 75 (1,2 x 100 cm) acoplada a um sistema cromatográfico AKTÄ Prime (GE Healthcare) e equilibrada com o mesmo tampão a um fluxo de 0,5 ml/min com coletas de 1,5 ml/tubo. O perfil de eluição foi monitorado a 280 nm, e as frações foram dosadas para atividades LAAO, proteolítica e amidolítica.
3.3.2. Cromatografia de troca iônica (HiTrap Q-Sepharose)
As frações de gel filtração com atividade LAAO foram agrupadas e concentradas por ultrafiltração utilizando membrana Amicon 3 kDa (Millipore). A amostra foi clarificada a 10.000 rpm por 5 minutos em uma ultracentrífuga MiniSpinplus (Eppendorf) e o sobrenadante foi aplicado em uma coluna Q-Sepharose HiTrap de 5 ml (GE Healthcare) acoplada a um sistema cromatográfico AKTÄ Prime e equilibrada previamente com tampão HEPES 0,02 M (pH 8,0) (tampão A). A eluição das proteínas ligadas à coluna foi realizada com tampão HEPES 0,02 M (pH 8,0) contendo 1 M de NaCl (tampão B – TB) em gradiente escalonado: 0% TB em 3,5 volumes de coluna (VC), 25% TB em 6 VC, 50% TB em 6 VC e 100% TB em 4 VC. O fluxo da corrida cromatográfica foi de 1 ml/min com coletas de 1 ml/tubo e o perfil cromatográfico foi monitorado em comprimento de onda de 280 nm. As frações com atividade de LAAO foram reunidas e concentradas usando membrana Amicon 50 kDa (Millipore) a 3.665 x g por 20 minutos. Foi determinada a concentração de proteína e as amostras foram armazenadas a 8oC.
3.3.3. Pureza da proteína isolada
3.3.3.1. Eletroforese em géis de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
Todas as etapas de purificação foram monitoradas por SDS-PAGE159 por um sistema descontínuo com gel de empacotamento de 4% preparado com Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) contendo 0,4% de SDS e gel de migração de 10% com Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) contendo 0,4% de SDS em um sistema eletroforético Mighty Small SE260
(Hoefer-Pharmacia). Amostras de peçonha e fração foram dissolvidas em tampão de amostra [azul de bromofenol 4% (p/v), Tris-HCl 0,06 M, SDS 2%, glicerol 10%] e fervidas por 5 minutos com 0,1% de ditiotreitol (DTT) ou -mercaptoetanol para redução de proteínas. Os géis (10 x 12,5 cm) foram montados em cuba vertical mini SE260 (GE Lifesciences), acoplada à fonte elétrica EPS 600 (GE Lifesciences), imersos em tampão Tris-HCl 0,625 M (pH 6,8), glicina 1,2 M contendo SDS 10%, e, então, foram submetidos a um campo elétrico constante de 150 V. Após a corrida, os géis foram corados com nitrato de prata. Marcadores de massa molecular foram corridos em paralelo com as amostras.
3.3.3.2. Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa
Para o monitoramento do grau de pureza da fração com atividade de LAAO purificada pelos passos cromatográficos anteriores, 100 µg da fração foram aplicados em uma coluna de fase reversa C18 Discovery® BioWide pore (25 cm x 4,6 mm x 10 µm, Sigma). O sistema cromatográfico foi previamente equilibrado com ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% (pH 3,5) (tampão A). A eluição da amostra foi realizada através de um gradiente linear (0-100%) de tampão B (acetonitrila em 0,1% TFA), e monitorada num comprimento de onda de 280 nm.
3.4. Quantificação de proteínas
A concentração das proteínas foi determinada pelo método de Bradford160 utilizando BSA (albumina de soro bovina) como padrão.
3.5. Atividades enzimáticas 3.5.1. Atividade LAAO
A atividade enzimática da LAAO foi determinada de acordo com Nicholson e Kim161 adaptado para placas de ELISA. Utilizou-se o substrato L-leucina 0,006% em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7,8) contendo 0,25 µM de horseradish peroxidase e 0,4 µM de o-dianisidina. Amostras de peçonha e fração foram dissolvidas em tampão de amostra (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,8). A absorbância foi lida em um comprimento de onda de 436 nm em modo cinético por 30 minutos usando um leitor de microplacas SpectraMax340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). A atividade enzimática foi expressa em aumento de absorbância/min e convertida em
unidades/µl. Uma unidade enzimática foi definida como a oxidação de 1 µM de L- leucina por minuto.
3.5.2. Atividade proteolítica
A atividade proteolítica foi determinada colorimetricamente por degradação de azocaseína, modificado a partir do método descrito por Wang e Huang162. Amostras de peçonha e fração foram incubadas com solução de azocaseína (5 mg/ml) em tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8,0). Após incubação por 90 minutos a 37 ºC, foram adicionados 200 µl de ácido tricloroacético 5% para precipitar a azocaseína que não havia sido digerida. Após 5 minutos a temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 8.000 x g por 5 minutos e 150 µl do sobrenadante foram adicionados a um volume igual de NaOH 0,5 M. Então, a atividade proteolítica foi monitorada pela determinação dos azopeptídeos produzidos pela atividade catalítica sobre a azocaseína em uma absorbância de 440 nm usando um leitor de microplacas SpectraMax340.
3.5.3. Atividade amidolítica
A atividade amidolítica foi determinada colorimetricamente pela degradação do substrato sintético N-benzoil-L-arginina p-nitroanilida (BApNA), conforme descrito por Torres-Huaco et al.163. Foi preparada uma solução estoque do substrato BApNA 0,1 M em DMSO, e logo em seguida preparada a solução de trabalho, diluindo a solução estoque em tampão Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) contendo 10 mM de CaCl2 e 100 mM de NaCl (solução de trabalho 1:100). Em microplacas de
ELISA, foram misturados 200 µl da solução de substrato, 50 µl de tampão de trabalho e 15 µl de água destilada e pré-incubados a 37 ºC por 10 minutos. Logo, foram adicionados 5 µl de amostra ou tampão de trabalho em um volume final de 270 µl. A mistura de reação foi incubada a 37 ºC por 30 minutos e as absorbâncias lidas em um comprimento de onda de 410 nm em leitor de microplacas SpectraMax340.
3.6. ISOLAMENTO E CULTURA DE MACRÓFAGOS
Os macrófagos foram obtidos de ratos machos Wistar por lavagem broncoalveolar164 (Figura 7). Para isto, os ratos foram anestesiados com isoflurano e
a traqueia exposta e canulada com tubo de polietileno (1 mm de diâmetro) conectada a uma seringa. Os pulmões foram lavados com salina tamponada com fosfato (PBS - phosphate-buffered saline) contendo 0,1% de heparina. O PBS foi inoculado através da cânula na traqueia em três alíquotas de 5 ml cada. Centrifugou- se o lavado (10 minutos, 400 x g, 4 ºC) e o pellet de células foi ressuspenso em 2 ml de meio RPMI 1640 + 10% SFB (soro fetal bovino). As células foram ajustadas para uma concentração 2 x 105 macrófagos/poço e aderidas overnight em placas de cultura de 96 poços a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. Após este
período, as células não aderentes foram removidas pela lavagem das placas com PBS. A população de células aderentes, constituída de 95% de macrófagos, foi usada nos experimentos descritos abaixo.Todos os procedimentos de cultura foram realizados em cabine de fluxo laminar.
Figura 7. Imagem de microscopia óptica obtida do lavado broncoalveolar feito em
ratos machos Wistar. Realizou-se a coloração de panótico rápido para a comprovação da presença de macrófagos.
3.7. CITOTOXICIDADE
3.7.1. Viabilidade celular (captação de vermelho neutro)
A citotoxicidade foi avaliada incubando-se macrófagos alveolares em placas de cultura celular de 96 poços com concentrações variadas de peçonha de B. jararaca (10-1000 µg/ml) e LAAO (2,5-250 U/ml) por 2 h. Em alguns protocolos, as células foram incubadas com uma concentração fixa de enzima (75 U/ml) por diferentes períodos de tempo (2, 6 e 24 h). Para avaliar o envolvimento de espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio na citotoxicidade, foram coincubadas com a LAAO (75 U/ml), em concentrações descritas na literatura: superóxido dismutase (SOD; 40 U/ml), catalase (CAT; 100 U/ml) ou aminoguanidina (AG; 500 µM), por 2 h. Em todos os protocolos, células controle (C-) foram incubadas apenas com meio de cultura celular e, como controle positivo de morte celular (C+), foram incubadas com 1% de Triton X-100. Após exposição à peçonha ou LAAO, o meio foi removido e foram adicionados a cada poço 100 µl de RPMI 1640 contendo 120 µg de vermelho neutro/ml, e as placas foram incubadas a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% CO2
durante 2 h. Após este tempo, o meio contendo o corante foi removido e os poços foram lavados para remover o corante não incorporado. Finalmente, 100 µl da solução reveladora (ácido acético glacial 1% em 100 ml de etanol 50%) foram adicionados a cada poço a temperatura ambiente e, então, a placa foi lida a 540 nm em um leitor de microplacas SpectraMax340, considerando as células controle (C-) como 100% de viabilidade celular165.
3.7.2. Liberação de LDH
A citotoxicidade da LAAO também foi avaliada quantificando-se a liberação de lactato desidrogenase (LDH) no meio de cultura em diferentes tempos, conforme descrito anteriormente166. As células foram cultivadas em placas de cultura de 96 poços. Após exposição à LAAO (75 U/ml, concentração escolhida baseada nos resultados de citotoxicidade – ver seção anterior e ‘Resultados’), uma alíquota (10 µl) do meio de cultura foi retirada para quantificação do LDH com kit comercial (Bioclin), de acordo com as instruções do fabricante, em um volume final de 500 µl. Após 1 minuto de reação a 37 ºC, a absorbância foi lida em 340 nm por 3 minutos em espectrofotômetro Beckman DU800 (Beckman Instruments) e os resultados foram calculados de acordo com o manual do kit.
3.8. AVALIAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO AND NITROGÊNIO
3.8.1. Espécies reativas de oxigênio (EROs)
A estimulação da formação de EROs intracelulares foi avaliada utilizando a sonda fluorescente intracelular diacetato de 2’,7’-diclorofluoresceína (DCFH-DA), que é sensível a oxidação. Quando em contato com EROs, DCFH modifica-se para 2’,7’-diclorofluoresceína (DCF) com alta fluorescência167
por 2 h antes das amostras, as células foram lavadas com PBS e então incubadas com LAAO (75 U/ml) na presença ou ausência de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml), N-L-nitroarginina metil éster (L-NAME - 1 mM) ou AG (500 µM), também por 2 h. Em seguida, foi realizada a leitura em fluorímetro (SynergyTM H1 Hybrid Reader, BioTek, EUA) com excitação a 485 nm e emissão a 530 nm, conforme descrito por Wang e Joseph168. Os resultados foram expressos em intensidade de fluorescência.
3.8.2. Peróxido de hidrogênio (H2O2)
A produção de H2O2 foi avaliada em macrófagos incubados com a
peçonha de B. jararaca (10 µg/ml) ou LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml), L-NAME (1 mM) ou AG (500 µM). Alíquotas (10 µl) do meio de cultura foram coletadas em diversos intervalos de tempo (10 a 200 minutos) e a quantidade de H2O2 presente foi determinada utilizando um ensaio
contendo 0,25 µM de horseradish peroxidase e 0,4 µM de o-dianisidina87. A absorbância resultante foi lida a 530 nm em um leitor de microplacas SpectraMax340 e os níveis de H2O2 foram calculados a partir de uma curva padrão de H2O2.
3.8.3. Óxido nítrico (NO)
A formação de NO por macrófagos incubados ou não com LAAO (75 U/ml) na presença ou ausência de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml), L-NAME (1 mM) ou AG (500 µM) por 2 h foi avaliada quantificando-se a liberação de nitrito/nitrato para o meio de cultura. Utilizando kits comerciais colorimétricos em placas de 96 poços (Cayman Chemical), alíquotas de 80 µl de amostra foram incubadas a 37 °C com 40 µl de solução de redução (NADPH 5 mg/ml, FAD 41,5 mg/ml, KH2PO4 0,5 M,
pH 7,5 + 0,5 U de NO redutase). Após 120 minutos de incubação, 50 µl de reagente de Griess (cloridrato de naftilenodiamina 0,1%, sulfonilamida 1% e H3PO4 3%) foram
adicionados e as amostras foram incubadas durante 10 minutos. A absorbância final dos poços foi registrada a 540 nm e as concentrações de NO-2 determinadas a partir
de uma curva padrão preparada com NaNO3.
3.8.4. Peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica das membranas celulares foi avaliada pelo método tiobarbitúrico169 em leitor de placas SpectraMax340 a 532 nm. Os macrófagos
aderidos em placas de cultura foram incubados com LAAO (75 U/ml) por 1, 2 e 3 h concomitantemente com células controle. Baseado nos resultados desta curva de tempo, foi escolhido o intervalo de 1 h para avaliar a influência da SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml), L-NAME (1 mM) e AG (500 µM) sobre a peroxidação lipídica. A formação de malondialdeído (MDA), um dos produtos da peroxidação lipídica, é detectada no teste pela reação com o ácido tiobarbitúrico a 100 ºC por 20 minutos. Foi calculada a concentração de produto peroxidado liberado a partir de uma curva padrão de MDA. A peroxidação lipídica foi expressa em mmol de MDA/mg de proteína.
3.9. AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR
3.9.1. Alteração no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)
Alterações no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) foram avaliadas
indiretamente utilizando DiOC6, um fluorocromo que emite luz verde e que acumula na matriz mitocondrial sob a influência do ΔΨm170,171. As células foram incubadas
com LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml) ou AG (500 µM) por 2 h e depois com DiOC6 5 µM por 30 minutos a 37 ºC, seguida por lavagem com PBS. A leitura final foi feita em fluorímetro (SynergyTM H1 Hybrid Reader) a 485 nm de emissão e 538 nm de excitação. Uma redução/queda na intensidade de fluorescência reflete na perda do ΔΨm, em comparação com células
não tratadas.
3.9.2. Fragmentação de DNA
A fragmentação de DNA foi avaliada pelo método convencional de extração de DNA por fenol/clorofórmio. Após a incubação de células com LAAO (75 U/ml), H2O2 (5 µM) ou apenas meio de cultura por 2 h, o sobrenadante foi
descartado e os macrófagos foram raspados da placa. Essas células, juntamente com tampão contendo proteinase e proteinase K, foram incubadas em banho-maria por 1,5 h. Após este tempo, foram adicionados 100 µl de fenol e 100 µl de clorofórmio (incubado em banho de gelo por 10 minutos), e depois feita a centrifugação a 13.500 x g por 10 minutos e o recolhimento do sobrenadante, sendo este procedimento repetido por mais duas vezes. Após a terceira centrifugação, foram adicionados 900 µl de etanol absoluto e 25 µl de acetato de sódio 3 M ao
sobrenadante e o lisado foi armazenado overnight no freezer (para precipitar o DNA). Posteriormente, este lisado foi centrifugado (13.500 x g, 10 minutos), e então o pellet foi recolhido e ressuspenso em água ultrapura. Por último, o DNA foi sujeito a eletroforese em gel de agarose a 1,2 % em tampão TAE (Tris base 40 mM, EDTA 1 mM e ácido acético 20 mM). O gel foi corado com brometo de etídio (0,5 µg/ml) e as bandas foram visualizadas e documentadas pelo fotodocumentador digital (Labview 2.0, Labtrade, SP, Brasil).
3.9.3. Atividade de caspases
A atividade de caspases 3, 8 e 9 foi determinada usando-se substratos colorimétricos específicos, de acordo com o protocolo do fabricante (Sigma) e tendo como base o protocolo de Kumar172. As células tratadas com LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml) ou AG (500 µM) por 2 h foram lisadas (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM CHAPS, 25 mM DTT), incubadas por 30 min a 4 ºC, centrifugadas (16.000 x g, 10 minutos) e, em seguida, congeladas a -80 ºC até realização das atividades. Os ensaios foram feitos com 50 µl de lisado celular (65 µg de proteína), em um volume final de reação de 100 µl.
3.9.3.1. Caspase 3
Para o ensaio de caspase 3, utilizou-se 2 mM do substrato Ac-DEVD-pNA em tampão 20 mM HEPES (pH 7,4), 1% CHAPS, 50 mM DTT e 20 mM EDTA, e o inibidor Ac-DEVD-CHO (20 µM) para o cálculo da atividade. A caspase 3 humana recombinante (0,05 µg, >1000 U/mg proteína) foi usada como controle positivo neste ensaio.
3.9.3.2. Caspase 8
Para a atividade de caspase 8, utilizou-se 200 µM do substrato Ac-IETD- pNA (200 µM) em tampão 20 mM HEPES (pH 7,4), 0,1% CHAPS, 5 mM DTT e 2 mM EDTA, e o inibidor Ac-IETD-CHO (20 µM) para o cálculo da atividade. A caspase 8 humana recombinante (0,1 µg, >500 U/mg proteína) foi usada como controle positivo.
3.9.3.3. Caspase 9
Para a atividade de caspase 9, utilizou-se 200 µM do substrato Ac-LEDH- pNA em tampão 50 mM MES (pH 6,5), 10% PEG 6000, 0,1% CHAPS, 5 mM DTT e 1 mM EDTA, e o inibidor Ac-LEHD-CHO (200 µM) para o cálculo da atividade. A caspase 9 humana recombinante (0,5 µg, >2000 U/mg proteína) foi usada como controle positivo.
As atividades foram expressas em µmol de p-nitroanilina (pNA)/min/ml, calculada a partir de uma curva padrão de pNA. Em todos os ensaios, a absorbância foi lida a 405 nm em um leitor de microplacas SpectraMax 340.
3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média (EPM) do número de experimentos indicado. Os dados foram comparados estatisticamente usando análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey-Kramer, para comparar mais de dois grupos. Um valor de p<0,05 indicou significância.
4. RESULTADOS
4.1 . PURIFICAÇÃO DA LAAO DA PEÇONHA DE BOTHROPS JARARACA 4.1.1. Cromatografia de exclusão molecular (Superdex 75)
O fracionamento da peçonha de B. jararaca em uma coluna Superdex 75 (1,2 x 100 cm) de exclusão molecular mostrou quatro picos principais (P-I a P-IV) (Figura 8). O pico-I (P-I) foi o único que apresentou atividade LAAO, além das atividades amidolítica e proteolítica, indicando a presença de SVSP e SVMP, respectivamente. Este pico foi concentrado por ultrafiltração utilizando filtro Amicon (limite de 3 kDa) para um segundo passo cromatográfico.
Figura 8. Cromatografia de exclusão molecular da peçonha de B. jararaca. A
peçonha (100 mg) foi dissolvida em 0,05 M de Tris-HCl, pH 7,5 contendo 0,01 M de CaCl2 e foi aplicada em uma coluna Superdex 75 (1,2 x 100 cm) acoplada a um
sistema cromatográfico ÄKTA Prime e equilibrada com o mesmo tampão. Fluxo: 0,5 ml/min; frações: 1,5 ml/tubo.
4.1.2.Cromatografia de troca iônica (HiTrap Q-Sepharose)
O pico-I concentrado foi fracionado em uma coluna Hitrap Q-Sepharose de 5 ml de troca iônica utilizando gradiente escalonado de NaCl. O cromatograma na
Figura 9 mostra a presença de cinco picos (P-1 a P-5). O P-1 eluiu em 0% de
tampão B, os picos 2 e 3 eluíram em 25% de tampão B, e os picos 4 e 5 em 50% de tampão B. A atividade LAAO foi encontrada nos picos 3, 4 e 5, porém o pico 4 não apresentou atividade amidolítica e proteolítica, diferentemente do pico 3, que apresentou as três atividades avaliadas.
P-IV
Figura 9. Cromatografia de troca iônica do pico concentrado. O pico ativo (P-I, 25
mg) foi aplicado a uma coluna Q-Sepharose (5 ml) previamente equilibrada com 0,02 M de HEPES, pH 8 e acoplada em sistema cromatográfico ÄKTA Prime. A coluna foi eluída em gradiente escalonado (25%, 50% e 100%) de 0,02 M de HEPES, pH 8, contendo 1 M de NaCl. Fluxo: 1 ml/min; frações: 1 ml/tubo.
Tabela 1. Rendimento da purificação da LAAO de B. jararaca. Etapa de purificação Proteína total
(mg) Rendimento (%) Atividade específica (U/mg) Fator de purificação Peçonha 170,00 100,00 690,12 1,00
Exclusão molecular (P-I) 54,00 31,76 ---- ----
Troca Iônica (BjarLAAO-88) 0,56 0,33 23.069,89 33,4
4.1.3 Determinação da pureza por eletroforese em géis de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC)
Os tubos referentes aos picos P-3 (colunas 2-6), P-4 (colunas 7-9) e P-5 (coluna 10) da cromatografia de troca iônica foram analisados em um gel de 10% de SDS-PAGE em condições redutoras utilizando 0,1% de DTT. O P-4, que possui apenas atividade LAAO, apresentou uma única banda em 88 kDa (Figura 10A). As frações deste pico foram agrupadas e concentradas utilizando filtro Amicon (limite de 50 kDa). Para verificar a pureza da enzima, 100 µg de amostra foram aplicadas em uma coluna C18 Discovery® Bio WidePore por RP-HPLC com gradiente linear de acetonitrila. A Figura 10B mostra um pico simétrico com aproximadamente 30 minutos de tempo de retenção, confirmando a pureza da LAAO isolada.
Figura 10. (A) Perfil eletroforético (SDS-PAGE) da LAAO em gel de 10% (condições
eletroforéticas: 30 mA, 150 V). Colunas: MM - marcador de massa molecular, coluna 1: pico 2 da cromatografia de troca iônica, colunas 2-6: pico 3, colunas 7-9: pico 4 e coluna 10: pico 5. Em todos os casos foram aplicados 20 µg de amostra. Massa molecular relativa da isoforma de LAAO: 88 kDa. (B) A pureza do pico ativo (100 µg) foi monitorada por RP-HPLC em uma coluna C18 Discovery® Bio WidePore equilibrada com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) pH 3,5, e a coluna foi eluída com um gradiente linear de acetonitrila (90% de acetonitrila em TFA 0,1%). Fluxo: 1 ml/min.
4.2. CITOTOXICIDADE E AVALIAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E NITROGÊNIO
4.2.1. Viabilidade celular - captação do vermelho neutro
A viabilidade dos macrófagos alveolares isolados de rato, submetidos à peçonha (A) e à LAAO (B), foi avaliada de acordo com o ensaio de captação do vermelho neutro, como mostra a Figura 11. O vermelho neutro é um corante vital, que atravessa a membrana celular, fixando-se, por ligações eletrostáticas, aos sítios aniônicos da matriz lisossomal apenas de células vivas, sendo possível distinguí-las das células mortas.
A viabilidade celular é medida de acordo com a intensidade da cor da cultura celular. Células controle (C) incubadas apenas com meio de cultura apresentaram 100% de viabilidade celular e células incubadas com Triton X-100 (controle positivo – C+) com 90-100% de morte. Tanto a peçonha quanto a LAAO mostraram citotoxicidade que foi dependente da concentração. No caso da peçonha, as concentrações a partir de 100 μg/ml resultaram em aproximadamente 100% de morte celular, enquanto que a LAAO causou morte dos macrófagos de 70% na