SUMÁRIO RESUMO
CAPÍTULO 2 OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA
PPGQUIM – UFBA Isolamento e síntese de derivados de ácidos triterpênicos e esteroides e avaliação da ação de inibição de proteases.
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OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA
Os esteroides 1 e 2 foram obtidos comercialmente, e os triterpenos 3, 4 e 5 foram isolados, sendo 4 e 5 obtidos a partir de Eriope blanchetii. Em virtude da necessidade de confirmar a composição dos mesmos, todos eles foram caracterizados por meio das técnicas: espectroscopia na região do infravermelho, ressonância magnética nuclear de 1H e 13C, espectrometria de
massas, cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência, além da determinação do ponto de fusão, ou seja, caracterizar 1, 2, 3, 4 e 5 foi um dos objetivos deste trabalho.
Outro objetivo definido para este trabalho foi o de, a partir de 1, 2, 3, 4 e 5, sintetizar os derivados bromoacetilados: bromoacetato de sitosterila (6), bromoacetato de estigmasterila (7), bromoacetato de lupeoíla (8), bromoacetato de ursoloíla (9) e bromoacetato de oleanoíla (10), respectivamente, os quais também foram caracterizados pelos meios anteriormente citados.
Aspecto extremamente importante é destacar o que distingue estruturalmente os derivados bromoacetilados citados de suas moléculas de origem - o grupo descrito na Figura 12.
R O O Br 1' 2'
Figura 12. Estrutura do grupo bromoacetila.
Este grupo confere a estes derivados a capacidade de, mediados por moléculas de água, formarem, via oxigênio do grupo carbonila, ligações de hidrogênio com os aminoácidos de isoleucina, glicina e ácido aspártico do sítio ativo da protease. Além disso, a possibilidade de rotação em torno das ligações C1’- C2’, C2’-Br e C1’-O (ver Figura 12) atribui ao substrato possibilidades
adicionai de alteração conformacional que podem ter efeito positivo no encaixe enzima-substrato. Vale destacar a possibilidade de interações do tipo dipolo
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instantâneo-dipolo induzido ou dipolo-dipolo induzido propiciadas pelo átomo de bromo justificando, portanto, a síntese dos referidos compostos. Objetivou- se também obter, a partir dos derivados bromoacetilados citados, derivados análogos ao princípio ativo do Bevirimat® os quais também apresentam pontos adicionais em relação ao precursor de: i) formar ligações de hidrogênio com determinados grupos funcionais dos aminoácidos existentes no sítio ativo da protease e; ii) alterações conformacionais devido a inserção da cadeia lateral representada na Figura 13. R O O HO O
Figura 13. Estrutura do grupo 4-oxo-3,3 dimetil acetatila.
Os compostos 6, 7, 8, 9 e 10 deram origem a 2-pirrolidin-1-il acetato de sitosterila (11), 2-pirrolidin-1-il acetato de estigmasterila (12), 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla (13), 2-pirrolidin-1-il acetato de ursoloíla (14), 2-pirrolidin-1-il acetato de oleanoíla (15), respectivamente, os quais também foram caracterizados pelos meios anteriormente citados.
Bastante relevante, é destacar o aspecto estrutural que distingue 11, 12, 13, 14 e 15 derivados de 1, 2, 3, 4 e 5: o grupo descrito na Figura 14.
R O O N 1' 2'
Figura 14. Estrutura do grupo acetopirrolidil
Este grupo confere a estes derivados a capacidade de formar ligações de hidrogênio por mais dois pontos da molécula, no caso, o átomo de oxigênio do grupo carbonila e o átomo de nitrogênio do anel pirrolidínico. Além disso, a possibilidade de rotação em torno das ligações C1’- C2’, C2’-N e C1’-O (ver
Figura 14) e pequenas alterações na conformação do anel pirrolidínico, conferem ao substrato possibilidades adicionais de alteração conformacional
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que podem favorecer que a substância ancore e pareie no sítio ativo da protease. Estes aspectos permitem destacar o quanto esses compostos podem ser biologicamente promissores e eficientes na interação com a protease do HIV-1.
O fato de todos os precursores e derivados descritos apresentarem em sua composição os esqueletos esteroidal ou triterpênico confere aos mesmos características hidrófobas que podem propiciar interação eficiente deles: i) com a membrana lipofílica mediadora do acesso deles ao interior da célula e; ii) com estruturas hidrofóbicas das abas em torno do sítio ativo. No intuito de investigar o potencial bioativo anti HIV-1, os compostos citados foram testados frente à protease do parasito Haemonchus concortus.
Além disso, vale resgatar a discussão sobre biossíntese de triterpenos e esteroides (apresentada anteriormente). Esta discussão evidencia que os esteroides 1 e 2 e os triterpenos 4 e 5 apresentam a mesma rota biossintética. Isto está coerente com os seguintes fatos: i) esteroides como 1 e 2 são, comumente, obtidos em mistura (mesmo o β-sitosterol comercial que é obtido de fontes como soja, arroz, gérmen de trigo e milho é, na verdade, uma mistura de 1 e 2) bem como, ii) triterpenos como 4 e 5 que, comumente, também são obtidos em mistura. Uma avaliação comparativa das estruturas de 1 e 2 (ver Figura 3) permite constatar que estes compostos possuem estruturas muito semelhantes. Isto também é verificado ao avaliar as estruturas de 4 e 5 (ver Figura 5). Esta semelhança estrutural se traduz em interações semelhantes de 1 e 2 e de 4 e 5 com as fases: móvel e estacionária, em processos do tipo CC e CCD, fato que reflete em dificuldade para separá-los caso os mesmos estejam em mistura.
Essa interpretação concorda com citações de CARVALHO, 1998; BRUM, 1998; CHAVES, 2004; CONEGERO, 2003; CARVALHO, 2001; PAULA, 1996 que contemplam a dificuldade de separar mistura dos esteroides 1 e 2. Também, está em acordo com relatos de OLEA, 1990; BHATTACHARYYA, 1986 e GALOTTA, 2005 que constatam o mesmo para mistura dos triterpenos 4 e 5. Vale ressaltar que os autores citados relatam que embora seja difícil de separar a mistura de alguns triterpenos e esteroides, é possível caracterizar
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sistemas constituídos por 1 e 2 e por 4 e 5, em mistura, via dados de RMN de
13C dos átomos de carbono do grupo olefínico.
Dois sistemas envolvidos neste trabalho foram, portanto, i) uma mistura de β-sitosterol (1) e estigmasterol (2) e; ii) uma mistura dos ácidos ursólico (4) e oleanólico (5). A Tabela 3 apresenta a estrutura das espécies formadoras de cada sistema envolvido neste trabalho e o modo de obtenção das mesmas (se por isolamento ou síntese).
Tabela 3. Sistemas envolvidos neste trabalho, estruturas e modo de obtenção das respectivas espécies formadoras.
Sistema Modo de Obtenção
Mistura de β-sitosterol e estigmasterol Isolamento
HO HO
Produto comercial
Mistura de bromoacetato de sitosterila e bromoacetato de estigmasterila
(sistema derivado da mistura de β-sitosterol e estigmasterol)
Síntese O O Br O O Br Utilizando brometo de bromoacetila, carbonato de potássio e diclorometano (previamente seco) em reação feita a t.a.
Mistura de 2-pirrolidin-1-il acetato de sitosterila e 2-pirrolidin-1-il acetato de estigmasgterila (sistema derivado da mistura de bromoacetato de sitosterila e bromoacetato de estigmasterila) Síntese O O N O O N Utilizando pirrolidina e benzeno (previamente seco) em reação feita a t.a.
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Lupeol Isolamento
HO
Extrato de Cenostigma gardnerianum
Bromoacetato de lupeoíla (sistema derivado do lupeol) Síntese
O O Br Utilizando brometo de bromoacetila, carbonato de potássio e diclorometano (previamente seco) em reação feita a t.a. 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla
(sistema derivado do bromoacetato de lupeoíla)
Síntese O O N Utilizando pirrolidina e benzeno (previamente seco) em reação feita a t.a.
Mistura de ácido ursólico e ácido oleanólico Isolamento
HO
CO2H
HO
CO2H
Extrato das folhas de
Eriope blanchetii
(Lamiaceae), partição e CC.
Mistura de bromoacetato de ursoloíla e bromoacetato de oleanoíla
(sistema derivado da mistura de ácido ursólico e ácido oleanólico)
Síntese O CO2H O Br O CO2H O Br Utilizando brometo de bromoacetila, carbonato de potássio e diclorometano (previamente seco) em reação feita a t.a.
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Mistura de 2-pirrolidin-1-il acetato de ursoloíla e 2-pirrolidin-1-il acetato de oleanoíla (sistema derivado da mistura de bromoacetato de sitosterila e
bromoacetato de estigmasterila) Síntese O CO2H O N O CO2H O N Utilizando pirrolidina e benzeno (previamente seco) em reação feita a t.a.
Ácido ursólico Isolamento
HO
CO2H
Extrato das folhas de
Eriope blanchetii
(Lamiaceae), partição e CC.
Bromoacetato de ursoloíla (sistema derivado do ácido ursólico) Síntese
O CO2H O Br Utilizando brometo de bromoacetila, carbonato de potássio e diclorometano (previamente seco) em reação feita a t.a.
CAPÍTULO 3 - MATERIAIS 2011
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MATERIAIS
Na Tabela 4 abaixo, segue os nomes e as respectivas procedências das substâncias utilizadas neste trabalho.
Tabela 4. Substâncias usadas neste trabalho.
Substâncias Procedência
Brometo de bromoacetil Alcrich
Beta Sitosterol MP Biochemicals
Trietilamina Merck
Diclorometano Quemis
Tetraidrofurano Merck
Isobutiraldeído Aldrich
Benzeno Vetec
Carbonato de potássio Merck
Clorofórmio Quemis
Hidróxido de sódio Pró Analysi
Pirrolidina Acros
Acetato de etila Quemis
Hexano Quemis
CAPÍTULO 4 - MÉTODOS 2011
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MÉTODOS
A separação e caracterização dos compostos descritos neste trabalho foram efetuadas utilizando as seguintes técnicas: cromatografia, espectrometria de massa, espectroscopia na região do infravermelho e espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C.
No caso específico da cromatografia, os tipos envolvidos foram escolhidos a depender de alguns critérios: CCD (cromatografia em camada delgada) – quando houve necessidade de uma avaliação rápida de alterações na constituição de substâncias, por exemplo, em uma dada reação -, CC (cromatografia em coluna) – quando se precisou pré-tratar os extratos e/ou separar os componentes de uma mistura com relativa eficiência - e CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) – quando foi necessário separar e quantificar os componentes de uma mistura. As fases móveis utilizadas foram hexano, metanol, água, acetato de etila e clorofórmio, puros ou em mistura. As fases estacionárias foram sílica gel 60, sephadex e sílica flash. No caso específico da CLAE-DAD, as amostras foram dissolvidas em metanol, utilizou- se uma aparelho da marca Shimadzu e os experimentos feitos segundo método descrito por CHEN, 2008 foram conduzidos por Hector Hugo Medrado, aluno de iniciação científica do GPPN – UFBA, coordenado pelo professor Dr. Jorge Maurício David.
Em relação à espectrometria de massas (EM) os experimentos foram conduzidos por Dr. Sandro José de Andrade, orientando de pós-doutorado do professor Jailson Bitencourt de Andrade. Os espectros obtidos por meio do aparelho da marca Shimadzu, modelo GCMS-QP2010Plus, mostraram picos dependentes da relação m/z indicativos de padrão de fragmentação característicos dos compostos deste trabalho, fato que evidencia a relevância em se ter utilizado a referida técnica.
CAPÍTULO 4 - MÉTODOS 2011
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Para investigar a existência de determinados grupos funcionais nos compostos a técnica de espectroscopia na região do infravermelho (IV) foi a mais adequada. Os espectros foram registrados na faixa de 4000-400 cm-1
utilizando um aparelho da marca BOMEM-MB-102. As amostras, quando sólidas, foram preparadas em pastilhas de KBr e, quando líquidas, aplicadas diretamente numa janela de fluoreto de lítio. Os espectros foram registrados em função de um branco, uma pastilha de KBr. As análises foram feitas com colaboração da Prof. Dra. Zênis Novaes da Rocha IQ- UFBA.
O fato de os compostos deste trabalho serem formados predominantemente por átomos de carbono e hidrogênio permitiu o uso da técnica espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C
para mapeamento preciso de grupos de átomos e vizinhança contribuindo de modo decisivo na caracterização dos mesmos. As amostras analisadas foram dissolvidas em clorofórmio deuterado e, em alguns casos, piridina deuterada em aparelho da marca VARIAN modelo 500 por colaboração do Prof. Dr. Frederico Guaré IQ-UFBA, coordenador do LABAREMN.