UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
BEATRIZ BARROSO PEREIRA
CITOTOXICIDADE E APOPTOSE CAUSADAS POR L-AMINOÁCIDO OXIDASE DE PEÇONHA DE BOTHROPS JARARACA EM MACRÓFAGOS ALVEOLARES DE
RATOS
CAMPINAS 2017
BEATRIZ BARROSO PEREIRA
CITOTOXICIDADE E APOPTOSE CAUSADAS POR L-AMINOÁCIDO OXIDASE DE PEÇONHA DE BOTHROPS JARARACA EM MACRÓFAGOS ALVEOLARES DE
RATOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Farmacologia
ORIENTADOR: STEPHEN HYSLOP
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA BEATRIZ BARROSO PEREIRA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. STEPHEN HYSLOP.
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
BEATRIZ BARROSO PEREIRA
ORIENTADOR: STEPHEN HYSLOP
MEMBROS:
1. PROF. DR. STEPHEN HYSLOP
2. PROF. DRA. THALITA ROCHA
3. PROF. DRA. JULIANA MINARDI NASCIMENTO
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico em primeiro lugar a Deus que iluminou meu caminho durante esta caminhada. Aos meus pais, Marcos e Dayse, e às minhas irmãs, Érica e Mariane, e a toda minha família que acreditou em mim e sempre me deu muito amor e conselhos valiosos durante todo o percurso. Ao meu namorado Renan, que sempre esteve presente ao meu lado, aconselhando e ajudando em tudo o que podia, além de todo o amor que tem me dado. Ao Raphael, meu amigo e meu companheiro de todos os dias. Nossa amizade, conversas e risadas me ajudaram muito a chegar até aqui. A Patrícia, minha amiga maravilhosa e que me ensinou tanta coisa no laboratório. Seus ensinamentos e seus conselhos são essenciais para a minha vida pessoal e profissional.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Prof. Stephen Hyslop pelo incentivo e paciência nа orientação, além de seus valiosos ensinamentos. Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas e seus professores, por toda a ajuda e por fornecer as condições para a realização deste trabalho. Ao CNPq, pelo apoio financeiro que possibilitou minha dedicação exclusiva para
desenvolver este trabalho. Aos amigos do Departamento de Farmacologia pela amizade e pelos momentos de
descontração. As minhas amigas de Varginha-MG e aos amigos da UNIFAL-MG que mesmo longe sempre me apoiaram. Aos colegas do Laboratório de Farmacologia Bioquímica por serem tão solícitos quando precisei de ajuda em diferentes etapas deste trabalho e pelos momentos de descontração. Ao Frank pela colaboração neste trabalho. Agradeço aos técnicos Patrícia Costa Panunto e José Ilton dos Santos pela amizade e grandiosa ajuda em diferentes experimentos. Aos secretários Cidinha, Maísa e Gustavo por todo o auxílio e disposição sempre que precisei. Aos funcionários do biotério do Departamento de Farmacologia, Miguel, Antonio, Aguinaldo e Ivani, pelo cuidado e dedicação aos animais. Aos animais que deram suas vidas em benefício da pesquisa científica.
“Tenho em mim todos os sonhos do mundo”
Fernando Pessoa
RESUMO
A L-aminoácido oxidase (LAAO) é uma enzima amplamente distribuída em peçonhas animais, especialmente de serpentes. Diversos estudos já demonstraram que as LAAOs exercem uma variedade de atividades biológicas, tais como inibição ou estimulação da agregação plaquetária, formação de edema e indução de apoptose, além de ação antimicrobiana, antiviral, antiparasitária e antitumoral. Acredita-se que a maioria das atividades biológicas da LAAO seja devido à liberação de H2O2 durante sua atividade enzimática. Os macrófagos
desempenham papel importante na resposta inflamatória, tendo a capacidade de liberar citocinas e outros mediadores, como espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs). Neste trabalho, a atividade citotóxica e apoptótica de uma isoforma de 88 kDa de LAAO (BJarLAAO88) purificada da peçonha de B. jararaca através de uma combinação de cromatografias de gel filtração e troca iônica foi avaliada em macrófagos alveolares de rato. A peçonha de B. jararaca (10-1000 µg/ml) e a BJarLAAO88 (2,5-250 U/ml) foram citotóxicas em macrófagos em apenas 2 h. A citotoxicidade foi confirmada pela liberação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio extracelular. A BJarLAAO88 estimulou a produção de EROs intracelulares, H2O2 e NO por macrófagos e induziu a peroxidação lipídica (pelo
aumento da formação de malondialdeído). Quando coincubados com LAAO, a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e aminoguanidina (AG) reverteram parcialmente ou totalmente a citotoxicidade, e atenuaram a formação de EROs e ERNs. BJarLAAO88 alterou o potencial de membrana mitocondrial e seu efeito foi abolido pela incubação com CAT e AG, mas não com SOD. A fragmentação de DNA e aumento das atividades das caspases 3, 8 e 9, indicadores de apoptose, foram vistos em macrófagos incubados com BJarLAAO88; o aumento da atividade das caspases foi inibido ou abolido pela SOD, CAT e AG. Estes resultados mostram que LAAO da peçonha de B. jararaca é citotóxica para macrófagos alveolares de rato principalmente pela produção de H2O2 e subsequente formação de EROs e
ERNs. Essas espécies reativas causam peroxidação lipídica e ativação das vias intrínseca e extrínseca da apoptose. Essas atividades da LAAO podem ser um fator relevante nas respostas locais ao envenenamento por B. jararaca.
Palavras-chave: L-Aminoácido oxidase, apoptose, Bothrops jararaca, estresse oxidativo, macrófagos, peçonha
ABSTRACT
L-Amino acid oxidase (LAAO), an enzyme widely distributed in animal venoms, exerts biological activities such as inhibition or stimulation of platelet aggregation, edema formation and induction of apoptosis, as well as antimicrobial, antiviral, antiparasite and antitumoral activities. Many of these activities are mediated by H2O2 formed during LAAO activity. Macrophages play an important role in the
inflammatory response to Bothrops venoms by releasing cytokines and mediators such as oxygen reactive species (ROS) and nitrogen reactive species (RNS). In this work, the cytotoxicity and apoptotic activity of an 88 kDa LAAO isoform (BJarLAAO88) purified from Bothrops jararaca venom by a combination of gel filtration and ion exchange cromatographies was assessed in rat alveolar macrophages. Bothrops jararaca venom (10-1000 µg/ml) and BJarLAAO88 (2.5-250 U/ml) were cytotoxic to macrophages after only 2 h. Cytotoxicity was confirmed by the release of lactate dehydrogenase. BJarLAAO88 stimulated ROS, H2O2 and nitric
oxide (NO) production by macrophages and induced lipid peroxidation (seen as increased malondialdehyde formation). When co-incubated with LAAO, superoxide-dismutase (SOD), catalase (CAT) and aminoguanidine (AG) partially or totally reversed the cytotoxicity and attenuated ROS and RNS formation. BJarLAAO88 partially dissipated the mitochondrial membrane potential and this effect was largely abolished by co-incubation with CAT and AG, but not by SOD. DNA fragmentation and increased activity of caspases 3, 8 and 9, indicative of apoptosis, were seen in macrophages incubated with BJarLAAO88; the increases in caspase activities were markedly inhibited or abolished by SOD, CAT and AG. Together, these results show that B. jararaca LAAO is cytotoxic to rat alveolar macrophages primarily via the production of H2O2 and subsequent formation of ROS and RNS. These reactive
species cause lipid peroxidation and activation of the intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis. These activities of LAAO could be a relevant factor in the local responses to envenoming by B. jararaca.
Keywords: L-Amino acid oxidase, apoptosis, Bothrops jararaca, macrophages, oxidative stress, venom.
LISTA DE FIGURAS
Figura Legenda Pág.
1 Fenótipos M1 e M2 de macrófagos durante a resposta inflamatória 24
2 Mecanismo geral da reação enzimática catalisada pela LAAO... 26
3 Esquema da formação das principais EROs e ERNs e o sistema antioxidante enzimático... 29
4 Reação enzimática catalisada pela NO sintase com a formação de óxido nítrico (NO)... 30
5 Representação das fases das reações envolvidas na peroxidação lipídica... 31
6 Esquema das vias extrínseca e intrínseca envolvidas na apoptose. 33
7 Imagem de microscopia óptica obtida do lavado broncoalveolar realizado em ratos machos Wistar comprovando a presença de macrófagos... 42
8 Cromatografia de exclusão molecular da peçonha de B. jararaca.... 46
9 Cromatografia de troca iônica do pico com atividade LAAO do passo anterior... 49
10 Perfil eletroforético (SDS-PAGE) da LAAO e a pureza do pico ativo monitorada por RP-HPLC... 50
11 Viabilidade de macrófagos após incubação com peçonha de B. jararaca (10-1000 g/ml) e LAAO (2,5-250 U/ml) pelo ensaio de redução do vermelho neutro após 2 h... 51
12 Influência do tempo de incubação na citotoxicidade da LAAO. Os macrófagos foram incubados com LAAO (75 U/ml) por 2, 6 e 24 h antes da avaliação da morte celular... 52
13 Liberação de LDH por macrófagos incubados com LAAO (75 U/ml) por 2, 6 e 24 h... 53
14 Espécies reativas de oxigênio liberadas por macrófagos incubados com LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença de superóxido dismutase (SOD, 40 U/ml), catalase (CAT, 100 U/ml), L-NAME (LN, 1 mM) ou aminoguanidina (AG, 500 µM) após 2 h... 54
15 Produção de H2O2 por macrófagos incubados com peçonha de B.
jararaca (100 µg/ml) e LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença de catalase (100 U/ml), SOD (40 U/ml), L-NAME (LN, 1 mM) ou AG (500 µM)... 55
16 Produção de óxido nítrico por macrófagos incubados com LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml), L-NAME (LN, 1 mM) ou AG (500 µM) após 2 h... 56
Figura Legenda Pág. 17 Peroxidação lipídica em macrófagos controle e incubados com
LAAO (75 U/ml) em diferentes tempos e Peroxidação lipídica em macrófagos incubados com LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml), L-NAME (LN, 1 mM) ou AG (500 µM) por 1 h... 57
18 Atenuação da citotoxicidade da LAAO (75 U/ml) em macrófagos na presença de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml) ou AG (500 µM) que foi avaliado pelo ensaio de redução do vermelho neutro após 2 h... 58
19 Alteração do potencial de membrana mitocondrial em macrófagos incubados com LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml) ou AG (500 µM) após 2 h... 59
20 Fragmentação de DNA extraído de macrófagos previamente incubados com LAAO (75 U/ml) e H2O2 (5 µM) por 2 h... 60 21 Atividade de caspases 3, 8 e 9 em macrófagos incubados com
LAAO (75 U/ml) na ausência ou presença de SOD (40 U/ml), CAT (100 U/ml) ou AG (500 µM) após 2 h... 61
22 Esquema hipotético da ação citotóxica da BJarLAAO88 em macrófagos baseado nos achados deste estudo... 68
LISTA DE TABELAS
Tabela Legenda Pág.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Abreviação/Sigla Definição Abs Absorbância Ac-DEVD-CHO N-Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-al Ac-DEVD-pNA N-Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilina Ac-IETD-CHO N-Acetil-Ile-Glu-Thr-Asp-al Ac-IETD-pNA N-Acetil-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilina Ac-LEDH-pNA N-Acetil-Leu-Glu-His-Asp-p-nitroanilina Ac-LEHD-CHO N-Acetil-Leu-Glu-His-Asp-al AG L-AminoguanidinaAIF Fator de indução de apoptose (Apoptosis-inducing factor) ANOVA Teste de análise de variância
APA-1 Fator ativador de apoptose
(Apoptosis protease activating factor 1)
ATP Trifosfato de adenosina
BapNA N-Benzoil-L-arginina p-nitroanilida
BH4 Tetraidrobiopterina
BPP Peptídeo potencializador de bradicinina
CAD DNAse ativada por caspase (Caspase-activated DNase)
CAT Catalase
CHAPS 3-[(3-Colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanosulfonato CNP Peptídeo natriurético do tipo-C
COX-2 Cicloooxigenase-2
DCF Diclorofluoresceína
DCFH-DA Diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína DiOC6 Iodeto de 3,3'-diexiloxacarbocianina DISC Death-inducing signaling complex
DNA Ácido desoxirribonucleico
DTT Ditiotreitol
ECA Enzima conversora de angiotensina EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético
Abreviação/Sigla Definição
ERN Espécie reativa de nitrogênio
ERO Espécie reativa de oxigênio
FAD Flavina adenina dinucleotídeo
FADD Proteina associada à Fas com domínio de morte (Fas-associated protein with death domain) Fas Proteína da superfamília TNF, membro 6
FLIP FLICE-inhibitory protein
FMN Flavina mononucleotídeo
GM-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos
(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) H2O2 Peróxido de hidrogênio
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico
IFN- Interferon-
IL-1 Interleucina-1
IL-10 Interleucina-10
IL-1 Interleucina-1
IL-6 Interleucina-6
iNOS NO sintase induzível
kDa kiloDaltons
L● Radical lipídico
LAAO L-Aminoácido oxidase
LDH Lactato desidrogenase
L-NAME Nɷ-L-nitroarginina metil ester
LOO● Radical peroxila
LOOH Radical hidroperóxido
M-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos (Macrophage colony-stimulating factor)
MDA Malondialdeído
MES Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfonico
MHC Complexo principal de histocompatibilidade (Major histocompatibility complex)
Abreviação/Sigla Definição
NADPH Fosfato de dinucleótideo de nicotinamida e adenina (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
nNOS NO sintase neuronal
NO Óxido nítrico
NO2- Radical nitrito
NO3- Radical nitrato
NOS NO sintase
NR Vermelho neutro (Neutral red)
O2 Oxigênio molecular
O2- Radical superóxido
OH● Radical hidroxila
ONOO- Peroxinitrito
PARP Poly (ADP-ribose) polymerase
PBS Tampão fosfato-salina (Phosphate-buffered saline)
PEG Polietilenoglicol
PLA2 Fosfolipase A2
pNA Para-nitroanilina
RP-HPLC Cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa (Reversed-phase high-performance liquid chromatography) RPMI 1640 Meio de cultura celular (Roswell Park Memorial Institute
1640)
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
SEM Erro padrão da média
SFB Soro fetal bovino
SMAC/DIABLO Segundo ativador mitocondrial de caspase/Proteína de ligação-IAP direta com baixo pI
SOD Superóxido dismutase
SVMP Metaloprotease proveniente de peçonha ofídica (Snake venom metalloproteinase)
SVSP Serinoprotease proveniente de peçonha ofídica (Snake venom serine protease)
Abreviação/Sigla Definição
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (Thiobarbituric acid-reactive substances) TFA Ácido trifluoroacético (Trifluoroacetic acid) TGF- Fator de transformação do crescimento
(Transforming growth fator-) TNF- Fator de necrose tumoral
(Tumor necrosis factor-)
Triton X-100 Éter polietileno glicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil XAIP Fator de inibição de apoptose
(X-linked inhibitor of apoptosis protein) ΔΨm Potencial de membrana mitocondrial
SUMÁRIO
Pág.
1. INTRODUÇÃO... 20
1.1. ENVENENAMENTO BOTRÓPICO... 20
1.2. MACRÓFAGOS... 22
1.3. L-AMINOÁCIDO OXIDASE OFÍDICA... 26
1.4. ESTRESSE OXIDATIVO... 28
1.5. APOPTOSE... 31
1.6. TOXINOLOGIA DA Bothrops jararaca... 34
2. OBJETIVOS... 37 2.1. GERAL... 37 2.2. ESPECÍFICOS... 37 3. MATERIAIS E MÉTODOS... 38 3.1. REAGENTES E PEÇONHA... 38 3.2. ANIMAIS... 38
3.3. PURIFICAÇÃO DA LAAO DE Bothrops jararaca... 38
3.3.1. Cromatografia de gel filtração (Superdex 75)... 39
3.3.2. Cromatografia de troca iônica (HiTrap Q-Sepharose)... 39
3.3.3. Pureza da proteína isolada... 39
3.3.3.1. Eletroforese em géis de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)... 39
3.3.3.2. Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa... 40 3.4. QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS... 40 3.5. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS... 40 3.5.1. Atividade LAAO... 40 3.5.2. Atividade proteolítica... 41 3.5.3. Atividade amidolítica... 41
3.6. ISOLAMENTO E CULTURA DE MACRÓFAGOS... 41
3.7. CITOTOXICIDADE... 42
3.7.1. Viabilidade celular (captação do vermelho neutro)... 42
3.8. AVALIAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E NITROGÊNIO... 43
3.8.1.Espécies reativas de oxigênio (EROs)... 43
3.8.2. Peróxido de hidrogênio (H2O2)... 44
3.8.3. Óxido nítrico (NO)... 44
3.8.4. Peroxidação lipídica... 44
3.9. AVALIAÇÃO DE MORTE CELULAR... 45
3.9.1. Alteração no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)... 45
3.9.2. Fragmentação de DNA... 45 3.9.3. Atividade de caspases... 46 3.9.3.1. Caspase-3... 46 3.9.3.2. Caspase-8... 46 3.9.3.3. Caspase-9... 47 3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 47 4. RESULTADOS... 48
4.1. PURIFICAÇÃO DA LAAO DA PEÇONHA DE Bothrops jararaca... 48
4.1.1. Cromatografia de exclusão molecular (Superdex 75)... 48
4.1.2. Cromatografia de troca iônica (HiTrap Q-Sepharose)... 48
4.1.3. Determinação da pureza por eletroforese em géis de poli- acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP- HPLC)... 49
4.2. CITOTOXICIDADE E AVALIAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E NITROGÊNIO... 50
4.2.1. Viabilidade celular - captação do vermelho neutro... 50
4.2.2. Liberação de lactato desidrogenase (LDH) ... 52
4.2.3. Espécies reativas de oxigênio (EROs)... 53
4.2.4. Peróxido de hidrogênio (H2O2)... 54
4.2.5. Óxido nítrico (NO)... 55
4.2.6. Peroxidação lipídica... 56
4.2.7. Viabilidade celular – captação do vermelho neutro... 57
4.3. AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR... 58
4.3.1. Alteração no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)... 58
4.3.2. Fragmentação de DNA... 59
5. DISCUSSÃO... 62
6. CONCLUSÃO... 69
7. REFERÊNCIAS... 70
1. INTRODUÇÃO
1.1. ENVENENAMENTO BOTRÓPICO
O envenenamento por serpentes é um problema de saúde pública que ocorre principalmente em países tropicais e subtropicais1 e que recentemente foi reintroduzida à lista das doenças negligenciadas no mundo pela Organização Mundial da Saúde (OMS)2. Os acidentes são mais comuns em regiões de alta temperatura e onde a agricultura é uma das principais atividades econômicas3. A prevalência dos acidentes é de aproximadamente 2,5 milhões de casos por ano, com 125 mil mortes por ano, e 100 mil casos com sequelas físicas e psicológicas1,4.
No Brasil, os dados epidemiológicos indicam que esta prevalência é de aproximadamente 20 mil casos, com 125 mortes por ano5,6. Em nosso país, encontram-se quatro principais gêneros de serpentes peçonhentas: Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus7, sendo que a maioria dos acidentes ofídicos é causada por serpentes do gênero Bothrops7,8. Bothrops jararaca é a espécie que mais causa acidentes ofídicos devido à sua ampla distribuição geográfica e por ser encontrada em áreas mais populosas no país, sendo que a maior taxa de envenenamento por esta espécie ocorre durante períodos chuvosos e quentes9-11.
As serpentes do gênero Bothrops pertencem à família Viperidae e subfamília Crotalinae. As espécies mais encontradas no território brasileiro são: B. atrox e B. brazili (Norte), B. erythromelas (Nordeste), B. neuwiedi e B. moojeni (Centro-Oeste e Sudeste), e B. alternatus, B. jararaca e B. jararacussu (Sul e Sudeste)7. Essas serpentes têm comportamento agressivo quando ameaçadas e possuem hábitos noturnos e crepusculares. Elas geralmente vivem na zona rural ou na periferia de cidades grandes e preferem ambientes úmidos, como florestas, áreas de plantação e lugares onde há proliferação de roedores12,13.
O envenenamento botrópico é conhecido por causar manifestações locais e sistêmicas. Nas manifestações locais, há dano tecidual no local da picada, com presença de eritema, equimose, hemorragia, dor, edema, mionecrose e bolhas7,12. Além disso, nos casos mais graves, pode ocorrer desenvolvimento da síndrome compartimental, levando a sequelas e perda funcional ou anatômica do membro8,14,15. Nas manifestações sistêmicas, ocorrem hemorragias através de ferimentos pré-existentes, alterações da coagulação, náuseas, vômitos, hipotensão arterial, sudorese, choque hipovolêmico, e insuficiência renal aguda16,17.
O dano local é ocasionado principalmente pela ação das metaloproteases (SVMP – snake venom metalloproteases), fosfolipases (PLA2), serinoproteases
(SVSP – snake venom serine proteases), e outras proteínas como desintegrinas e lectinas do tipo-C11,12. A lesão local é dividida em três fases: aguda (<12 h), onde ocorre a formação de edema, mionecrose e hemorragia; intermediária (12 a 72 h), onde se percebe um aumento na resposta inflamatória; e crônica (>72 h) onde há regeneração muscular18.
A resposta inflamatória após envenenamento tem uma importância sobre a evolução do tecido lesionado17 e está associada à presença de edema, dor, infiltrado de leucócitos e liberação de mediadores19. Alguns dos mediadores inflamatórios observados no envenenameno botrópico incluem histamina, bradicinina, óxido nítrico e eicosanoides20. A inflamação associada ao envenenamento é caracterizada primeiramente pela formação de edema, que ocorre por uma alteração no fluxo e calibre dos capilares próximos ao dano local, ocasionando, então, aumento da permeabilidade vascular e extravasamento de proteínas17,19. Este edema decorre da ação de SVMPs (levando à ruptura da microvasculatura), PLA2 (desgranulação dos mastócitos, liberando histamina, além
de estimular a liberação do ácido araquidônico) e SVSPs (liberação de autacóides como a bradicinina)21,22.
Observa-se, também, ativação do sistema complemento e um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias por células próximas ao dano, como mastócitos, macrófagos residentes e células endoteliais, liberando IL-1, IL-6, TNF-, IFN- Além do aumento da expressão da COX-2, com consequente produção de prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxano23. Esses mediadores inflamatórios estimulam a migração de leucócitos para o local do dano. A migração celular é mediada pela expressão de moléculas de adesão como selectina e CD-18, que permitem a adesão e rolamento dos leucócitos na parede vascular e a transmigração para o tecido extravascular24. Os neutrófilos recrutados produzem peróxido de hidrogênio (H2O2) e óxido nítrico (NO) que contribuem para a degradação do
material fagocitado.
Posteriormente, ocorre a fase de reparo, em que há uma diminuição das citocinas pró-inflamatórias e aumento das citocinas anti-inflamatórias. Os neutrófilos, então, sofrem apoptose em decorrência de uma produção aumentada de EROs, que
leva ao estresse oxidativo25,26. E os macrófagos recrutados para o sítio inflamatório fagocitam esses neutrófilos, e também ajudam a restaurar a homeostasia produzindo fatores de crescimento e contribuem para a reorganização da matriz extracelular27,28.
A produção de diferentes mediadores inflamatórios já foi observada em soro de camundongos injetados com peçonha de Bothrops asper, onde se verificou altas concentrações de IL-6 e IL-129. Essa produção também foi observada por Barros et al.30 com esta mesma peçonha: aumento de IL-6, IL-10 e IFN- após 4 h da injeção, sendo que o IFN- apresentou outro pico de produção em 12 h, enquanto que a presença de TNF- só foi observada em 18 h; a produção de NO foi mantida até 24 h após inoculação da peçonha.
Foi observado um infiltrado celular em músculo esquelético após a injeção da peçonha de B. asper, ocorrendo um pico máximo em 48 h. As células encontradas neste infiltrado incluiram linfócitos, neutrófilos e macrófagos. Os autores concluíram que os linfócitos não têm um papel significativo no dano local, enquanto que macrófagos e neutrófilos possuem um papel muito importante, onde, nas primeiras horas, há uma maior presença de neutrófilos e, em tempos mais prolongados, prevalecem os macrófagos18.
Já a degeneração muscular envolve a atividade de fosfolipases A2 (PLA2)
como a bothropstoxina-II, uma PLA2 de Bothrops jararacussu que causa
degeneração do músculo com a fagocitose do material necrótico de fibras musculares por macrófagos e neutrófilos31.
1.2.MACRÓFAGOS
Os macrófagos são células provenientes da linhagem mieloide mononuclear da medula óssea. Na circulação sanguínea, se encontram como monócitos e, quando migram para o tecido conjuntivo, se diferenciam em macrófagos, com aumento de tamanho e da capacidade fagocítica32,33. Os monócitos e macrófagos respondem às M-CSF e GM-CSF, duas glicoproteínas que controlam a proliferação e migração dessas células34.
Os macrófagos são encontrados nos pulmões, baço, fígado, linfonodos e cavidades pleural e peritoneal35. São leucócitos com forma geralmente oval, com contornos irregulares, núcleo descentralizado e citoplasma com grande presença de
vacúolos e lisossomos, podendo também apresentar pseudópodes36. Esses leucócitos estão envolvidos tanto na imunidade inata quanto na imunidade adquirida. A fagocitose dos macrófagos representa o início da resposta inata e, durante esse processo, produzem H2O2 e NO para degradar o material fagocitado37. Na
imunidade adquirida, atuam no reconhecimento e apresentação de antígenos via moléculas MHC, desencadeando a resposta mediada por linfócitos T35.
Quando ativados, os macrófagos liberam diferentes citocinas, tanto pró-inflamatórias quanto anti-pró-inflamatórias37. As citocinas pró-inflamatórias produzidas, como IL-1, IL-6, IFN- e TNF-, são responsáveis por iniciar o efeito inflamatório contra o agente ofensivo. Já as citocinas anti-inflamatórias, como IL-10, são produzidas para manter a homeostasia38. O IFN- é muito importante por induzir a expressão de iNOS em macrófagos e, consequentemente, a produção de NO, enquanto que a IL-10 inibe o IFN-, destacando a importância do equilíbrio na produção de citocinas anti- e pró-inflamatórias39. Além disso, os macrófagos também produzem quimiocinas, componentes do sistema complemento, e prostaglandinas, essenciais para o processo inflamatório26,39.
Os macrófagos se apresentam com dois fenótipos, M1 e M2 (Figura 1). Os M1 são caracterizados por um perfil inflamatório, já que produzem as citocinas IL-1, IL-6, IL-12, TNF- e NO26, possuem maior ação citotóxica40 e maior capacidade para apresentar antígenos41. Após a fagocitose dos neutrófilos que sofreram apoptose, o fenótipo desta célula muda para M2, iniciando a liberação de citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 e vários fatores de crescimento, buscando a restauração da homeostasia26,34. Assim, nota-se que os macrófagos têm como funções: fagocitose, apresentação de antígeno, produção de citocinas inflamatórias e restauração da homeostasia42, também designado pelo termo “capacidade dos 3 R’s” (reconhecimento, resposta e resolução)43
.
Há vários estudos indicando o envolvimento de macrófagos frente à ação de peçonhas botrópicas e seus componentes isolados. As peçonhas de Bothrops lanceolatus, Bothrops asper e Bothrops erythromelas44,45 induzem a quimiotaxia de leucócitos na cavidade peritoneal e essa migração celular é dependente dos macrófagos peritoneais. Também foi observado que a jararagina, uma SVMP de peçonha de B. jararaca46, induziu a migração celular dependente de macrófagos
residentes, sugerindo que macrófagos são peças-chave no dano local após o envenenamento, provavelmente por serem ativados e produzirem citocinas que atuam como agentes quimiotáticos para neutrófilos44-46.
Figura 1. Fenótipos M1 e M2 de macrófagos durante a resposta inflamatória34.
A incubação de macrófagos com peçonha de B. asper e uma PLA2
isolada desta peçonha estimulou a liberação do ácido araquidônico e produção de prostaglandinas (PGE2 e PGD2) pelo aumento da expressão de COX-247,48, sendo
que foi visto que este papel inflamatório da PLA2 envolve a ativação do NF-κB, as
quinases p38MAPK e PKC49,e o receptor toll-like tipo 2 (TLR2)50.
Zamuner et al.51 mostraram que as peçonhas de B. asper e B. jararaca induziram a fagocitose e produção de H2O2 e NO em macrófagos in vitro. Essa
produção de NO foi inibida por inibidores da NO sintase (NOS) tais como o L-NAME, inibidor inespecífico para todas as isoformas da NOS, e aminoguanidina, inibidor específico para a forma induzível, indicando que o NO produzido era proveniente da
isoforma induzível. A produção do NO por macrófagos também foi observada após incubação com crotamina, toxina proveniente da peçonha de Crotalus durrissus terrificus, e que aumentou a expressão de iNOS e a produção de TNF-α52
.
A MT-II e MT-III, PLA2 cataliticamente ativa e inativa, respectivamente, da
peçonha de B. asper, aumentaram a capacidade fagocitária, bem como a produção de H2O2 em macrófagos in vitro53. A produção de superóxido (O2-) por essas células
foi vista quando se incubou diferentes PLA2 básicas de B. asper e de B. atrox54,55.
Corrêa et al.56 observaram que uma PLA2 Lys49 (cataliticamente inativa) da peçonha
de B. neuwiedi urutu induziu a produção de IL-1β e foi citotóxica para macrófagos em altas concentrações. A estimulação de macrófagos com BjcuL, uma lectina da peçonha de B. jararacussu, também levou à produção de H2O2 e de citocinas como
IL-6, GM-CSF e TNF-57, o que não ocorreu com uma PLA2 de B. asper, que não
induziu a produção de TNF- em macrófagos58.
1.3.L-AMINOÁCIDO OXIDASE OFÍDICA
A L-aminoácido oxidase (LAAO: O2 oxidoredutase, EC 1.4.3.2) é uma
enzima que catalisa a reação de desaminação oxidativa de L-aminoácidos. Na primeira meia-reação, há formação de iminoácido pela redução do cofator flavina adenina dinucleotídeo (FAD). O iminoácido, então, é hidrolisado, formando -cetoácido e amônia. A reação catalítica termina quando o cofator FAD é reoxidado pelo oxigênio molecular, gerando peróxido de hidrogênio (H2O2)59,60 (Figura 2).
A LAAO tem preferência por aminoácidos hidrofóbicos e aromáticos, como leucina, metionina, arginina e triptofano61. É também considerada uma flavoenzima, por ser a única enzima de peçonhas dependente do grupo prostético FAD ou flavina mononucleotídeo (FMN) para que ocorra sua reação enzimática. O cofator FAD é que dá a coloração amarela às peçonhas, característica esta que pode ser usada para monitorar a purificação da enzima62.
A LAAO é amplamente distribuída em peçonhas de serpentes das famílias Crotalidae e Elapidae59,64, podendo constituir até 30% da proteína de algumas peçonhas65. A LAAO já foi purificada da peçonha de diversas espécies de Bothrops66,67, como B. alternatus68, B. asper69,70,71, B. atrox72, B. insularis60, B. jararaca73,74, B. leucurus75, B. marajoensis62, B. matogrossensis76, B. moojeni77,78, B. pauloensis79, B. pirajai61 e B. jararacussu80. Algumas destas enzimas botrópicas já foram cristalizadas e sua estrutura parcialmente estudada, como as de B. atrox e B. jararacussu81,82.
As LAAOs ofídicas são classificadas como glicoproteínas ácidas monodiméricas ou homodiméricas, possuem um ponto isoelétrico entre 4,4 e 8,5, e massa molecular entre 110 e 150 kDa em condições não-desnaturantes, e entre 50 e 70 kDa em condições redutoras80. São documentados três domínios em sua molécula: domínio de ligação ao FAD, domínio de ligação ao substrato e domínio helicoidal, que envolve a dimerização da proteína80. A LAAO também tem a capacidade de se apresentar em diferentes isoformas (ácidas, básicas e neutras) dentro da mesma peçonha68,83,84, provavelmente devido aos diferentes graus de glicosilação das proteínas, porém a relevância das isoformas e glicosilação nas atividades biológicas ainda é pouco conhecida74. A apoxina-1, uma LAAO isolada da peçonha de Crotalus atrox, perde sua atividade catalítica quando deglicosilada, sugerindo um papel importante dos carboidratos em mediar as atividades enzimática e biológica desta LAAO83. Por outro lado, a deglicosilação não afetou a atividade das LAAOs de B. pauloensis, B. jararaca, B. alternatus e B. moojeni84.
As LAAOs de diferentes peçonhas apresentam diferenças na estabilidade, especificidade e atividades biológicas60. A enzima é conhecida por induzir citotoxicidade72,85, apoptose86-88, edema89, inibir ou ativar agregação plaquetária
72,90-92
, causar hemorragia68,93, e possuir atividades anticoagulante94, antimicrobiana61,68,78,93,94 e antiparasitária62,74,79,95. A maioria destas atividades tem
sido atribuída à formação do H2O2 durante a reação enzimática86,96, uma vez que a
catalase e a glutationa abolem a indução de agregação plaquetária pela LAAO isolada da peçonha de B. atrox72, e também abolem as ações antimicrobiana, antileishmania e hemolítica da LAAO de peçonha de B. jararaca74, e as ações citotóxica e apoptótica da LAAO de peçonhas de Lachesis muta97 e Trimeresurus flavoviridis98, respectivamente.
Araki et al.99 foram os primeiros a mostrar que peçonhas ofídicas com maior atividade hemorrágica causavam apoptose em células endoteliais vasculares, prolongando o sangramento. Mais tarde, dois grupos de pesquisadores86,100 descobriram que o componente da peçonha que causava apoptose era LAAO, e que a potência para induzir a apoptose dependia da linhagem celular. Desde então, a ação apoptótica da LAAO tem sido investigada em diversos tipos celulares, tais como células de leucemia linfocítica de camundongos L1210 e leucemia linfoblástica humana T MOLT-4100, leucemia mielóide HL-6086, células embrionárias renais humanas 293T83 e células monocíticas humanas MM6101.
A apoptose causada pela LAAO é atribuída principalmente ao estresse oxidativo causado na célula pela alta produção de H2O2 proveniente da reação
enzimática64,102. De fato, quando o domínio do grupo prostético FAD (co-fator necessário para a atividade enzimática) é eliminado, as ações citotóxicas e apoptóticas da LAAO também são abolidas86. O H2O2 inibe a expressão de Fas em
células endoteliais por vias de sinalização envolvendo a tirosina quinase103, além de ativar a via intrínseca ou mitocondrial da cascata de apoptose84,104 e aumentar a atividade da caspase 3, uma protease executora da cascata de apoptose105. Entretanto, alguns trabalhos100,106 relataram que o efeito apoptótico da LAAO é mediado apenas parcialmente pelo efeito do H2O2, já que a catalase reduziu
somente em parte este efeito da LAAO. Isso também corrobora com o fato de que a inativação da enzima pelo processo de congelamento e descongelamento não comprometeu a citotoxicidade da LAAO causada em células de adenocarcinoma mamário MCF-7107, sugerindo, então, que a enzima pode induzir uma pertubação no sistema redox, levando a um aumento de ROS intracelular, como a doxirrubicina, um medicamento quimioterápico, ou o envolvimento de ligação a algum receptor de membrana celular100,106,107.
Suhr e Kim108 mostraram que os efeitos causados pelo H2O2 exógeno e
LAAO na indução de apoptose em células MOLT-4 eram diferentes, tanto pelo tempo de redução de viabilidade celular e produção de EROs quanto pelo padrão de fragmentação do DNA. Esses fatos levaram os autores a sugerir a formação de EROs intracelulares pela LAAO através do H2O2 gerado extracelularmente. A LAAO
provavelmente se ancora na membrana109 e reage com aminoácidos encontrados no meio de cultura celular, produzindo o H2O288,100,110, que é permeável à membrana
celular. O H2O2 também pode se concentrar perto da membrana celular, levando à
oxidação de lipídios, alterando a permeabilidade da membrana celular e, consequentemente, gerando estresse oxidativo, com maior formação de espécies reativas de oxigênio e alterações metabólicas80,84,108. Entretanto, Torii et al.83 observaram que a LAAO encontrada na peçonha de C. atrox não se associa à membrana celular. Essas observações divergentes podem refletir variações nas propriedades de LAAOs isoladas de diferentes espécies de serpentes e também diferenças nas linhagens celulares estudadas111. Na maioria dos trabalhos, a apoptose causada pela LAAO está relacionada com ativação das vias extríseca e intrínseca do processo apoptótico96. Acredita-se que na via intrínseca, também chamada de via mitocondrial, o aumento de EROs intracelular cause um desarranjo na membrana mitocondrial, levando à liberação de proteínas pró-apoptóticas para o citoplasma, que desencadeiam o processo de apoptose na célula112,113.
1.4.ESTRESSE OXIDATIVO
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são moléculas derivadas do oxigênio molecular (O2), e incluem o ânion superóxido (O2●-), radical hidroxila (OH●)
e peróxido de hidrogênio (H2O2), enquanto que as espécies reativas de nitrogênio
(ERNs) são geradas do óxido nítrico (NO), e incluem o peroxinitrito (ONOO-, formado por interação com O2●), nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-)114. A produção de
EROs e ERNs por células tem muita importância em ações biológicas, como fagocitose, reatividade vascular, sinalização celular e manutenção da homeostasia115. Para manter o equilíbrio da formação dessas espécies, as células possuem um mecanismo antioxidante bastante eficiente. O estresse oxidativo celular ocorre quando há um aumento exacerbado de produção de EROs e ERNs, ocorrendo um desequilíbrio entre os mecanismos pró-oxidantes e antioxidantes,
prevalecendo os mediadores pró-oxidantes116. Com esse desequilíbrio, as EROs e ERNs podem reagir com proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos nucleicos, alterando funções e estruturas celulares117.
A formação das espécies reativas acontece primeiramente pelo oxigênio molecular (O2), que ganha um elétron por diferentes fontes encontradas nas células,
por exemplo, pela enzima NADPH oxidase encontrada na membrana celular, pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial ou pela xantina oxidase que se encontra no citoplasma, formando o ânion superóxido (O2●-). Este O2●- pode reagir
com NO, formando peroxinitrito (ONOO-), que é muito reativo e pode alterar funções e estruturas celulares. Alternativamente, este O2●- pode ganhar dois prótons e um
elétron pela reação de dismutação catalisada pela superóxido dismutase (SOD), formando o H2O2. O H2O2,então, pode reagir com íons ferro ou cobre pela reação de
Fenton, formando o radical hidroxila (OH●), que também é muito reativo, reagindo com componentes celulares118,119 (Figura 3).
O sistema antioxidante é constituído de compostos enzimáticos e não enzimáticos. Dentro dos compostos enzimáticos, encontram-se a SOD, que catalisa a reação de dismutação produzindo H2O2120,a catalase, que decompõe o H2O2 em
H2O e O2115, e aglutationa peroxidase e a tioreodoxina redutase, que decompõem as
EROs pela oxidação da glutationa e tireodoxina reduzida, respectivamente121. Dentre os antioxidantes não enzimáticos, há, por exemplo, as vitaminas A, C e E e o ácido úrico122.
Figura 3. Esquema da formação das principais EROs e ERNs e o sistema
antioxidante enzimático123. GPx – glutationa peroxidase, GR – glutationa redutase, GSH – glutationa reduzida, GSSG – glutationa oxidada, Prx – peroxidase, Trx – tioredoxina, TrxR – tioredoxina redutase.
As ERNs são primeiramente produzidas pela formação de NO pela enzima NO sintase (NOS), onde há oxidação de um dos nitrogênios do aminoácido L-arginina, que é convertido em L-citrulina, com a liberação do NO como produto secundário da reação; esta reação usa FAD e BH4 como cofatores e O2 e NADPH
como co-substratos124 (Figura 4). A enzima NOS pode se apresentar em três isoformas, sendo duas constitutivas e dependentes de cálcio, denominadas nNOS (NOS1) e eNOS (NOS3), por serem encontradas principalmente nos neurônios e endotélio vascular, respectivamente, e uma isoforma induzível por citocinas inflamatórias e independente de cálcio denominada iNOS (NOS 2)125. Todas as isoformas da NOS podem ser inibidas por análogos da L-arginina N-substituídos, como L-NAME e L-NMMA, enquanto que a aminoguanidina é um inibidor seletivo para a isoforma iNOS126.
Figura 4. Reação enzimática catalisada pela NO sintase levando à formação de
óxido nítrico (NO)127.
Um dos marcadores detectáveis de estresse oxidativo é o malondialdeído, um aldeído de cadeia pequena e baixa massa molecular produzido durante a peroxidação lipídica128.O malondialdeído é formado quando o radical OH● ataca os ácidos graxos poli-insaturados de membrana celulares, alterando sua permeabilidade e estrutura129,130.
A reação de peroxidação lipídica é dividida em três etapas. Na etapa de iniciação, o OH● abstrai um hidrogênio alélico, formando o radical lipídico (L●). Na fase de propagação, o L● reage com oxigênio molecular, transformando-o em um radical peroxila (LOO●), que é reativo e abstrai outro hidrogênio, gerando outro L● e se transformando em hidroperóxido (LOOH). Ainda na fase de propagação, íons ferro podem catalisar reações, formando radicais peroxila, alcoxila e hidroxila a partir
dos hidroperóxidos. Finalmente, na fase de terminação, átomos de hidrogênio podem ser doados por antioxidantes formando compostos não radicais como aldeídos e cetonas (Figura 5), entre eles, o malondialdeído131.
Figura 5. Representação das fases das reações envolvidas na peroxidação
lipídica132. LH – lipídio não oxidado, L● – radical lipídico, LOO● – radical peroxila, LOOH – hidroperóxido.
Em situações onde a produção de peroxidação lipídica é baixa, a célula estimula sua manutenção e sinaliza mecanismos antioxidantes para a resposta contra o estresse oxidativo, mas em situações onde a produção é alta e, consequentemente, o dano celular é irreparável, a célula sofre necrose ou entra em apoptose133.
1.5 .APOPTOSE
A morte celular pode ocorrer por processos distintos que diferem nas características morfológicas e bioquímicas134,135. Uma delas, a apoptose, descrita primeiramente por Kerr et al.136, é um processo importante para o desenvolvimento normal do tecido e manutenção da homeostasia135. Durante a apoptose, inicialmente ocorrem alterações metabólicas e bioquímicas como, por exemplo, a perda da aderência com a matriz extracelular e células vizinhas, e externalização da fosfatidilserina na membrana celular (que sinaliza que a célula precisa ser fagocitada). Além disso, há condensação da cromatina e fragmentação do DNA, formação de corpos apoptóticos e redução do volume total celular, sendo que as organelas mantêm sua morfologia, exceto a mitocôndria134,137. O estágio tardio da apoptose é caracterizado pela formação de poros na membrana e perda da sua integridade138.
A apoptose pode ocorrer por duas vias: extrínseca e intrínseca (Figura 6). Estas vias envolvem as caspases, que são proteases com resíduo de cisteína no sítio catalítico e são capazes de clivar proteínas no resíduo de aspartato139. A via extrínseca é dependente de ligantes ao receptor Fas pertencente à família de proteínas transmembrana139. Quando o receptor é ativado, a proteína FADD migra até o receptor e recruta a pró-caspase-8, formando o complexo DISC (death-inducing signaling complex), sendo que este complexo formado pode ser inibido pela ligação da proteína FLIP (FLICE-Inhibitory Proteins) ao FADD, prevenindo a apoptose. O complexo DISC ativa a clivagem da pró-caspase-8 em caspase-8140. A caspase-8 clivada é a forma ativa da caspase e pode seguir dois caminhos141: clivar diretamente a pró-caspase-3 em caspase-3 que é uma caspase executora. A caspase-3 pode desencadear o processo apoptótico por duas maneiras: (1) clivando proteínas que são essenciais para o reparo do DNA, como a PARP (poli(ADP-ribose) polimerase-1), as quais, uma vez clivadas, perdem sua atividade, e o DNA não pode ser reparado, e (2) clivando ICAD, liberando a enzima CAD (Caspase-activated DNase), que tem o papel de fragmentar o DNA, ocorrendo, então, a apoptose138; ou a caspase-8 pode clivar a proteína Bid em Bid truncado (t-Bid), que migra para a membrana da mitocôndria, alterando seu potencial e induzindo a liberação de citocromo c. O citocromo c então se liga à pró-caspase-9 e à APA-1 (apoptosis protease activating factor 1), formando o complexo chamado apoptossomo. Este complexo cliva a caspase-9 em caspase-9, que, por sua vez, cliva a pró-caspase-3 em pró-caspase-3, desencadeando a apoptose135.
Figura 6. Esquema das vias extrínseca e intrínseca envolvidas na apoptose142. AIF – apoptosis-inducing factor; APA-1 – apoptosis protease activating factor 1; CAD – caspase-activated DNase; DISC – death-inducing signaling complex; FADD – Fas-associated protein with death domain; FLIP – FLICE-inhibitory protein; Smac – segundo ativador mitocondrial de caspase/DIABLO – proteína de Ligação-IAP Direta com baixo pI, PARP – poly(ADP)ribose polymerase e XIAP – X-inhibitor apoptosis factor. Proteínas da família Bcl-2: anti-apoptóticas – Bcl-2 e Bcl-XL; pró-apoptóticas – Bid, tBid (Bid truncado) e Bax.
A via intrínseca, também chamada de via mitocondrial, ocorre quando a célula sofre algum estresse, como por exemplo, estresse oxidativo143. Este estresse leva a uma alteração do potencial de membrana mitocondrial, que altera sua estrutura e permeabilidade, liberando citocromo c e proteínas pró-apoptóticas, além de diminuir a produção de ATP. O citocromo c se liga à pró-caspase-9 e à APA-1, o que leva à clivagem da caspase-3, iniciando a apoptose. As proteínas pró-apoptóticas liberadas da mitocôndria, como AIF (apoptosis-inducing factor) e endonucleases G vão diretamente para o núcleo celular para fragmentar o DNA, enquanto que as proteínas SMAC (segundo ativador mitocôndrial de caspase)/DIABLO (proteína de Ligação-IAP Direta com baixo pI) e Omi/HTRA2 inibem o fator de inibição de apoptose (XIAP), levando ao processo apoptótico139,140.
DISC DISC DISC
A via mitocondrial é regulada por uma família de proteínas chamada Bcl-2, a qual é constituída de proteínas pró- e anti-apoptóticas141. Bcl-2 e Bcl-XL são proteínas anti-apoptóticas que previnem a alteração na permeabilidade da membrana mitocondrial, já que essas proteínas exibem uma função contra estímulos e tratamentos pró-apoptóticos141. A homeostasia é mantida pelo equilíbrio da quantidade de proteínas pró- e anti-apoptóticas. Quando a célula sofre estresse, há um aumento de proteínas pró-apoptóticas e este desequilíbrio induz a apoptose139,142. Após estímulo de morte, a Bcl-2 sequestra a Bax ou compete pelos seus sítios na membrana externa da mitocôndria para impedir a alteração na permeabilidade da membrana mitocondrial. Por outro lado, a Bid induz Bax (ambas proteínas pró-apoptóticas) a se homodimerizar e migrar para a membrana mitocondrial, formando poros e liberando citocromo c e as proteínas pró-apoptóticas que dão início ao processo apoptótico137,140,144.
1.6. TOXINOLOGIA DE BOTHROPS JARARACA
A serpente B. jararaca é responsável pela maioria dos casos de envenenamento ofídico no Brasil145. A sua peçonha possui várias toxinas, como SVMPs, SVSPs, PLA2, LAAO, lectinas do tipo-C e peptídeos como BPP (peptídeo
potencializador de bradicinina) e CNP (peptídeo natriurético do tipo-C)146. Esta peçonha possui ações hemorrágicas, proteolíticas e inflamatórias, responsáveis por efeitos locais, como edema, dor, hemorragia, mionecrose e inflamação147.
A resposta inflamatória causada por esta peçonha é mediada, em parte, pelo aumento na produção de IFN-γ e TNF-α, com ativação dos leucócitos e indução do influxo dessas células para o dano local. Também ocorre a produção de NO e H2O2, que está envolvida na degradação do material fagocitado148. O edema
observado no envenenamento é associado à ação de SVMPs e PLA2s, sendo que
foi relatada redução do edema de pata induzido pela peçonha de B. jararaca em ratos após a inibição da atividade fosfolipásica148. Os efeitos edematogênico e inflamatório da PLA2 decorrem da liberação do ácido araquidônico a partir dos
fosfolipídios de membrana, sendo que o ácido araquidônico serve de substrato para a síntese de prostaglandinas147,148.
As SVMPs são os componentes majoritários da peçonha de B. jararaca e os mais estudados147. Possuem importante papel no dano tecidual por causarem
hemorragia e coagulopatias. As SVMPs são classificadas de acordo com seus domínios estruturais em classes P-I a P-IV, sendo que as SVMPs de classe P-III são as mais potentes149. Entre as SVMPs encontradas na peçonha de B. jararaca temos:
(1) a jararagina (P-III), que é hemorrágica, fibrinogenolítica, degrada a matriz
extracelular (ECM) e estimula a produção de IL-1β, IL-6 e TNF-α, (2) a HF3 (P-III), que possui a ação hemorrágica mais acentuada, (3) a bothropasina (P-IIIb), que é mais proteolítica do que hemorrágica, e (4) BJ-PI2 (P-I), que não é hemorrágica mas
possui atividade fibrinogenolítica e causa aumento da permeabilidade vascular em ratos149-151.
As SVSPs constituem o segundo maior grupo de componentes na peçonha de B. jararaca. Estas enzimas afetam a agregação plaquetária e a coagulação através da sua atividade fibrin(ogen)olítica, desregulando a homeostasia152. A 5´-nucleotidase da peçonha também inibe a agregação plaquetária, contribuindo para o desequilíbrio da homeostasia153. Já os componentes da fração de baixa massa molecular, como os BPPs e o CNP, contribuem para a hipotensão observada no envenenamento154,155.
Estudos proteômicos têm demonstrado algumas diferenças na composição da peçonha entre serpentes machos e fêmeas de B. jararaca155. A maioria dos acidentes é causada por serpentes jovens e fêmeas, sendo que, nas fêmeas, a peçonha possui maior quantidade de SVMPs, apresentando, então, maior ação hemorrágica, coagulante e fibrinogenolítica155,156. Além disso, serpentes recém-nascidas possuem maior quantidade de SVMPs, principalmente da classe P-III, na peçonha, resultando em maior ação coagulante em comparação com a peçonha de serpentes adultas. Nessas, há um aumento na proporção de SVSPs e PLA2s,além
de uma maior quantidade de SVMPs da classe P-I156. A variação na composição da peçonha de acordo com as idades das serpentes reflete na menor neutralização pelo antiveneno dos efeitos causados pela peçonha de serpentes recém-nascidas145.
A peçonha de B. jararaca é citotóxica em células epiteliais renais MDCK146 e também reduz o tamanho do tumor ascítico de Ehrlich (EAT – Ehrlich ascitic tumor) in vivo. Este efeito da diminuição do tumor é acompanhado pelo aumento da produção de EROs, TNF-α e presença maior de células inflamatórias. Essa diminuição na viabilidade celular e o aumento na produção de EROs pela
peçonha de B. jararaca estão associados à ação da LAAO, que é conhecida por causar citotoxicidade e apoptose pela geração de H2O2 através da sua atividade
enzimática157.
Vieira Santos et al.73 mostraram que a LAAO de B. jararaca diminiu o tamanho do EAT após aumentar o influxo de leucócitos mononucleares para a cavidade peritoneal. Porém, isso ocorreu sem ativação dos macrófagos peritoneais, sugerindo o papel dos linfócitos em mediar a citotoxicidade juntamente com ação apoptótica da LAAO. Já Ciscotto et al.74 mostraram que a LAAO desta peçonha exerce atividade antiparasitária contra Leishmania e também atividade antimicrobiana. A adição de catalase inibiu essas atividades, mostrando a importância do H2O2 gerado pela LAAO nestas ações. Frações da peçonha de B.
jararaca contendo atividade LAAO também induzem apoptose em epimastigotas de Trypanosoma cruzii, observado pela fragmentação de DNA; a catalase abole essa indução de apoptose, apontando novamente para o papel do H2O2 gerado pela
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Tendo em vista a importância dos macrófagos no reconhecimento, resposta e resolução na inflamação, e o fato de que, até o momento, não há uma investigação detalhada do efeito da LAAO sobre este tipo celular, propomos, neste projeto, investigar a ação da LAAO sobre macrófagos de rato, avaliando sua citotoxicidade e atividade apoptótica, bem como a capacidade desta enzima de estimular a formação de radicais livres. Nesta investigação, usamos a LAAO da peçonha de B. jararaca e macrófagos alveolares de rato como ferramenta biológica.
2.2. Específicos
Avaliar a citotoxicidade da LAAO em macrófagos alveolares de ratos.
Avaliar a capacidade da LAAO em estimular a produção de H2O2, ânion
superóxido e NO em macrófagos e o envolvimento destes mediadores nas alterações celulares causadas pela enzima.
Avaliar a atividade apoptótica da LAAO e o envolvimento tanto da via intrínseca quanto da via extrínseca no processo apoptótico.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. REAGENTES E PEÇONHA
Os reagentes para cromatografia e eletroforese foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, EUA) e GE LifeSciences (Piscataway, NJ, EUA). Garrafas e placas de cultura estéreis foram obtidas da Nunc (Copenhague, Dinamarca), Corning (Corning, NY, EUA) e similares. O meio de cultura celular (RPMI) foi obtido da Cultilab (Campinas, SP, Brasil). O isofluorano foi obtido da Cristália (Itapira, SP, Brasil). O neutral red (vermelho neutro), O-dianisidina, L-leucina, peroxidase, substratos para caspases 3, 8 e 9, superóxido dismutase (SOD), catalase, Nɷ -L-nitroarginina metil éster (L-NAME) e L-aminoguanidina foram obtidos da GE Lifesciences, Calbiochem ou Sigma. O kit comercial para a quantificação de lactato desidrogenase (LDH) foi adquirido da Bioclin (Belo Horizonte, MG, Brasil) e o kit para quantificação de NO da Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, EUA). Os outros reagentes foram obtidos da Sigma, Millipore ou Merck (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). A peçonha liofilizada de B. jararaca de espécimes adultos de ambos os sexos foi obtida do Centro de Extração de Toxinas Animais (CETA, Morungaba, SP) e da Fundação Ezequiel Dias (FUNED, Belo Horizonte, MG).
3.2. ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos (~300 g), provenientes do Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP. Os ratos foram mantidos a 22 oC com acesso livre a ração e água e em ciclos de luz (claro/escuro) de 12 h. Os experimentos com animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UNICAMP, protocolo no. 2694-1) e realizados em conformidade com os princípios éticos gerais para uso de animais da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), em consonância com a Lei Federal no. 11.794 de 08 de outubro de 2008.
3.3. PURIFICAÇÃO DA LAAO DA PEÇONHA DE BOTHROPS JARARACA
A LAAO foi purificada usando uma combinação de cromatografias de gel filtração e troca iônica, seguindo protocolos já descritos na literatura74.
3.3.1. Cromatografia de gel filtração (Superdex 75)
A peçonha de B. jararaca (100 mg) foi dissolvida em 1 ml de Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5) contendo 0,01 M de CaCl2 e mantida por 20 minutos em temperatura
ambiente. A amostra foi centrifugada a 13.000 rpm por 12 minutos em uma ultracentrífuga MiniSpinplus (Eppendorf). O sobrenadante resultante foi aplicado a uma coluna Superdex 75 (1,2 x 100 cm) acoplada a um sistema cromatográfico AKTÄ Prime (GE Healthcare) e equilibrada com o mesmo tampão a um fluxo de 0,5 ml/min com coletas de 1,5 ml/tubo. O perfil de eluição foi monitorado a 280 nm, e as frações foram dosadas para atividades LAAO, proteolítica e amidolítica.
3.3.2. Cromatografia de troca iônica (HiTrap Q-Sepharose)
As frações de gel filtração com atividade LAAO foram agrupadas e concentradas por ultrafiltração utilizando membrana Amicon 3 kDa (Millipore). A amostra foi clarificada a 10.000 rpm por 5 minutos em uma ultracentrífuga MiniSpinplus (Eppendorf) e o sobrenadante foi aplicado em uma coluna Q-Sepharose HiTrap de 5 ml (GE Healthcare) acoplada a um sistema cromatográfico AKTÄ Prime e equilibrada previamente com tampão HEPES 0,02 M (pH 8,0) (tampão A). A eluição das proteínas ligadas à coluna foi realizada com tampão HEPES 0,02 M (pH 8,0) contendo 1 M de NaCl (tampão B – TB) em gradiente escalonado: 0% TB em 3,5 volumes de coluna (VC), 25% TB em 6 VC, 50% TB em 6 VC e 100% TB em 4 VC. O fluxo da corrida cromatográfica foi de 1 ml/min com coletas de 1 ml/tubo e o perfil cromatográfico foi monitorado em comprimento de onda de 280 nm. As frações com atividade de LAAO foram reunidas e concentradas usando membrana Amicon 50 kDa (Millipore) a 3.665 x g por 20 minutos. Foi determinada a concentração de proteína e as amostras foram armazenadas a 8oC.
3.3.3. Pureza da proteína isolada
3.3.3.1. Eletroforese em géis de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
Todas as etapas de purificação foram monitoradas por SDS-PAGE159 por um sistema descontínuo com gel de empacotamento de 4% preparado com Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) contendo 0,4% de SDS e gel de migração de 10% com Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) contendo 0,4% de SDS em um sistema eletroforético Mighty Small SE260
(Hoefer-Pharmacia). Amostras de peçonha e fração foram dissolvidas em tampão de amostra [azul de bromofenol 4% (p/v), Tris-HCl 0,06 M, SDS 2%, glicerol 10%] e fervidas por 5 minutos com 0,1% de ditiotreitol (DTT) ou -mercaptoetanol para redução de proteínas. Os géis (10 x 12,5 cm) foram montados em cuba vertical mini SE260 (GE Lifesciences), acoplada à fonte elétrica EPS 600 (GE Lifesciences), imersos em tampão Tris-HCl 0,625 M (pH 6,8), glicina 1,2 M contendo SDS 10%, e, então, foram submetidos a um campo elétrico constante de 150 V. Após a corrida, os géis foram corados com nitrato de prata. Marcadores de massa molecular foram corridos em paralelo com as amostras.
3.3.3.2. Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa
Para o monitoramento do grau de pureza da fração com atividade de LAAO purificada pelos passos cromatográficos anteriores, 100 µg da fração foram aplicados em uma coluna de fase reversa C18 Discovery® BioWide pore (25 cm x 4,6 mm x 10 µm, Sigma). O sistema cromatográfico foi previamente equilibrado com ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% (pH 3,5) (tampão A). A eluição da amostra foi realizada através de um gradiente linear (0-100%) de tampão B (acetonitrila em 0,1% TFA), e monitorada num comprimento de onda de 280 nm.
3.4. Quantificação de proteínas
A concentração das proteínas foi determinada pelo método de Bradford160 utilizando BSA (albumina de soro bovina) como padrão.
3.5. Atividades enzimáticas 3.5.1. Atividade LAAO
A atividade enzimática da LAAO foi determinada de acordo com Nicholson e Kim161 adaptado para placas de ELISA. Utilizou-se o substrato L-leucina 0,006% em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7,8) contendo 0,25 µM de horseradish peroxidase e 0,4 µM de o-dianisidina. Amostras de peçonha e fração foram dissolvidas em tampão de amostra (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,8). A absorbância foi lida em um comprimento de onda de 436 nm em modo cinético por 30 minutos usando um leitor de microplacas SpectraMax340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). A atividade enzimática foi expressa em aumento de absorbância/min e convertida em
unidades/µl. Uma unidade enzimática foi definida como a oxidação de 1 µM de L-leucina por minuto.
3.5.2. Atividade proteolítica
A atividade proteolítica foi determinada colorimetricamente por degradação de azocaseína, modificado a partir do método descrito por Wang e Huang162. Amostras de peçonha e fração foram incubadas com solução de azocaseína (5 mg/ml) em tampão Tris-HCl 50 mM (pH 8,0). Após incubação por 90 minutos a 37 ºC, foram adicionados 200 µl de ácido tricloroacético 5% para precipitar a azocaseína que não havia sido digerida. Após 5 minutos a temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 8.000 x g por 5 minutos e 150 µl do sobrenadante foram adicionados a um volume igual de NaOH 0,5 M. Então, a atividade proteolítica foi monitorada pela determinação dos azopeptídeos produzidos pela atividade catalítica sobre a azocaseína em uma absorbância de 440 nm usando um leitor de microplacas SpectraMax340.
3.5.3. Atividade amidolítica
A atividade amidolítica foi determinada colorimetricamente pela degradação do substrato sintético N-benzoil-L-arginina p-nitroanilida (BApNA), conforme descrito por Torres-Huaco et al.163. Foi preparada uma solução estoque do substrato BApNA 0,1 M em DMSO, e logo em seguida preparada a solução de trabalho, diluindo a solução estoque em tampão Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) contendo 10 mM de CaCl2 e 100 mM de NaCl (solução de trabalho 1:100). Em microplacas de
ELISA, foram misturados 200 µl da solução de substrato, 50 µl de tampão de trabalho e 15 µl de água destilada e pré-incubados a 37 ºC por 10 minutos. Logo, foram adicionados 5 µl de amostra ou tampão de trabalho em um volume final de 270 µl. A mistura de reação foi incubada a 37 ºC por 30 minutos e as absorbâncias lidas em um comprimento de onda de 410 nm em leitor de microplacas SpectraMax340.
3.6. ISOLAMENTO E CULTURA DE MACRÓFAGOS
Os macrófagos foram obtidos de ratos machos Wistar por lavagem broncoalveolar164 (Figura 7). Para isto, os ratos foram anestesiados com isoflurano e
a traqueia exposta e canulada com tubo de polietileno (1 mm de diâmetro) conectada a uma seringa. Os pulmões foram lavados com salina tamponada com fosfato (PBS - phosphate-buffered saline) contendo 0,1% de heparina. O PBS foi inoculado através da cânula na traqueia em três alíquotas de 5 ml cada. Centrifugou-se o lavado (10 minutos, 400 x g, 4 ºC) e o pellet de células foi ressuspenso em 2 ml de meio RPMI 1640 + 10% SFB (soro fetal bovino). As células foram ajustadas para uma concentração 2 x 105 macrófagos/poço e aderidas overnight em placas de cultura de 96 poços a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. Após este
período, as células não aderentes foram removidas pela lavagem das placas com PBS. A população de células aderentes, constituída de 95% de macrófagos, foi usada nos experimentos descritos abaixo.Todos os procedimentos de cultura foram realizados em cabine de fluxo laminar.
Figura 7. Imagem de microscopia óptica obtida do lavado broncoalveolar feito em
ratos machos Wistar. Realizou-se a coloração de panótico rápido para a comprovação da presença de macrófagos.
3.7. CITOTOXICIDADE
3.7.1. Viabilidade celular (captação de vermelho neutro)
A citotoxicidade foi avaliada incubando-se macrófagos alveolares em placas de cultura celular de 96 poços com concentrações variadas de peçonha de B. jararaca (10-1000 µg/ml) e LAAO (2,5-250 U/ml) por 2 h. Em alguns protocolos, as células foram incubadas com uma concentração fixa de enzima (75 U/ml) por diferentes períodos de tempo (2, 6 e 24 h). Para avaliar o envolvimento de espécies
