Isolamento e síntese de derivados de ácidos triterpênicos e esteroides e avaliação da ação de inibição de proteases

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ISOLAMENTO E SÍNTESE DE DERIVADOS

DE ÁCIDOS TRITERPÊNICOS E ESTEROIDES

E AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE INIBIÇÃO DE

PROTEASES

Marcelo Álison Sousa dos Santos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ISOLAMENTO E SÍNTESE DE DERIVADOS

DE ÁCIDOS TRITERPÊNICOS E ESTEROIDES

E AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE INIBIÇÃO DE

PROTEASES

Salvador, Abril de 2011

Orientação: Prof. Dr. Maurício Moraes Victor IQ/UFBA Co-orientação: Prof. Dr. Jorge Maurício David IQ/UFBA

Dissertação apresentada por Marcelo Álison Sousa dos Santos ao Programa de Pós Graduação em Química da Universidade Federal da Bahia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química.

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Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver a vida, apesar de todos

os desafios, incompreensões e períodos de crise. Ser feliz não é uma

fatalidade do destino, mas uma conquista de quem sabe viajar para

dentro do seu próprio ser. Ser feliz é deixar de ser vítima dos

problemas e se tornar um autor da sua própria história. É

atravessar desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um oásis

no recôndito da sua alma. É agradecer a Deus a cada manhã pelo

milagre da vida.

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AGRADECIMENTOS 2011

PPGQUIM - UFBA | Isolamento e síntese de derivados de ácidos triterpênicos e esteroides e avaliação da ação de inibição de proteases.

AGRADECIMENTOS

Este espaço é extremamente especial. É reservado para agradecer às pessoas que de alguma forma se envolveram com este trabalho. Quando falo em envolvimento, não digo apenas o envolvimento profissional e técnico, embora saliente que aquelas que se envolveram apenas no quesito técnico não foram menos importantes para a execução deste trabalho, mas, me refiro também, ao envolvimento de pessoas que se preocuparam, que se importaram, que me perguntaram sobre o andamento do mestrado, que me incentivaram e torceram muito para que este trabalho fosse concretizado.

Começarei então, citando aquelas que contribuíram no quesito profissional e técnico viabilizando as condições necessárias para que, com qualidade e critério, as amostras fornecidas fossem, via uma dada técnica, analisadas.

 À Prof. Dra. Fernanda Washington de Mendonça do Instituto de Farmácia da UFBA e à Sílvia Caroline Oliveira, aluna de mestrado orientanda da referida professora, o meu muito obrigado por efetuarem todos os testes biológicos. A competência e critério que vocês dedicaram na execução destes testes foram cruciais no que se refere à aplicação biológica dos compostos sintetizados e isolados neste trabalho. A vocês, o meu muito obrigado.

 Ao Prof. Dr. Frederico Guaré, coordenador do LABAREMN – IQ/UFBA e à técnica Edineide Santana Sobral o meu muito obrigado por efetuarem as análises de ressonância magnética nuclear, técnica de extrema importância na caracterização dos compostos isolados e sintetizados neste trabalho. O empenho

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AGRADECIMENTOS 2011

de vocês foi fundamental para que o referido trabalho tivesse a qualidade a que se propunha.

 A Prof. Dra. Zênis Novaes da Rocha IQ/UFBA, por ter permitido acesso ao infravermelho, técnica usada na caracterização dos compostos envolvidos neste trabalho. Valeu Zeninha.

 Prof. Dr. Sílvio do Desterro Cunha IQ/UFBA por disponibilizar a linha de secagem de solventes.

 Prof. Dr. Jailson Bitencourt de Andrade IQ/UFBA, por ter permitido utilizar, via Sandro José de Andrade, aluno de pós-doutorado orientando do referido professor, o espectrômetro de massas, aparelho que permitiu caracterizar os compostos sintetizados e isolados.

 Ao CNPQ pela bolsa de mestrado e ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal da Bahia (PPGQUIM - UFBA) por gerir trâmites necessários não apenas para a titulação de mestre em química pela UFBA.

 Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. Celso Câmara da Universidade Federal Rural de Pernambuco (Convidado), Prof. Dra. Valéria Riatto IQ/UFBA (Convidada), Prof. Dr. Maurício Moraes Victor IQ/UFBA (Orientador), Prof. Dr. Jorge Maurício David IQ/UFBA (Co-Orientador), Prof. Dr. Silvio do Desterro Cunha IQ/UFBA (Suplente) um agradecimento especial por aceitarem compor esta banca examinadora.

Ao Sandro e à Prof. Zênis um obrigado também por, além do motivo citado, torcerem e se preocuparem com a finalização deste trabalho.

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AGRADECIMENTOS 2011

Agora, citarei nomes de pessoas que não fazem parte do âmbito acadêmico porém, sem a existência deles, eu não estaria aqui escrevendo este agradecimento.

 Meus amigos, Fábio, Átila, aos amigos do colégio Adventista, amigos da comunidade evangélica, pessoas que me acompanham e incentivam desde a época do ensino fundamental, pré-vestibular e que vieram prestigiar este momento.

 Meus primos, primas, tios e tias. Destaco minha prima do coração Elisângela e minha tia do coração Eliene. Tenho certeza de que todos vocês torcem diariamente pelo meu sucesso.

 Meu irmão, Fábio, e meus pais, Antonio Sousa e Maria da Glória Sousa, que me acompanham e cuidam de mim desde que nasci e, sobretudo, nesta fase final do trabalho, por tentarem sugerir alivio para as noites perdidas com conselhos para que eu fosse descansar ou por sugerirem que comesse algo quando me viam trocando o café da manhã pelo computador. Obrigado por tudo! Sem vocês este sonho não se tornaria realidade.

 Não poderia deixar de falar de meus avós, Saturnina, Hildete (in memorian), Venâncio (in memorian). Vocês foram, são e sempre serão um exemplo de vida para mim. Obrigado por deixarem um legado que me influenciou, influencia e me inspira diariamente a continuar nesta caminhada.

Existem também, aquelas pessoas que, além do envolvimento pessoal acompanharam mais de perto a execução deste trabalho.

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AGRADECIMENTOS 2011

 É claro que, neste momento, não poderia deixar de citar este nome, Prof. Dra. Adelaide Maria Vieira Viveiros IQ/UFBA. Além de ter feito a revisão técnica desta dissertação, Adelaide é minha amiga e conselheira. Foi minha professora de Química Geral, primeira disciplina de química que cursei na graduação e é, para mim, a tradução em pessoa de competência profissional, humildade, critério, rigor, amizade, honestidade e, acima de tudo, humanidade. Agradeço imensamente a Deus por ter colocado Adelaide em minha vida e agradeço a Adelaide por ter aceitado fazer parte dela.

 Prof. Dr. Fábio de Sousa Dias IQ/UFBA-Recôncavo que, em momento crucial, cedeu seu note book para que pudesse terminar a parte escrita da dissertação. Muito obrigado, Fábio.

 Colegas do laboratório do GPPN (Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais) coordenado pelo Prof. Dr. Jorge Maurício David IQ/UFBA. Cito, Bruno, Jefferson, Eliezer, Darlan, Larissa, André, Bel, Cândido, Patrícia, Igor, Rauldenis e Hugo. Vocês foram pessoas que dividiram ansiedades, sorrisos, compartilharam momentos que atenuaram as tensões inerentes à execução do referido trabalho. Hugo, valeu pelas análises de HPLC. Dentre os nomes citados neste item, destaco Rauldenis. Raul foi de extrema importância para execução deste trabalho. Além de ter desenvolvido comigo toda parte de isolamento do referido trabalho, cedeu parte dos precursores e, sempre se preocupou em interferir de modo a contribuir com este trabalho. Esta é uma qualidade que admiro muito em você, Raul. Valeu!!! Destaco também, Igor, que, além de ter feito a revisão técnica, em pouco tempo de amizade dividiu parte da carga de ansiedade relacionada a etapa final deste trabalho, valeu amigão. Agradeço também à Prof. Dra. Juceni David

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AGRADECIMENTOS 2011

FARMÁCIA/UFBA pela relação amistosa e cordial e pela torcida. A vocês Igor, Professora Juceni, Raul e a todos os nomes citados aqui, meu muito obrigado.  Alunos do laboratório do GPSQ (Grupo de Pesquisa em Síntese Química) coordenado pelo Prof. Dr. Maurício Moraes Victor IQ/UFBA e Prof. Dra. Valéria Riatto IQ/UFBA: Jacque, Nathan, Cintia, Éderson, Duane, Vinília, Uchôa, Emerson e, informalmente, Danilo. As ansiedades compartilhadas diminuíram a sobrecarga de ansiedade inerente a etapa final deste processo. Obrigado a vocês pela companhia e amizade. Destaco Nathan e Danilo que, além disso, fizeram a revisão técnica de parte desta dissertação. Valeu!!!

 Prof. Msc. Carlos Daniel IFBA-SSA e Prof. Msc. Denise Sá IFBA-SSA, meus amigos desde a graduação. Além de terem feito a revisão técnica desta dissertação, tenho certeza de que torceram muito para que tudo desse certo. Vocês são muito especiais pra mim!. Cito também, Alanjone, Olívia, Ailton, Clóves, Carla Vanessa. Sei que vocês vibram comigo esta vitória, obrigado.

 Prof. Dr. Kléber Queiroz Ferreira IQ/UFBA por ter feito a revisão técnica com ênfase na parte de ressonância magnética nuclear. Falar de algo que não se conhece muito bem nos deixa inseguro; foi assim que me senti quando precisei falar de ressonância magnética pela primeira vez no seminário geral e, embora um pouco menos, pela segunda vez, agora, na dissertação por esta técnica complexa ser carro chefe da mesma. Esta insegurança foi diminuída com horas dedicadas a compreender o princípio da referida técnica. Este fato aliado à revisão do professor Kléber, e dos professores Jorge David e Maurício Victor foi muito importante para que eu me sentisse mais seguro para falar sobre o tema.

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AGRADECIMENTOS 2011

 Prof. Dr. Maurício Moraes Victor IQ/UFBA e ao Prof. Dr. Jorge Maurício David IQ/UFBA, meus orientadores. Cito os nomes dos dois no mesmo tópico não para economizar em palavras, mesmo porque, isto seria impossível diante da participação dos mesmos neste trabalho mas, para destacar um fato marcante - o quanto eles foram complementares. Antes de falar da complementaridade dos mesmos, gostaria de destacar que é comum a dificuldade que alguns alunos enfrentam para conseguir orientação para desenvolver um projeto de mestrado. Eu tive a oportunidade de ter, via prof. Jorge David (a quem dedico um agradecimento especial), dois orientadores, ou melhor, dois orientadores complementares.

Um fator que, normalmente, vem como determinante na execução ou não execução de um trabalho desta natureza é relação aluno/orientador. Eu tive dois orientadores com os quais me relacionei de forma totalmente harmoniosa. Destaco também, o relacionamento entre os orientadores, que foi incrivelmente articulado e amistoso.

Quando cito na introdução que a química de produtos naturais, no que se refere ao isolamento, aliada a síntese orgânica, no que se refere à síntese de derivados, vem neste trabalho como uma parceria forte no intuito de projetar substâncias potencialmente bioativas no tratamento efetivo de HIV-1, me refiro neste trecho, como pano de fundo, à complementaridade citada. Professor Maurício, sintético, e professor Jorge, que trabalha com produtos naturais, foram os idealizadores deste trabalho. Isso permitiu que eu tivesse a oportunidade ímpar de ter contato com os dois seguimentos da química orgânica: síntese orgânica e produtos naturais. Estes fatos e o fato de Maurício Victor ser “hiperativo” e

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AGRADECIMENTOS 2011

Maurício David ser “calmo” refletiu na orientação complementar a qual me referi inicialmente. Já viram que não dá para economizar em palavras para falar destes dois Maurícios. A vocês o meu muitíssimo obrigado!!! Valeu!

 Agradeço imensamente a Deus por me ter dado o dom da vida e a capacidade de realizar este sonho e muitos outros.

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RESUMO 2011

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RESUMO

Triterpenos e esteroides são conhecidos por suas atividades biológicas. Derivados destes compostos podem potencializar atividades que foram descritas para seus precursores. A síntese de novos compostos de produtos naturais bioativos abre um amplo espectro de possibilidades estratégicas no que se refere a modular ou mesmo descobrir novas propriedades. Este trabalho descreve o isolamento de ácido ursólico e ácido oleanólico (em mistura) de Eriope Blanchetii, síntese de derivados de -sitosterol, estigmasterol, lupeol, ácido ursólico e ácido oleanólico. Os derivados sintetizados são denominados: bromoacetato de sitosterila, bromoacetato de estigmasterila, bromoacetato de lupeoíla, bromoacetato de ursoloíla, bromoacetato de oleanoíla, pirrolidin-1-il acetato de sitosterila, pirrolidin-1-il acetato de estigmasterila, pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla, 2-pirrolidin-1-il acetato de ursoloíla, 2-2-pirrolidin-1-il acetato de oleanoíla. Estes compostos foram caracterizados pela análise de dados registrados por espectrometria de massas, espectroscopia de infravermelho, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1_{H e}13_{C. Os derivados foram submetidos a}

teste de inibição de protease e os resultados obtidos mostram atividade para  -sitosterol e estigmasterol (em mistura), bromoacetato de sitosterila e bromoacetato de estigmasterila (em mistura), il acetato de sitosterila e pirrolidin-1-il acetato de estigmasterpirrolidin-1-ila (em mistura), lupeol, bromoacetato de lupeoíla, 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla, ácidos ursólico e oleanólico (em mistura).

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ABSTRACT 2011

ii

ABSTRACT

Triterpenes and steroids are known due their biological activities. Derivates these compounds can potencionalize activities that were described by their precursors. The synthesis of new compounds from bioactivity natural product opens a large spectrum of strategic possibilities in terms of modulating or even thought find new properties. This work describes the isolation of usolic acid and oleanolic acid (in mixture) from Eriope Blanchetii, synthesis of -sitosterol, stigmasterol, lupeol, ursolic acid and oleanolic acid derivates. It was synthetized named sitosterol bromoacetate, stigmasterol bromoacetate, lupeol bromoacetate, ursolic bromoacetate, oleanolic bromoacetate, sitosterol 2-pyrrolidin-1-il acetate, stigmasterol pyrrolidin-1-il acetate, lupeol pyrrolidin-1-il acetate, ursolic 2-pyrrolidin-1-il acetate and oleanolic 2-2-pyrrolidin-1-il acetate. These new compounds were characterized by data analysis registered by mass spectrometry, infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance of 1_{H and}13_{C. The derivates were}

submitted protease’s inhibition test and the results showed activity for -sitosterol and stigmasterol (in mixture), sitosterol bromoacetate and stigmasterol bromoacetate (in mixture), sitosterol pyrrolidin-1-il acetate and stigmasterol 1-il acetate (in mixture), lupeol, lupeol bromoacetate, lupeol 2-pyrrolidin-1-il acetate, ursólic acid and oleanólic acid (in mixture).

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ÍNDICE DE SÍMBOLOS 2011

PPGQUIM – UFBA Isolamento e síntese de derivados de ácidos triterpênicos e esteroides e avaliação da ação de inibição de proteases

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INDICE DE SÍMBOLOS

SÍMBOLO SIGNIFICADO

CC Cromatografia em Coluna

CCD Cromatografia em camada delgada

CCDC Cromatografia em camada delgada comparativa

DCM Diclorometano

EM Espectrometria de Massas

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

Hz Hertz

IV Infravermelho

J Constante de Acoplamento

mg Miligrama

PF Ponto de Fusão

Ppm Parte por milhão

Rf Fator de Retenção

RMN Ressonância Magnética Nuclear

 _{Deslocamento Químico}

C Graus Celsius

THF Tetrahidrofurano

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INDICE DE ESQUEMAS 2011

PPGQUIM-UFBA | Isolamento e síntese de derivados de ácidos triterpênicos e esteroides e avaliação da ação de inibição de proteases

INDICE DE ESQUEMAS Esquema 1. Síntese do mevalonato a partir da Acetil-CoA

Esquema 2. Síntese do 3-isopentenil pirofosfato a partir do mevalonato Esquema 3. Síntese do esqualeno a partir do dimetilalilpirofosfato Esquema 4. Síntese de esteroides e triterpenos a partir do esqualeno Esquema 6. Fragmentação característica para β-sitosterol.

Esquema 7. Fragmentação característica para estigmasterol Esquema 8. Formação da mistura de 6 e 7.

Esquema 9. Formação da mistura de 18 e 19.

Esquema 10. Formação da 2-metil n-propenil pirrolidina 20. Esquema 11. Formação de 11 e 12

Esquema 12. Formação do íon imínio 23 – etapa 1.

Esquema 13. Hidrólise do íon imínio 23 e formação da mistura de 18 e 19 etapa 2

Esquema 14. Fragmentação característica para lupeol. Esquema 15. Formação do bromoacetato de lupeoíla (8)

Esquema 16. Formação da 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla (13)

Esquema 17. Fluxograma representativo do procedimento de isolamento a partir do extrato de Eriope blanchetii (Lamiaceae)

Esquema 18. Rota de fragmentação para 4. Esquema 19. Formação da mistura de 9 e 10. Esquema 20. Formação da mistura de 14 e 15.

Esquema 21. Rota de fragmentação para ácido ursólico. Esquema 22. Formação de 9.

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INDICE DE FIGURAS 2011

PPGQUIM - UFBA | Isolamento e síntese de derivados de ácidos triterpênicos e esteroides e avaliação da ação de inibição de proteases

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura básica dos esteroides.

Figura 2. Esqueleto ciclopentanoperidrofenantrênico, numeração convencional e designação dos anéis do sistema cíclico dos esteroides.

Figura 3. Geometria cis-trans de esteroides do tipo 5β e estruturas de 1 e 2. Figura 4. Esqueletos lupano, ursano e oleano.

Figura 5. Estrutura do lupeol (3) e ácidos ursólico (4) e oleanólico (5) Figura 6. Estrutura do ácido betulínico e do princípio ativo do Bevirimat®. Figura 7. Estrutura do HIV-1 (JANEWAY, 1996).

Figura 8. Protease do HIV-1 (JUNIOR, 2001).

Figura 9. Ciclo de replicação de HIV-1 (SOUZA, 2003).

Figura 10. Interações do sítio ativo da protease do HIV-1 com o antiviral Saquinavir® (LEUNG, 2000).

Figura 11. Complexo HIV protease-AG-1343 (Viracept®). A) AG-1343 ancorado no sítio ativo da protease representada na forma de fitas e colorida diferentemente para cada monômero. B) mesma visão que A, porém mostrando a superfície molecular da proteína colorida conforme seu potencial eletrostático. Vermelho: negativo, azul: positivo, branco: neutro (JUNIOR, 2001).

Figura 12. Estrutura do grupo bromoacetila.

Figura 13. Estrutura do grupo 4-oxo-3,3 dimetil acetatila. Figura 14. Estrutura do grupo acetopirrolidil.

Figura 15. Espectro de Infravermelho da mistura de 1 e 2 (KBr, cm-1_).

Figura 16. Estruturas de β-sitosterol (1) e estigmasterol (2) com numerações convencionais para esteroides.

Figura 17. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 1 e 2. (500 MHz, CDCl}₃₎

Figura 18. Expansão do espectro de RMN de 1_{H da mistura de 1 e 2}

Figura 19. Espectro de RMN de 13_{C da mistura de 1 e 2 (125 MHz, CDCl}₃_).

Figura 20. Expansão do espectro de RMN de 13_{C da mistura de 1 e 2.}

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Figura 22. Expansão do espectro de massas de 1 e 2 (70 eV, IE). Figura 23. 1 e 2 interagindo com o íon carbonato

Figura 24. Estruturas de bromoacetato de sitosterila (6) e bromoacetato de estigmasterila (7) com numerações convencionais para esteróides.

Figura 25. Espectro de infravermelho da mistura de 1 e 2 e mistura de 6 e 7 (KBr, cm-1_).

Figura 26. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 6 e 7 (500 MHZ, CDCl}₃_).

Figura 27. Expansão do espectro de RMN de 1_{H da mistura de 1 e 2.}

Figura 31. Ácido bromoacético 17.

Figura 32. Expansão do espectro de RMN de 1_{H para 6 e 7.}

Figura 33. Espectro de RMN de 13_{C para a mistura de 6 e 7. (125 MHz, CDCl}₃₎

Figura 38. Espectro de massas de 6 e 7 (70 eV, IE).

Figura 39. Expansão do espectro de massas de 6 e 7 (70 eV, IE).

Figura 40. Estrutura de 3,3 dimetil butanoato de sitosterila (18) e 4-oxo-3,3-dimetil butanoato de estigmasterila (19).

Figura 41. Sistema utilizado na síntese da 2-metil n-propenil pirrolidina 17. Figura 42. Espectro de infravermelho de 20. [Filme (Li+_F-₎_n_{, cm}-1_]

Figura 43. Estruturas de 11 e 12.

Figura 44. Modelo aberto de aproximação

Figura 45. Estruturas de 2-pirrolidin-1-il acetato de sitosterila (11) e 2-pirrolidin 1-il acetato de estigmasterila (12) com as numerações convencionais para esteroides.

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Figura 50. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 11 e 12. (500 MHz, CDCl}₃₎

Figura 51. Espectro de RMN de 13_{C para a mistura de 11 e 12 (125 MHz,}

CDCl3).

Figura 54. Expansão do espectro de RMN de 13_{C da mistura de 6 e 7}

Figura 56. Fragmento de m/z = 84 Figura 57. Fragmento de m/z = 128

Figura 58. Espectro de massas de 11 e 12 (70 eV, IE).

Figura 59. Expansão do espectro de massas de 11 e 12 (70 eV, IE). Figura 60. Espectro de Infravermelho do lupeol (KBr, cm-1_).

Figura 61. Estrutura do lupeol (3) com numerações convencionais para triterpenos.

Figura 62. Expansão do espectro de RMN de 1_{H para lupeol com valores de}

integração.

Figura 63. Expansão do espectro de RMN de 1_{H para lupeol.}

Figura 64. Expansão do espectro de RMN de 1_{H para lupeol com valores de}

integração.

Figura 65. Espectro de RMN de 1_{H para lupeol (500MHz, CDCl}₃_).

Figura 66. Espectro de RMN de 13_{C para lupeol (125MHz, CDCl}₃_).

Figura 67. Expansão do espectro de RMN de 13_{C para lupeol.}

Figura 68. Espectro de massas para lupeol (70 eV, IE).

Figura 69. Expansão do espectro de massas para lupeol (70 eV, IE). Figura 70. Espectro de infravermelho de 3 e 8 (KBr, cm-1_).

Figura 71. Estrutura do bromoacetato de lupeoíla (8) com numerações convencionais para triterpenos.

(19)

Figura 72. Espectro de RMN de 1_{H para bromoacetato de lupeoíla (500 MHz,}

CDCl3)

Figura 73. Expansão do espectro de RMN de 1_{H de 3}

Figura 79. Expansão do espectro de RMN de 13_{C de 3.}

Figura 83. Espectro de RMN de 13_{C para bromoacetato de lupeoíla (125 MHz,}

CDCl3).

Figura 84. Fragmento m/z = 327

Figura 85. Fragmento m/z = 120 Figura 86. Fragmento m/z = 95

Figura 87. Espectro de massas de bromoacetato de oleanoíla (70 eV, IE).

Figura 88. Expansão do espectro de massas de bromoacetato de oleanoíla (70 eV, IE).

Figura 89. Estrutura da 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla (13) Figura 90. Espectro de Infravermelho de 8 e 13 (KBr, cm-1_).

Figura 91. Espectro de RMN de 1_{H de 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla (500}

MHz, CDCl3)

Figura 92. Expansão do espectro de RMN de 13_{H de 8.}

Figura 94. Expansão do espectro de RMN de 13_{C de 8}

Figura 97. Expansão do espectro de RMN de 13_{C de 13}

Figura 98. Espectro de RMN de 13_{C para 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla}

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Figura 99. Fragmento de m/z = 84 Figura 100. Fragmento de m/z = 112

Figura 101. Espectro de massas de 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla (70 eV, IE)

Figura 102. Expansão do espectro de massas de 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla (70 eV, IE)

Figura 103. Exsicata e foto da espécie Eríope blanchetti (Lamiaceae) Figura 104. Espectro de infravermelho da mistura de 4 e 5 (KBr, cm-1_).

Figura 105. Cromatograma da mistura de 4 e 5.

Figura 106. Estrutura da mistura de ácido ursólico (4) e ácido oleanólico (5) com numerações convencionais para triterpenos.

Figura 108. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 4 e 5 (500 MHz, pyD)}

Figura 109. Espectro de RMN de 13_{C da mistura de 4 e 5 (125 MHz, PyD)}

Figura 111. Espectro de massas da mistura 4 e 5 (70 eV, IE).

Figura 112. Espectro de infravermelho da mistura de 4 e 5 e de 9 e 10 M (KBr, cm-1_).

Figura 113. Estrutura do bromoacetato de ursoloíla (9) e bromoacetato de oleanoíla (10) com numerações convencionais para triterpenos

Figura 114. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 9 e 10 (500 MHz, CDCl}₃₎

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Figura 130. Espectro de massas da mistura de 9 e 10 (70 eV, IE).

Figura 131. Expansão do espectro de massas da mistura de 9 e 10 (70 eV, IE). Figura 132. Estruturas dos compostos 14 e 15 com numerações convencionais para triterpênos.

Figura 134. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 14 e 15 (500 MHz, CDCl}₃_).

Figura 135 Expansão do espectro de RMN de 13_{H da mistura de 9 e 10}

Figura 141. Espectro de RMN de 13_{C da mistura de 14 e 15 (125 MHz, CDCl}₃_).

Figura 142. Fragmento de m/z = 84

Figura 143. Espectro de massas da mistura de 14 e 15 (70 ev, IE).

Figura 144. Expansão do espectro de massas da mistura de 14 e 15 (70 ev, IE).

Figura 145. Espectro de infravermelho de 4 (KBr, cm-1_).

Figura 146. Estrutura do ácido ursólico (4) com numerações convencionais para triterpenos.

Figura 147. Espectro de RMN de 1_{H para ácido ursólico (500 MHz, piridina}

deuterada).

Figura 148. Espectro de RMN de 13_{C para o ácido ursólico (125 MHz, PyD).}

Figura 149. Espectro de massas do ácido ursólico (70 eV, IE). Figura 150. Fragmento m/z = 120

Figura 151. Fragmento m/z = 95 Figura 152. Fragmento m/z = 329.

(22)

Figura 153. Fragmento m/z = 531

Figura 154. Espectro de massas de 4 (70 ev, IE).

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ÍNDICE DE TABELAS 2011

INDICE DE TABELAS

Tabela 1. Diferenças estruturais para β-Sitosterol e Estigmasterol.

Tabela 2. Diferenças estruturais para lupeol, ácido ursólico e ácido oleanólico. Tabela 3. Sistemas envolvidos neste trabalho, estruturas e modo de obtenção das respectivas espécies formadoras.

Tabela 4. Substâncias usadas neste trabalho.

Tabela 5. Informações sobre reações de formação da mistura de bromoacetato de sitosterila e bromoacetato de estigmasterila em diferentes condições.

Tabela 6. Informações sobre reações de formação da mistura de 2-pirrolidin-1-il acetato de sitosterila e 2-pirrolidin-1-il acetato de estigmasterila por diferentes metodologias.

Tabela 7. Dados de infravermelho para a mistura de 1 e 2 (KBr, cm-1₎

Tabela 8. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] da mistura de}

β-sitosterol (1) e estigmasterol (2) comercial (A*) e β-sitosterol literatura1_{* (B).}

Tabela 9. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] da mistura de 1 e}

2 comercial (A*), β-sitosterol literatura*1 _{(B), Numeração do átomo (C), Grupos}

(D). *Sinais do componente majoritário. *1_{Literatura (RICCA, 1978)}

Tabela 10. Dados de infravermelho da mistura de 6 e 7 (KBr, cm-1_).

Tabela 11. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] da matéria prima}

- mistura de 1 e 2 (A*) e produto - mistura de 6 e 7 (B*).

Tabela 12. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] da matéria prima}

- mistura de 1 e 2 (A*) e do produto - mistura de 6 e 7 (B*). *Sinais do componente majoritário.

Tabela 13. Rendimentos das reações de esterificação para formação da mistura de 11 e 12.

Tabela 14. Dados de Infravermelho da mistura de 11 e 12 (KBr, cm-1_).

Tabela 15. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] da matéria prima,}

mistura de 6 e 7 (A*) e do produto, mistura de 11 e 12 (B*). *Sinais do componente majoritário

Tabela 16. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] da matéria prima}

- mistura de 6 e 7 (A*) e do produto – mistura de 11 e 12 (B*). *Sinais do componente majoritário.

(24)

Tabela 17. Dados de infravermelho para o lupeol (KBr, cm-1_).

Tabela 18. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] do lupeol (A) e}

lupeol literatura* (B).*REYNOLDS, 1986.

Tabela 19. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] do: lupeol (A),}

lupeol literatura*(B), Numeração do átomo (C), Grupo (D).

Tabela 20. Dados de infravermelho do bromoacetato de lupeoíla (KBr, cm-1_).

Tabela 21. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] do lupeol (A) e}

bromoacetato de lupeoíla (B).

Tabela 22. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] do: lupeol (A*),}

bromoacetato de lupeoíla (B), Numeração do átomo (C), Grupo (D).

Tabela 23. Dados de Infravermelho do 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla (KBr, cm-1₎

Tabela 24. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] do 2-pirrolidin-1-il}

acetato de lupeoíla (A) e bromoacetato de lupeoíla (B).

Tabela 25. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] do:}

bromoacetato de lupeoíla (A*) 8, 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla 13 (B), Numeração do átomo (C), Grupo (D).

Tabela 26. Massas das amostras obtidas de Eriope blanchetii

Tabela 27. Dados de infravermelho da mistura de 4 e 5 (KBr, cm-1).

Tabela 28. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, Piridina deuterada,}__(ppm)]

mistura de 4 e 5 (A) e dados da literatura de 4* (B).

Tabela 29. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, piridina deuterada, (ppm)] do:}

mistura de 4 e 5 (A*), 5 literatura*1 _{(B), Numeração do átomo (C), Grupo (D).}

*Sinais do componente majoritário. *1_{(COSTA, 2008).}

Tabela 31. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] mistura de 4 e 5}

(A) e mistura de 9 e 10 (B). *Sinais do componente majoritário.

Tabela 30. Dados de infravermelho da mistura de 9 e 10 (KBr, cm-1_).

Tabela 32. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz CDCl}₃_,__{(ppm)] do: mistura de 4}

e 5 (A*), mistura de 9 e 10(B), Numeração do átomo (C), Grupo (D). *Sinais do componente majoritário.

Tabela 33. Dados de infravermelho para a mistura de 14 e 15 (KBr, cm-1_).

Tabela 34. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] mistura de 9 e 10}

(25)

Tabela 35. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, CDCl}₃_,__{(ppm)] do: mistura de}

14 e 15 (A*), mistura de 9 e 10 (B), Numeração do átomo (C), Grupo (D). *Sinais do componente majoritário.

Tabela 36. Dados de infravermelho para o ácido ursólico (KBr, cm-1₎

Tabela 37. Dados de RMN de 1_{H [(500 MHz, Piridina deuterada,}__{(ppm)] de 4}

(A) e dados da literatura de 4* (B).

Tabela 38. Dados de RMN de 13_{C [(125 MHz, piridina deuterada,}__{(ppm)] de 4,}

e 4 literatura*1 _{(B), Numeração do átomo (C), Grupo (D). *Sinais do}

componente majoritário. *1_{COSTA, 2008}

(26)

SUMÁRIO 2011

PPGUIM - UFBA Isolamento e síntese de derivados de ácidos triterpênicos e esteroides e avaliação da ação de inibição de proteases.

SUMÁRIO

RESUMO...i ABSTRACT...ii SÍMBOLOS...iii 1. INTRODUÇÃO...1 2. OBJETIVOS...19 3. MATERIAIS...25 4. MÉTODOS...26 5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...28 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO...35 6.1 Sistema fitosteroidal: mistura de β-Sitosterol e Estigmasterol...35 6.1.1 Caracterização espectroscópica...35 6.1.1.1 Espectroscopia na região do infravermelho...35 6.1.1.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...36  RMN de 1_H...37

 RMN de 13_C...41

6.1.2 Caracterização espectrométrica...47 6.1.2.1 Espectrometria de massas ...47 6.2 Síntese da mistura de bromoacetato de sitosterila e bromoacetato de estigmasterila...50 6.2.1 Síntese...50 6.2.2 Caracterização espectroscópica...53 6.2.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho...54 6.2.2.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...55  RMN de 1_H...55

 RMN de 13_C...60

(27)

SUMÁRIO 2011

6.2.3.1 Espectrometria de massas...63 6.3 Síntese da mistura de 2-pirrolidin-1-il acetato de sitosterila e 2-pirrolidin-1-il acetato de estigmasterila...66 6.3.1 Síntese...66 6.3.2 Caracterização espectroscópica...72 6.3.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho...73 6.3.2.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...75  RMN de 1_H...75  RMN de 13_C...78 6.3.3 Caracterização espectrométrica...82 6.3.3.1 Espectrometria de massas...82 6.4 Sistema: lupeol...85 6.4.1 Caracterização espectroscópica...85 6.4.1.1 Espectroscopia na região do infravermelho...85 6.4.1.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...86  RMN de 1_H...87

 RMN de 13_C...91

6.4.2 Caracterização espectrométrica...96 6.4.2.1 Espectrometria de massas ...96 6.5 Síntese do bromoacetato de lupeoíla...99 6.5.1 Síntese...99 6.5.2 Caracterização espectroscópica...100 6.5.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho...100 6.5.2.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...101  RMN de 1_H...102

 RMN de 13_C...106

6.5.3 Caracterização espectrométrica...110 6.5.3.1 Espectrometria de massas...110

(28)

SUMÁRIO 2011

6.6 Síntese do 2-pirrolidin-1-il acetato de lupeoíla...113 6.6.1 Síntese...113 6.6.2 Caracterização espectroscópica...114 6.6.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho...115 6.6.2.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...116  RMN de 1_H...117

 RMN de 13_C...119

6.6.3 Caracterização espectrométrica...123 6.6.3.1 Espectrometria de massas...123 6.7 Sistema: mistura de ácido oleanólico e ácido ursólico...125 6.7.1 Isolamento...125 6.7.2 Caracterização espectroscópica...128 6.7.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho...128 6.7.2.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...131  RMN de 1_H...132

 RMN de 13_C...135

6.7.3 Caracterização espectrométrica...139 6.7.3.1 Espectrometria de massas...139 6.8 Síntese da mistura de bromoacetato de oleanoíla e bromoacetato de ursoloíla...141 6.8.1 Síntese...141 6.8.2 Caracterização espectroscópica...142 6.8.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho...142 6.8.2.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...143  RMN de 1_H...144

 RMN de 13_C...147

6.8.3 Caracterização espectrométrica...152 6.8.3.1 Espectrometria de massas...152

(29)

SUMÁRIO 2011

6.9 Síntese da mistura de 2-pirrolidin-1-il acetato de oleanoíla e 2-pirrolidin-1-il acetato de ursoloíla...154 6.9.1 Síntese...154 6.9.2 Caracterização espectroscópica...155 6.9.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho...155 6.9.2.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...157  RMN de 1_H...157

 RMN de 13_C...159

6.9.3 Caracterização espectrométrica...163 6.9.3.1 Espectrometria de massas...163 6.10 Sistema: ácido ursólico...166 6.10.1 Caracterização espectroscópica...166 6.10.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho...166 6.10.2.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...167  RMN de 1_H...168

 RMN de 13_C...169

6.10.3 Caracterização espectrométrica...172 6.10.3.1 Espectrometria de massas...172 6.11 Síntese bromoacetato de ursoloíla...174 6.11.1 Síntese...174 6.11.2 Caracterização espectrométrica...174 6.11.3.1 Espectrometria de massas...174 7. Testes biológicos de inibição de protease...178 7.1 Resultados e Discussão...178 8. Conclusões finais e perspectivas...183

(30)

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO 2011

PPGQUIM – UFBA Isolamento e síntese de derivados de ácidos triterpênicos e esteroides e avaliação da ação de inibição de proteases.

1

INTRODUÇÃO

O fato de já existirem relatos na literatura destacando diversas aplicações biológicas de triterpenos e esteroides, livres ou na forma de um derivado, faz com que estes compostos recebam especial atenção, e que a investigação dos mesmos seja extremamente atrativa do ponto de vista científico. Esse atrativo é também indispensável se considerarmos o seguinte contexto: i) alguns medicamentos existentes já não são mais tão eficientes no tratamento de determinadas doenças e ii) freqüentemente novas doenças acometem a sociedade, assim, projetar e sintetizar compostos bioativos é necessidade primordial para a manutenção da vida e conseqüente desenvolvimento da humanidade.

Reforçando o atrativo mencionado, vale destacar um dos fatores diretamente relacionados à atividade biológica de triterpenos e esteroides, a lipossolubilidade - requisito importante para a bioatividade (FRAGA, 2001). Para que uma substância seja lipossolúvel é necessário que a mesma possua, na composição, grupos hidrófobos que interajam de modo eficiente com a parte lipídica da membrana celular, ou seja, grupos que interajam de modo a propiciar que estes compostos permeiem ao interior da célula. Esta é, portanto, uma propriedade que define o acesso destas substâncias ao interior da célula alvo.

O fato de esteróis, definidos como álcoois de esteroides (QUILEZ, 2003 e GROS, 1985), serem formados por esqueleto esteroidal (Figura 1) confere a estes compostos características hidrofóbicas extremamente importantes para a lipossolubilidade e conseqüente bioatividade dos mesmos.

(31)

2

Atividade anti-inflamatória, proteção contra efeito letal de veneno de cobra, atividade contra tumores prostáticos, capacidade de emulsificar ou converter gorduras em compostos solúveis em água (MORS, 2000), atividade hipocolesterelomiante, antimicrobiana, antibacteriana, antifúngica, anticarcinogênica (SOTIROUDIS, 2008; WANG, 1999), atividade frente ao vírus da hepatite, atividade frente a alguns tipos de células cancerosas, diminuição de colesterol total do plasma sanguíneo e combate a arteriosclerose (EPINDOLA, 2006; MORI, 1993; CUI, 2008; DROZDOVA, 2007; OLIVEIRA, 2007) são propriedades relatadas na literatura para os esteroides -sitosterol (1) e estigmasterol (2) que destacam a bioatividade dos mesmos. Como esta bioatividade está relacionada à estrutura destes esteroides, é importante avaliar a Tabela 1, as Figuras 2 e 3 e identificar o que difere estruturalmente 1 de 2.

Tabela 1. Diferenças estruturais para β-Sitosterol e Estigmasterol.

Composição β-Sitosterol Estigmasterol

Esqueleto

ciclopentanoperidrofenantrênico

 

Grupo OH ligado a C3  

Ligação dupla entre C5 e C6  

Grupo etila ligado a C4  

Anel B trans ao C, C trans ao D, A cis ao B (átomo H5 voltado

para face β)

 

Ligação dupla entre C22 e C23 

Ao avaliar a Tabela 1 e as Figuras 2 e 3 pode-se identificar que apenas a ligação dupla entre os átomos C22 e C23 existente em 2 e inexistente em 1 é o

que difere estruturalmente 1 de 2. Além disto, -sitosterol (1) e estigmasterol (2) são formados pelo esqueleto ciclopentanoperidrofenantrênico (Figura 2) o qual é constituído por um sistema de anéis condensados e uma cadeia lateral ligada ao C17. Este sistema de anéis relativamente rígido pode, com certa

(32)

3

restrição, se dispor de forma côncava ou convexa. Esta restrição é atenuada pela cadeia lateral uma vez que esta cadeia confere possibilidades adicionais de conformações fato este que reflete nas atividades biológicas de 1 e 2. Todos os aspectos apresentados, ressaltando a existência do grupo OH, contribuem para definir bioatividade e reatividade características destes esteróis.

Este grupo possibilita que 1 e 2 formem ligações de hidrogênio com outros grupos de átomos, como por exemplo, grupos hidrófilos de proteínas ou espécies como moléculas de água de fluidos aquosos. Também, a depender da base de Brönsted-Lowry, há possibilidade de atuarem como ácidos numa dada reação.

Figura 2: Esqueleto ciclopentanoperidrofenantrênico, numeração convencional e designação dos anéis do sistema cíclico dos esteroides.

HO sitosterol (1) H H H A B C D Esteroides 5

Anéis A e B unidos em cis

HO

Estigmasterol (2)

Figura 3. Geometria cis-trans de esteroides do tipo 5β e estruturas de 1 e 2. Outra classe de compostos formados pelo esqueleto lupano, ursano e oleano (Figura 4), que possuem grupos hidrófobos extremamente importantes quanto ao aspecto lipossubilidade, são os triterpenos.

3 4 1 2 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 19 18 17 16 15 27 26 25 24 23 22 21 20 A B C D

(33)

4

Figura 4. Esqueletos lupano, ursano e oleano.

No caso específico deste trabalho, estes triterpenos são: lupeol (3), ácido oleanólico (4) e ácido ursólico (5). A Tabela 2 e as Figuras 4 e 5 permitem identificar o que os difere estruturalmente.

Tabela 2. Diferenças estruturais para lupeol, ácido ursólico e ácido oleanólico.

Composição Lupeol Ácido Ursólico Ácido Oleanólico

Esqueleto lupano 

Esqueleto ursano 

Esqueleto oleano 

Ligação dupla entre C12 e C13  

Grupo OH ligado a C3   

Grupo COOH ligado a C17  

Grupo CH3 ligado a C17 

Ligação dupla entre C20 e C29 

Ao avaliar a Tabela 2 pode-se verificar que existe uma diferença significativa ao comparar a estrutura do lupeol com as estruturas dos ácidos ursólico e oleanólico. No entanto, ao se comparar a estrutura do ácido ursólico com a do ácido oleanólico, é possível perceber que estas substâncias diferem apenas quanto ao tipo de esqueleto e que estes diferem apenas quanto a posição relativa de dois grupos metila. No caso do ácido ursólico, há dois grupos metila geminados ligados ao C20 e no caso do ácido oleanólico, estes

grupos estão vicinais - um ligado ao C19 e o outro ao C20, (ver Figura 5). Dentre

os aspectos estruturais citados, vale destacar existência de um grupo hidroxila

Lupano Ursano Oleano

20 29 17 3 12 ₁₂ 13 3 13 17 17 3

(34)

5 17 3 20 29 HO 3 17 3 HO CO₂H 12 13 4 17 3 HO CO2H 12 13 5

que, pelo mesmo motivo já citado para 1 e 2, conferirá reatividade característica e terá relação direta com a bioatividade de 3, 4 e 5. Para 4 e 5 destaca-se a existência de grupo carboxila que confere: i) mais um sítio reativo, uma vez que o referido grupo permite que 4 e 5 atuem como ácidos de Brönsted-Lowry e; ii) mais pontos na molécula passíveis de formação de ligações de hidrogênio, no caso específico, com grupos hidrófilos de aminoácidos e moléculas de água de fluidos aquosos.

Figura 5. Estrutura do lupeol (3) e ácidos ursólico (4) e oleanólico (5) O grandioso potencial bioativo dos triterpenos 3, 4 e 5 pode ser destacado devido a uma série de relatos na literatura sobre aplicações biológicas dos mesmos, tais como: atividade cardiotônica, sedativa, tônica, analgésica (VECHIA 2009), anti-hiperlipidêmica, atividade hepatoprotetora, envolvimento com inibição de substâncias tóxicas do sistema imunológico, atividade cicatrizante in vivo, antileishimânia in vitro (LETTS, 2006; SANTOS, 2004), ações: hepatoprotetora (SARAVANAN, 2006), antiinflamatória (IKEDA, 2008; SINGH, 1992), hipolipidêmica, antiaterosclerótica (MA, 1986;

SARAVANAN, 2006; SOMOVA., 2003), hipocolesterolemiante,

tripanossomicida (CUNHA., 2003; LEITE., 2006), imunomoduladora (RAPHAEL, 2003), antimicrobiana, (MALLAVADHANI, 2004), anti-HIV (KASHIWADA, 2000; LEE, 2008), antibacteriana (FONTANAY, 2008), antiúlcera gástrica, gastroprotetora (GOMES, 2009), hipoglicêmica (LIU, 1995), antiosteoporótica (LEE,2008), antidiabética (JANG, 2009), anticoncepcional (LIU, 1995), atividade in vitro contra melanoma, hepatoma, carcinomas de

(35)

6

cérvix, cérebro, leucemia, carcinomas de pulmão, ovário, cólon, pâncreas, rim, mama (ANDERSSON, 2003; LI, 2002; OVESNÁ, 2004) e atividade antiplasmódica in vitro (STEELE, 1999; ALVES, 1997).

O fato de a síntese de triterpenos e esteroides envolver diversas etapas dificultaria a obtenção desses compostos caso, em organismos vivos, não existissem processos biossintéticos que, a partir da Acetil-CoA, fornecem estes esteroides e triterpenos.

Biossíntese de triterpenos e esteroides

A rota biossintética descrita a seguir mostra a notável maneira utilizada por organismos vegetais e animais para sintetizar o esqueleto esteroidal e triterpênico, ou seja, mostra como estes esqueletos são construídos. Os quatro principais passos da referida rota são: i) biossíntese do mevalonato a partir do acetil-CoA, ii) biossíntese do isopreno ativo a partir do mevalonato, iii) biossíntese do esqualeno a partir do isopreno ativo, iv) biossíntese de esteroides e triterpenos a partir do esqualeno.

Biossíntese do mevalonato a partir do acetil-CoA

Esta rota se inicia com a espécie precursora formada por dois átomos de carbono, oriunda de processos de oxidação de ácidos graxos: a acetil-CoA.

A primeira etapa do processo consiste na síntese de acetoacetil-CoA, espécie formada por quatro átomos de carbono. Nesta etapa ocorre uma reação de condensação envolvendo duas moléculas de acetil-CoA em um processo catalisado pela tiolase. Numa segunda etapa, acetoacetil-CoA, em um processo catalisado pela HGM-CoA sintetase, reage por condensação e hidrólise com outra molécula de acetil-CoA fornecendo β-hidróxi-β-metilglutaril-CoA (HMG-β-hidróxi-β-metilglutaril-CoA), espécie formada por seis átomos de carbono. Numa terceira etapa, em um processo catalisado pela HGM-CoA redutase, HGM-CoA é reduzido por NADPH, ou seja, o grupo cetônico é reduzido ao correspondente álcool, o mevalonato - espécie formada por seis átomos de carbono. Estas etapas estão ilustradas no Esquema 1.

(36)

7

Esquema 1. Síntese do mevalonato a partir da Acetil-CoA Biossíntese do isopreno ativo a partir do mevalonato

As quarta, quinta e sexta etapas consistem em fosforilações sucessivas do mevalonato. Como mevalonato é fosforilado três vezes, estas são etapas nas quais três moléculas de ATP são convertidas em ADP. Ocorre formação do 5-pirofosfato mevalonato fosforilado espécie que, numa sétima etapa fornece, por descarboxilação e perda de um grupo fosfato, a espécie difosforilada 3-isopentenil pirofosfato que pode estar na forma do seu isômero, o dimetilalil pirofosfato (substrato alílico) ambos denominados isoprenos ativos. O referido isopreno ativo possui cinco átomos de carbono, ou seja, um átomo de carbono a menos em relação ao precursor, mevalonato. Estas etapas estão ilustradas no Esquema 2. O SCoA Acetil-CoA 2 HSCoA tiolase O SCoA O Acetoacetil-CoA HSCoA O SCoA H2O + _O SCoA OH -_OOC 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA HMG-CoA HMG-CoA sintetase HMG-CoA sintetase 2 NADPH + 2H+ 2NADP+ + HS-CoA OH OH -_OOC Mevalonato

(37)

8

Esquema 2. Síntese do 3-isopentenil pirofosfato a partir do mevalonato Biossíntese do escaleno a partir do isopreno ativo.

As próximas etapas descrevem considerável crescimento da cadeia carbônica. Na sétima etapa, duas moléculas dos isoprenos ativos, uma na forma de 3-isopentenil pirofosfato e outra na forma de dimetilalil pirofosfato, reagem por condensação do tipo cabeça-cauda. Este processo, que ocorre com perda de dois grupos fosfatos e um íon H+_{, conduz à formação de geranil}

pirofosfato, espécie formada por 10 átomos de carbono, e é catalisado pela prenil transferase. Na oitava etapa, geranil pirofosfato reage por condensação do tipo cabeça-cauda com 3-isopentenil pirofosfato (espécie formada por 5 átomos de carbono). Este reação, que ocorre com perda de dois grupos fosfatos, é catalisada por prenil transferase e fornece farnesil pirofosfato, espécie que possui 15 átomos de carbono na composição. Em uma nona etapa, duas moléculas de farnesil pirofosfato reagem via condensação do tipo cabeça-cabeça concomitante a duas fosforilações e uma redução promovida por NADPH fornecendo o esqualeno – espécie formada por 30 átomos de carbono. Estas etapas estão descritas no Esquema 3.

OH OH -_OOC Mevalonato O OH -_OOC P O O O 2 -ATP ADP O OH -_OOC P ATP ADP O P O O O _O O -2

-5-fosfo mevalonato 5-pirofosfato mevalonato

O OPO3 2--_OOC P O P O O O O O -2 -ATP ADP CO2 + Pi O P O P O O O _O O -2 -3-isopentenil pirofosfato

(38)

9

Esquema 3. Síntese do esqualeno a partir do dimetilalilpirofosfato

O P O P O O O O O -2 -Dimetilalil pirofosfato O P OP O O O _O O -2 -3-isopentenil pirofosfato PPi O PO P O O O O O -2 -Geranil pirofosfato O P OP O O O _O O -2 -3-isopentenil pirofosfato PPi O P OP O O O _O O -2 -Farnesil pirofosfato

Farnesil Pirofosfato + NADPH 2 PPi + NADP+_{+ H}+

PPi

(39)

10

Biossíntese dos esteroides e triterpenos a partir do esqualeno

Redução promovida por NADPH e oxidação promovida por O2 auxiliada

pela enzima esqualeno monoxigenase conduzem a formação de esqualeno 2,3 epóxido, precursor de triterpenos e esteroides.

A depender da orientação dos grupos e do posicionamento das duplas ligações em esqualeno 2,3 epóxido, um notável processo que envolve fluxo eletrônico concertado, pode conduzir à formação de uma estrutura cíclica que, a depender da conformação dos anéis, pode corresponder ao esqueleto de um esteroide ou um triterpeno.

Se estas conformações forem do tipo cadeira-barco-cadeira-barco, o composto formado é um esteroide. Se do tipo cadeira-cadeira-cadeira-barco, um triterpeno, sendo esta, segundo DEWICK, 2000, a rota biossintética mais conhecida para explicar a biossíntese destes compostos.

(40)

11

Esquema 4. Síntese de esteroides e triterpenos a partir do esqualeno Pré-Esqualeno 2 X Franesil PP Esqualeno Esqualeno 2,3-epóxido Conformação cadeira-cadeira-cadeira-barco TRITERPENOS Conformação cadeira-barco-cadeira-barco ESTEROIDES HO HO -Sitosterol Colesterol HO Estigmasterol HO CO2H Ácido Ursólico HO Lupeol

(41)

12

A rota biossintética descrita compõe o metabolismo de animais, vegetais e fungos, o que justifica um dos objetivos do presente trabalho: extrair 4 e 5 de Eriope blanchetii, fonte, segundo DAVID, 2001, abundante destes triterpenos.

Com base no que foi relatado anteriormente, os grupos substituintes do esqueleto esteroidal e triterpênico apresentam influência significativa na atividade biológica. Este fato, aliado a relatos da literatura sobre derivados esterificados de esteroides e triterpenos, que apresentaram atividades distintas dos precursores ou, então, que potencializaram as atividades biológicas originalmente apresentadas, torna a obtenção de derivados de 1, 2, 3, 4 e 5, extremamente atrativa (ESPINDOLA, 2006; MORI, 1993; CUI, 2008; DROZDOVA, 2007; OLIVEIRA, 2007).

Deste modo, a possibilidade de sintetizar compostos a partir dos produtos naturais 1, 2, 3, 4 e 5 que possuem atividade biológica descrita na literatura e, portanto, bioatividade confirmada, abre um amplo espectro de possibilidades estratégicas no que se refere a potencializar, modular ou até mesmo descobrir novas propriedades.

Substâncias bioativas na inibição da protease do HIV.

Dentre as doenças que acometem a sociedade encontra-se a AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida – sigla em inglês), causada pelo vírus HIV (vírus da imunodeficiência humana). Conhecido há 29 anos, o HIV já causou mais de 25 milhões de mortes no mundo. Só no Brasil estima-se a ocorrência de 11 mil óbitos por ano. A química de produtos naturais, no que se refere ao isolamento, no caso específico de 3, 4 e 5, aliada a síntese orgânica no que se refere à síntese de derivados de 1, 2, 3, 4 e 5, vem, neste trabalho, como uma parceria forte no intuito de projetar substâncias potencialmente bioativas no tratamento efetivo do HIV-1 por inibição da protease do referido vírus.

O fato de existir o Bevirimat®, fármaco cujo princípio ativo é um derivado do triterpeno ácido betulínico, usado no tratamento de HIV e câncer de pele (MOTO, 1998; RAJENDRAN, 2008) e de, segundo PATROčKA, 2003 e DEWICK, 2002, triterpenos de um modo geral, apresentarem na forma livre ou

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13 O COOH O HO O HO COOH Ácido betulínico

na forma de um derivado, atividade anti-HIV, confirmam a possibilidade de derivados de 1, 2, 3, 4 e 5 apresentarem atividade anti HIV.

Bevirimat®

Figura 6. Estrutura do ácido betulínico e do princípio ativo do Bevirimat®. Para tanto, é necessário conhecer como ocorre a infecção por HIV e, além disso, conhecer de modo mais aprofundado a estrutura da protease, do inibidor e avaliar interações envolvidas na formação do complexo inibidor-protease.

HIV é um vírus da classe dos retrovírus (Figura 7), apresenta formato esférico, possui 10-4_{mm de diâmetro e apresenta na composição, dois}

envelopes de glicoproteínas: gp 41 e gp 120. A gp 41 é uma glicoproteína de massa molar 41 que está inserida na membrana celular e a gp 120 uma glicoproteína de massa molar 120 que é extracelular, sendo ambas derivadas de gp 160. Além disso, HIV é constituído por dois nucleocapsídeos formados predominantemente pelas proteínas p24 e p18, as quais têm função de proteger duas fitas idênticas de RNA e três enzimas fundamentais: transcriptase reversa, integrase e protease (JANEWAY, 1996).

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Figura 7. Estrutura do HIV-1 (JANEWAY, 1996).

A infecção se dá da seguinte forma: linfócitos T, células do sistema imune, possuem em sua membrana proteínas do tipo CD4, as quais têm grande afinidade pela gp 120 do HIV. Assim, por meio do CD4, HIV se incorpora à membrana celular e libera o conteúdo de sua cápside no citoplasma celular.

Em seguida, a enzima transcriptase reversa traduz RNA viral em dupla fita de DNA. Esta dupla fita de DNA é transportada por meio da integrase ao núcleo da célula, ou seja, a integrase promove a incorporação do DNA viral ao material genético da célula hospedeira. A partir do DNA viral incorporado, o vírus sintetiza novas moléculas de RNA e proteínas essenciais para formação de outros vírus. Essas novas proteínas, produzidas na forma das poliproteínas Gag e Pol, movem-se para a superfície da célula, brotam e levam consigo parte da superfície da célula hospedeira para formar a camada externa viral. Este processo causa a lise da camada externa da célula e conseqüente morte celular.

Como as poliproteínas citadas são apenas precursoras de proteínas essenciais à vida do vírus, a ação da protease vem como determinante no sentido de catalisar, a partir dessas poliproteínas, a síntese de proteínas e enzimas estruturalmente funcionais e extremamente necessárias para o ciclo de vida do HIV. Ou seja, o fato de o referido vírus, sem a ação da enzima protease (Figura 8), ser imaturo e, portanto, incapaz de infectar novas células (Figura 9), e de determinados compostos terem a propriedade de interagir com

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a referida enzima de modo a inibi-la ou impedi-la de catalisar o processo anteriormente descrito, permite destacar uma alternativa extremamente promissora no combate ao HIV: sintetizar compostos capazes de inibir ou desativar a protease sendo este, portanto, um dos objetivos deste trabalho.

Figura 8. Protease do HIV-1 (JUNIOR, 2001).

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Foi destacada, inicialmente, a importância de grupos hidrófobos no que se refere a lipossolubilidade de 1, 2, 3, 4 e 5. Projetar compostos potencialmente bioativos perpassa por considerar a participação efetiva destes grupos na interação com fendas tubulares, fator que reflete diretamente na atividade destes compostos. Estas fendas compõem o sítio ativo da protease e são formadas por estruturas hidrofóbicas que estão dispostas como abas.

LEUNG, 2000, descreve a interação do tipo ligação de hidrogênio, a principal responsável pelo Saquinavir® promover a inibição da enzima, protease. A Figura 10 é uma representação das interações do sítio ativo da protease do HIV-1 com o antiviral Saquinavir®. A avaliação desta figura permite identificar que o sítio ativo da referida enzima é composto basicamente pelos aminoácidos ácido aspártico, glicina e isoleucina. E, segundo o mesmo autor, a referida ligação de hidrogênio, que pode ser mediada ou não por moléculas de água presentes no meio, ocorre via grupos funcionais do Saquinavir® com grupos funcionais dos aminoácidos: ácido aspártico, glicina e isoleucina existentes no sítio ativo da protease (ver Figura 10).

Figura 10. Interações do sítio ativo da protease do HIV-1 com o antiviral Saquinavir® (LEUNG, 2000).

Legenda:

Asp = Ácido aspártico Gly = Glicina