OBJETIVOS

Verificar o efeito de pulsos de vocalizações de co-específicos e de escuro sobre o ritmo circadiano de atividade motora em sagüis.

Objetivos Específicos

• Comparar as respostas de fase do ritmo circadiano de atividade motora de sagüis após:

- pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro; - pulsos de escuro.

• Avaliar o potencial sincronizador da reprodução de vocalizações de co- específicos em escuro total sobre o ritmo circadiano de atividade motora de sagüis.

Hipóteses e Predições

H1) O efeito de estímulos não-fóticos sobre o ritmo circadiano da atividade motora é independente da natureza do estímulo.

P1) As respostas de fase desencadeadas pelos pulsos de vocalizações de co- específicos em escuro total terão características semelhantes às da curva de resposta de fase para estímulos não-fóticos descritas em trabalhos anteriores.

H2) Mudanças de fase por pulsos de escuro são mediadas por mecanismo não-fótico durante o dia subjetivo e no final da noite subjetiva, e via mecanismo imagem especular fótico no fim do dia subjetivo e início da noite subjetiva.

P2.1) As respostas de fase aos pulsos de escuro durante o dia subjetivo e no final da noite subjetiva terão características semelhantes às desencadeadas pelos pulsos de vocalizações de co-específicos.

P2.2) As respostas de fase aos pulsos de escuro no fim do dia subjetivo e no início da noite subjetiva terão características opostas às desencadeadas por pulsos de luz.

H3) Vocalizações de co-específicos sincronizam o ritmo circadiano da atividade motora de sagüis.

P3) A reprodução diária de vocalizações de co-específicos sincronizará o ritmo circadiano da atividade motora dos sagüis.

3. Metodologia

a) Sujeito Experimental

Foram estudados 7 sagüis (Callithrix jacchus) machos adultos entre 3 e 6 anos de idade, sem parentesco, nascidos em cativeiro no Núcleo de Primatologia da UFRN, à exceção de Pipoca, de origem selvagem. Antes do experimento cada animal estava sob condições ambientais naturais em uma gaiola que impedia apenas o contato físico entre os animais. Cada animal foi identificado de acordo com o cadastro do Núcleo (Quadro 1).

Quadro 1: Animais observados nesse trabalho.

Nome Idade no Início do Experimento Peso Médio ± DP (gr)

BorgesC 5 anos 351 ± 21 DokoC 5 anos 451 ± 8 PipocaS 3 anos 308 ± 14 PaoloC 6 anos 367 ± 15 XerxesC 5 anos 381 ± 24 LuizC 3 anos 341 ± 11 XandoC 6 anos 301 ± 16

C _{nascido em cativeiro no Núcleo de Primatologia da UFRN,} S _selvagem.

O estado de saúde dos animais foi acompanhado através da observação dos padrões de atividade motora e comportamento, medidas dos pesos corporais e do registro da ingestão alimentar. Esse registro foi obtido pela diferença entre as pesagens dos pratos antes de serem colocados nas gaiolas pela manhã e após serem retirados à tarde. A maioria dos animais apresentou bom estado de saúde e peso regular durante todo o experimento (Quadro 1). Dois animais, Xando e Pipoca, apresentaram sintomas da Síndrome de Emagrecimento Progressivo (SEP) (Schroeder, Osman, Roggenbuck & Mothes 1999) sendo retirados da sala experimental antes do término do experimento (figura 2). Xando permaneceu no experimento entre 27 de abril e 24 de agosto de 2006, quando foi retirado da sala experimental, e em sua gaiola foi colocado Doko. Pipoca permaneceu no experimento entre 27 de abril de 2006 e 02 de janeiro de 2007.

Mês Borges Doko Pipoca Paolo Xerxes Luiz Xando abr-06 mai-06 jun-06 jul-06 ago-06 set-06 out-06 nov-06 dez-06 jan-07 fev-07 mar-07 abr-07

Figura 2: As barras cinzas representam o tempo de permanência de cada animal no experimento. b) Condições de Manutenção

Cada sagüi foi mantido em uma gaiola de tela de arame com 76 cm de altura x 40 cm de largura x 60 cm de profundidade, equipada com comedouro, bebedouro, poleiro e toca de PVC pintada de preto no interior para evitar a entrada de luz. Foi utilizado um anteparo branco de madeira entre cada gaiola que evitava o contato visual e físico entre os animais, porém não impedia o contato auditivo e olfativo entre eles (Figuras 3 e 4).

Figura 3: Disposição das gaiolas na sala experimental no Núcleo de Primatologia da UFRN. São observados sensores de movimento por infravermelho sobre cada gaiola, anteparos de madeira brancos entre cada gaiola, que impedem o contato físico e visual entre os sagüis, os potes de passas, os comedouros, os poleiros e as tocas de pvc.

Os animais tinham água, ração para primatas (Megazoo P-25, fabricante Vale Verde Destilaria e Parque Ecológico, Minas Gerais, Brasil) e uva-passa ad libitum. A alimentação era fornecida duas vezes ao dia: pela manhã entre 05:30 e 11:00 h, e à tarde entre 12:00 e 19:00 h. Pela manhã os sagüis recebiam papa* e frutas da época, como banana, melancia, mamão, manga, entre outras. À tarde, a alimentação colocada pela manhã era substituída por frutas da época ou batata-doce cozida. Adicionalmente eles recebiam leite fermentado com lactobacilos vivos, goma arábica ou ovo em dias e horários aleatórios, como formas de reforço alimentar e enriquecimento ambiental.

Figura 4: Gaiolas da sala experimental em detalhe. É possível observar os sagüis separados por anteparos brancos de madeira, os comedouros, as garrafas d’água, os poleiros, as tocas de pvc, os potes de passas e um sensor de movimento por infravermelho sobre cada gaiola.

Os sagüis foram mantidos em uma sala com isolamento acústico parcial, que possibilitava a entrada de silvos longos, denominados phees, emitidos pelos co- específicos da colônia.

A temperatura média da sala foi 26,7 ± 0,3°C e a média da umidade relativa do ar foi 78,2 ± 6%. A renovação do ar foi feita por um exaustor ligado em dias e horários aleatórios.

Inicialmente a condição de iluminação da sala foi de claro-escuro (CE) 12:12 (~ 300:2 lux), sendo a fase de claro entre 07:00 e 19:00 h. Posteriormente, a condição de iluminação passou a ser claro constante (CC) fraco de aproximadamente 2 lux. Na fase de claro do CE, a iluminação da sala foi realizada por quatro lâmpadas fluorescentes de luz branca de 32 watts (~ 300 lux). Na fase de escuro do CE e durante o CC fraco, a iluminação foi realizada por uma pequena lâmpada incandescente de luz amarela de 7 watts (~ 2 lux).

c) Procedimentos (Figura 6) c1) Adaptação

Para adaptação às condições ambientais e às gaiolas da sala experimental, os animais ficaram entre 26 de abril e 17 de julho de 2006 (~ 83 dias) sob CE 12:12 (~ 300:2 lux), sendo a fase de claro entre 7:00 e 19:00 h. Como no cativeiro em ambiente natural, onde eles estavam, a fase de claro inicia em torno das 05:00 h e a de escuro em torno das 17:00 h, eles sofreram um atraso de fase de 2 horas ao serem transferidos para a sala experimental.

c2) Estímulos Não-Fóticos

- Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro

Após a fase de adaptação, os animais ficaram sob CC fraco de aproximadamente 2 lux até o ritmo circadiano da atividade motora (RCA) endógeno da maioria dos animais se expressar de forma estável. Então, foi aplicado um pulso de vocalizações de co-específicos em escuro total entre 7:30 h e 08:30 h (horário local), sendo esse procedimento repetido após 22 dias.

Para excluir a influência da presença do pesquisador nas respostas aos pulsos, a caixa de som foi colocada na Sala 2 alguns dias antes e os fios colocados através da porta, no dia anterior à aplicação dos pulsos de vocalizações associados ao escuro (figura 5). O timer (programador de horário eletromecânico) foi ajustado no dia

anterior à aplicação dos pulsos. Dessa forma, para a aplicação dos pulsos, o pesquisador entrava apenas na Sala 1, onde conectava os fios da caixa de som ao “notebook”, que reproduzia as vocalizações através do programa “Windows Media Player”, com intensidade de ∼ 92 decibéis.

As vocalizações foram gravadas de animais em cativeiro em ambiente natural no Núcleo de Primatologia da UFRN, entre 5:20 e 7:00 h da manhã, nos dias 04 de junho, 01, 07 e 08 de novembro de 2006. As gravações foram feitas através de um microfone (Electret Condenser Telescopic Microphone V-6502, fabricante Saul Mineroff Electronics, NY, USA) conectado a um gravador Tascan DA-P1 DAT (fabricante TEAC Corporation, Tokyo, Japão). A gravação era composta por phee,

twitter, peep de animais adultos e tsik de adultos e filhotes (Epple 1968), que eram

reproduzidos aleatoriamente com o objetivo de evitar habituação à seqüência da reprodução. Os animais da sala experimental vocalizavam freqüentemente durante a reprodução das vocalizações, principalmente após a reprodução de phee.

- Pulsos de Escuro

Após a etapa dos pulsos de vocalizações de co-específicos, foram aplicados dois pulsos de escuro entre 07:30 h e 08:30 h (horário local), com intervalo de 14 dias entre eles. Para excluir a influência da presença do pesquisador nas respostas aos pulsos, o timer era ajustado no dia anterior à aplicação dos pulsos.

- Reprodução de vocalizações de co-específicos em escuro diariamente

Com o objetivo de sincronizar o ritmo circadiano da atividade motora dos sagüis foram aplicados pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro total entre 19:00 h e 20:00 h, por 5 dias consecutivos. Após 21 dias o procedimento foi repetido durante 30 dias consecutivos. Os pulsos diários foram executados da mesma forma que os pulsos isolados descritos anteriormente.

Fio Mesa

Luiz

Borges Doko Pipoca Paolo

Sala Experimental

Sala 2

Sala 1

Figura 5: Diagrama das salas onde foi realizado o experimento. Como o exaustor de ar ficava na Sala 2, a porta entre esta sala e a sala experimental era mantida aberta, enquanto as outras portas eram mantidas fechadas. A gaiola 7 ficou vazia durante todo o experimento. Durante o tempo em que ficou no experimento, Xando permaneceu na gaiola que foi ocupada posteriormente por Doko. (PC – computador; CS – caixa de som; EX – exaustor de ar; G7 – gaiola 7).

d) Método de coleta de dados

A atividade motora dos sagüis foi registrada continuamente através de sensores de movimento por infravermelho sobre as gaiolas (Figuras 3 e 4), conectados a um computador através de uma placa de aquisição de dados da National Instruments (NI

PCI – 6025E). Os dados foram totalizados e registrados em intervalos de 5 minutos

pelo software Aschoff (desenvolvido pelo Laboratório de Cronobiologia – UFRN).

CE 12:12 (07:00 às 19:00 h) – 83 dias ↓

CC fraco – 137 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 07:30 h (02/12/06) ↓

CC fraco – 22 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 07:30 h (25/12/06) ↓ CC fraco – 19 dias ↓ 1h Pulso de escuro às 07:30 h (14/01/07) ↓ CC fraco – 14 dias ↓ 1h Pulso de escuro às 07:30 h (29/01/07) ↓ CC fraco – 14 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 19:00 h – 5 dias (13 a 17/02/07) ↓

CC fraco – 21 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 19:00 h – 30 dias (11/03 a 09/04/07) ↓

CC fraco – 17 dias

Figura 6: Esquema das condições a que os sagüis foram expostos com a data e a duração de cada fase. A duração total do experimento foi 366 dias.

e) Análise dos dados

O ritmo circadiano da atividade motora (RCA) de cada sagüi foi analisado através de inspeção visual dos actogramas, do cálculo do período endógeno (τ) e da duração da fase ativa (α) por décadas*, nas condições de iluminação de CE e CC fraco ao longo de todo o experimento. Por meio do programa El Temps (Díez-Noguera, Barcelona, Espanha) foram construídos os actogramas, calculado o α e calculado o τ_G utilizando o periodograma Lomb-Scargle.

A análise visual dos actogramas apontou modulações no RCA dos animais em função da coincidência de suas fases ativas com as horas iniciais da atividade dos animais da parte externa da colônia. Para avaliar a influência desses animais da parte externa, foram comparados o τ e o α pelo teste t para amostras dependentes, entre os

dias em que a fase ativa dos animais da sala experimental coincidiam com o horário entre o nascer do sol e 08:00 h do ambiente externo e os dias em que não coincidiam. Esta análise abrangeu os dados do primeiro dia de CC até o dia imediatamente anterior ao início da etapa de aplicação diária de pulsos de vocalização.

Para a análise das respostas de fase após os pulsos foram estimados os horários do início da atividade no dia seguinte a cada pulso, pela regressão linear com o método dos quadrados mínimos utilizando o início da atividade dos 7 dias anteriores e do segundo ao sétimo dia posterior ao pulso. As respostas de fase foram determinadas pela diferença entre o início da atividade estimado com base nos 7 dias anteriores ao pulso e o início da atividade calculado com base no segundo ao sétimo dia posterior ao pulso. Para essa análise, como início da atividade foi considerado o primeiro intervalo de 15 minutos com valor superior ou igual a 10% da média horária diária, que se mantinha por um mínimo de 30 minutos dentro de 1 hora (critério adaptado a partir de Glass et al. 2001).

As horas circadianas (HCs) atingidas pelos pulsos foram definidas com base no τ definido pelo periodograma Lomb-Scargle a partir dos dez dias imediatamente anteriores a cada pulso.

Para avaliar o efeito sincronizador dos pulsos aplicados entre 19:00 h e 20:00 h (horário local) diariamente, foi realizada inspeção visual dos actogramas e análise do τ nas duas etapas de aplicações de pulsos. Na primeira etapa, durante os 5 dias de aplicação dos pulsos e nas 2 décadas anteriores e posteriores. Na segunda etapa, nas 3 décadas durante a aplicação dos pulsos e nas 2 décadas anteriores e posteriores. O Teste t para amostras dependentes foi utilizado para comparar o τ dos sagüis entre as décadas.

O nível de significância considerado para todos os testes estatísticos foi de 95% (p ≤ 0,05).