Efeitos de vocalizações de co-específicos e do escuro sobre o ritmo circadiano da atividade motora em sagüis (Callithrix jacchus)

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CRHISTIANE ANDRESSA DA SILVA

EFEITOS DE VOCALIZAÇÕES DE CO-ESPECÍFICOS

E DO ESCURO SOBRE O RITMO CIRCADIANO DA

ATIVIDADE MOTORA EM SAGÜIS (

Callithrix jacchus

)

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.

Orientadora: Profª. Drª. Carolina V. Macedo Azevedo

Co-orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante

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EFEITOS DE VOCALIZAÇÕES DE CO-ESPECÍFICOS

E DO ESCURO SOBRE O RITMO CIRCADIANO DA

ATIVIDADE MOTORA EM SAGÜIS (

Callithrix jacchus

)

CRHISTIANE ANDRESSA DA SILVA

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.

Orientadora: Profª. Drª. Carolina V. Macedo Azevedo

Co-orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante

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Título: EFEITOS DE VOCALIZAÇÕES DE CO-ESPECÍFICOS E DO ESCURO SOBRE O RITMO CIRCADIANO DA ATIVIDADE MOTORA EM SAGÜIS (Callithrix jacchus)

Autora: Crhistiane Andressa da Silva

Data da Defesa: 06/09/2007

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Luiz Menna-Barreto Universidade de São Paulo, SP

Prof. Dr. Alexandre A. Lara Menezes Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

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“Jamais se desespere em meio às mais sombrias aflições de sua vida, pois das nuvens mais negras cai água límpida e fecunda”.

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Agradecimentos AgradecimentosAgradecimentos Agradecimentos

Primeiramente, agradeço a Deus por ter me ajudado em mais uma etapa de minha vida!

Um agradecimento especial a Profa. Carolina, cujos ensinamentos, conselhos, sabedoria e paciência foram fundamentais para o meu retorno ao mestrado e na realização deste trabalho!

Aos Profs. Jefferson, John e Alexandre pelos sábios conselhos e por estarem sempre disponíveis a ajudar e contribuir!

A André, Aline e Gutemberg pelo grande apoio no cuidado com os animais e na realização dos experimentos.

Ao pessoal do Núcleo de Primatologia, Flávio, Edinólia, Luiz, Geniberto, Zé Rubens, Francisco, Tota e Márcio pela ajuda no cuidado com os sagüis.

A Cristiano e Ruthnaldo, cuja ajuda foi primordial na realização dos experimentos!

Aos meus pais e irmãos pelo apoio e ajuda imprescindíveis ao longo do mestrado e durante o tempo em que fiquei afastada da universidade!

Um muito obrigada ao grande e querido amigo Leland, que torce pelo meu sucesso e me apóia desde a graduação!

A Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal e do Ensino Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado.

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Resumo

Silva, C.A. (2007). Efeitos de vocalizações de co-específicos e do escuro sobre o ritmo circadiano da atividade motora em sagüis (Callithrix jacchus). Dissertação de

Mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal.

O principal zeitgeber para a maioria das espécies é o ciclo claro-escuro (CE), porém outros fatores ambientais como disponibilidade de alimento, temperatura e pistas sociais podem atuar. O ajuste diário do marcapasso circadiano deve resultar da integração de pistas ambientais, fóticas e não-fóticas, com pistas homeostáticas. Como a caracterização do efeito de estímulos não-fóticos sobre o sistema de temporização circadiano em mamíferos diurnos é escassa em relação aos noturnos, principalmente em relação a pistas com significado ecológico, analisamos o efeito de vocalizações de co-específicos e do escuro sobre o ritmo circadiano de atividade motora (RCA) do primata diurno Callithrix jacchus. Com esse objetivo, foram isolados 7 machos adultos

em uma sala com iluminação, temperatura (26,8 ± 0,2°C) e umidade (81,6 ± 3,6%)

controladas e isolamento acústico parcial. Inicialmente os animais ficaram sob CE 12:12 (∼300:2 lux) e posteriormente sob claro constante (∼2 lux). Foram aplicados

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Abstract

Silva, C.A. (2007). Effects of conspecific vocalizations and darkness on the circadian activity rhythm in marmosets (Callithrix jacchus). Dissertação de Mestrado,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal.

The principal zeitgeber for most of species is the light-dark photocycle (LD), though other environment factors as food availability, temperature and social cues may act. Daily adjustment of the circadian pacemaker may result from integration of environmental photic and non-photic cues with homeostatic cues. Characterization of non-photic effects on circadian timing system in diurnal mammals is scarce in relation to nocturnal, especially for ecologically significant cues. Thus, we analyzed the effect of conspecific vocalizations and darkness on circadian activity rhythm (CAR) in the diurnal primate Callithirx jacchus. With this objective 7 male adults were isolated in a

room with controlled illumination, temperature (26,8 ± 0,2°C) and humidity (81,6 ±

3,6%), and partial acoustic isolation. Initially they were under LD 12:12 (∼300:2 lux),

and subsequently under constant illumination (∼2 lux). Two pulses of conspecific

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO... 11

a) Ritmicidade Biológica... 11

b) Sincronização ao Ambiente... 12

Sistema de Temporização Circadiano... 14

Sincronização Fótica... 16

Sincronização Não-Fótica... 18

Efeito do Escuro... 22

Interação entre Estímulo Fóticos e Não-Fóticos... 24

c) O sagüi como modelo experimental... 26

2. OBJETIVOS... 29

3. METODOLOGIA... 31

a) Sujeito experimental... 31

b) Condições de manutenção... 32

c) Procedimentos... 34

c1) Adaptação... 34

c2) Estímulos não-fóticos e escuro... 34

d) Método de coleta de dados... 36

e) Análise dos dados... 37

4. RESULTADOS... 39

Ritmo circadiano da atividade motora ao longo do experimento... 39

Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro... 48

Pulsos de escuro... 51

Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro durante 5 dias... 51

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5. DISCUSSÃO... 54

6. CONCLUSÕES... 64

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1. Introdução

a) Ritmicidade Biológica

Desde tempos mais remotos, os seres vivos convivem com processos rítmicos no ambiente. As interações da Terra com o Sol e a Lua, aliadas à inclinação natural do seu eixo, resultam nos ciclos geofísicos, tais como o ciclo claro-escuro, as estações do ano e a oscilação das marés, entre outros. Relatos antigos já descreviam os ritmos biológicos, oscilações periódicas na expressão de comportamentos e funções da matéria viva. Entretanto, acreditava-se que esses ritmos representavam apenas uma resposta passiva aos ciclos geofísicos (Rotenberg, Marques, Menna-Barreto 2003).

O primeiro estudo sistematizado dos ritmos biológicos foi realizado pelo astrônomo francês Jean Jacques de Mairan, em 1729. Ele observou que uma planta sensitiva, uma espécie de Mimosa, mantinha os movimentos rítmicos das folhas com

uma periodicidade diária na ausência do ciclo claro-escuro, sugerindo pela primeira vez o caráter endógeno da ritmicidade biológica. Posteriormente, essas observações foram confirmadas em outras plantas e organismos, demonstrando de maneira irrefutável que a geração da ritmicidade biológica é endógena e não exógena, como se acreditava inicialmente. O ritmo biológico expresso dessa forma, ou seja, sob condições ambientais constantes, é denominado ritmo em livre-curso (Rotenberg et al.

2003).

O fato dos ritmos biológicos serem gerados endogenamente não significa que eles sejam insensíveis aos ciclos ambientais. Pelo contrário, é extremamente importante para a sobrevivência que eles mantenham uma relação de fase estável com os ciclos ambientais aos quais a espécie é sensível. Isso permite que os estados dos ritmos fisiológicos e comportamentais estejam associados às fases mais propícias dos ciclos ambientais para a sobrevivência da espécie. Essa relação de fase estável dos ritmos biológicos com os ciclos ambientais é chamada sincronização (Marques, Golombek, Moreno 2003).

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circadianos apresentam um ciclo recorrendo a cada 24 horas (períodos em torno de 24 ± 4 horas) e estão associados ao ciclo claro-escuro, como o ritmo da atividade e repouso dos animais. Os ritmos ultradianos apresentam mais de um ciclo recorrendo dentro de um dia (períodos menores que 20 horas), como o ritmo dos batimentos cardíacos e dos movimentos respiratórios, enquanto os ritmos infradianos recorrem em intervalos superiores a um dia (períodos maiores que 28 horas), como o ciclo estral dos animais (Rotenberg et al. 2003). Porém, devido à supervalorização dos ritmos

circadianos e por não haver um significado funcional nessa classificação, Araújo e Marques (2003) propõem a divisão dos ritmos biológicos em duas categorias: ritmos com correlatos com ciclos geofísicos, relacionados funcionalmente com a antecipação de uma mudança no ambiente, e ritmos sem correlatos com ciclos geofísicos, relacionados com a antecipação de uma mudança no meio interno.

Sendo assim, a ritmicidade biológica é uma característica extremamente importante por promover uma organização temporal interna na fisiologia e no comportamento dos seres vivos e possibilitar a sincronização ao ambiente externo, auxiliando-os a “predizer” e se preparar para as mudanças ambientais periódicas e regulares (Pittendrigh 1960; Challet & Pévet 2003; Davidson & Menaker 2003). Dessa forma, garante um funcionamento ótimo do sistema biológico, com maior eficiência, desempenho e bem-estar (Weinert 2005).

Os ritmos biológicos que possuem um correlato ambiental são os mais estudados, tanto pela sua obviedade quanto pela facilidade proporcionada pelo fato de se conhecer as principais freqüências das oscilações. Dentre eles, os mais estudados e, portanto mais bem descritos e conhecidos, são os ritmos circadianos (Marques et al.

2003).

b) Sincronização ao Ambiente

Para que seja mantida uma relação de fase estável entre os ritmos circadianos e o zeitgeber*, é necessário que o período endógeno (τ), que sob condições constantes é

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diferente de 24 horas, ajuste-se ao período do ciclo ambiental (T) e passe a se expressar com o período exato de 24 horas. Esse processo pode ocorrer através dos mecanismos de arrastamento ou mascaramento (Daan & Aschoff 2001; Marques et al.

2003).

No mecanismo de arrastamento, o período e a fase do ritmo biológico são ajustados através de deslocamentos de fase provocados pelos zeitgebers. A nova sincronização é conseguida gradualmente, após um ou mais ciclos transientes, durante os quais podem-se observar atrasos ou adiantamentos de fase. São propostos dois modelos de arrastamento, um através de um mecanismo de arrastamento discreto ou não-paramétrico e o outro através do arrastamento contínuo ou paramétrico (Aschoff 1999; Daan & Aschoff 2001; Johnson et al. 2003; Pittendrigh 1960).

O modelo de arrastamento não-paramétrico se baseia no efeito fásico ou discreto que pulsos do zeitgeber provocam sobre o oscilador biológico. Dependendo da fase do ritmo em livre-curso na qual é aplicado, o pulso vai provocar atraso, adiantamento ou pode não ter efeito sobre o ritmo. Então, para que ocorra a sincronização por arrastamento, é necessário que o pulso caia numa fase que provoque um deslocamento significativo de fase que corrija a diferença entre o período endógeno e o período do zeitgeber. Uma maneira de se estudar esse mecanismo é através da aplicação de pulsos idênticos do estímulo nas diferentes horas do dia circadiano no organismo em livre-curso. A duração e a direção do deslocamento de fase provocado por esse procedimento, relacionado com a fase de exposição ao pulso pode ser representada graficamente na denominada curva de resposta dependente da fase (CRF) (Aschoff 1999; Daan & Aschoff 2001; Johnson et al. 2003; Marques et al.

2003; Pittendrigh 1960).

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No mecanismo de mascaramento, a sincronização é decorrente de efeitos diretos do zeitgeber sobre a expressão dos ritmos circadianos, sem envolvimento do oscilador biológico (Aschoff 1999; Daan & Aschoff 2001; Marques et al. 2003). Esse

mecanismo confere plasticidade ao sistema de temporização circadiano, pois possibilita ao organismo responder instantaneamente a um estímulo ambiental, proporcionando uma flexibilidade não permitida nos mecanismos rígidos do arrastamento, além de refinamento e aceleração do ajuste do organismo ao ambiente (Marques et al. 2003).

O principal zeitgeber para a maioria das espécies é o ciclo claro-escuro (CE), que é o sinal temporal mais preciso na maioria dos ambientes. Porém, outros fatores ambientais podem atuar como zeitgeber, principalmente em espécies que não têm contato com o ciclo CE em seu habitat natural, como os organismos que vivem em cavernas ou no fundo do mar, embora haja pouca informação sobre a sincronização nessas condições (Daan & Aschoff 2001). Exemplos de ciclos ambientais importantes como zeitgebers para várias espécies são os ciclos de disponibilidade de alimento, temperatura, umidade relativa, pistas sociais, entre outros (Chandrashekaran 1982; Davidson & Menaker 2003; Marques et al. 2003). Portanto, em ambiente natural o

ajuste diário do relógio circadiano deve resultar da integração de várias pistas ambientais, fóticas e não-fóticas, com pistas homeostáticas (Challet & Pévet 2003). O sistema fisiológico responsável por essa integração, pela geração e sincronização da ritmicidade circadiana é denominado sistema de temporização circadiano.

- Sistema de Temporização Circadiano (STC)

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O núcleo supraquiasmático (NSQ) é considerado o marca-passo principal da ritmicidade circadiana de mamíferos, nos quais se apresenta como um núcleo par de neurônios localizados na região anterior do hipotálamo, acima do quiasma óptico, lateralmente ao terceiro ventrículo (Moore 1999). É anatomicamente dividido em uma região ventrolateral, responsável pela sincronização aos ciclos ambientais externos, e uma região dorsomedial, responsável pela geração e estabilidade da ritmicidade circadiana (Nakamura, Honma, Shirakawa, Honma 2001).

As principais vias sincronizadoras que transmitem informações ambientais para o NSQ são o trato retino-hipotalâmico (TRH), o trato genículo-hipotalâmico (TGH) e a via rafe-NSQ (Challet & Pévet 2003; Moore 1999). O TRH origina-se a partir de células ganglionares da retina que se projetam para o NSQ. É a principal via aferente que conduz estímulos luminosos ao NSQ, sendo necessário para a sincronização ao ciclo claro-escuro ambiental. O TGH tem origem no folheto intergeniculado (FIG), que é parte do complexo geniculado lateral do tálamo e, assim como o NSQ, recebe projeções diretas da retina. Dessa forma, o TGH é mediador indireto de informações fóticas do ambiente, além de mediador de informações não-fóticas para o NSQ. A via rafe-NSQ, originada no núcleo da rafe mesencefálica, é tida como a principal entrada de informação não-fótica no NSQ. Além disso, está envolvida na modulação da sincronização fótica (Challet & Pévet 2003; Golombek & Aguilar-Roblero 2003; Moore 1999).

A principal via efetora do NSQ dirige-se para outros núcleos do hipotálamo, para a rafe, o tálamo e a área pré-óptica. Essas projeções estão relacionadas com o envio do sinal circadiano para os sistemas nervoso e endócrino, que o repassam para o restante dos órgãos e sistemas (Golombek & Aguilar-Roblero 2003).

Outra via efetora do NSQ regula a secreção de melatonina pela glândula pineal. Esse hormônio é liberado apenas na fase de escuro, pois sua secreção é inibida pelo claro. Dessa forma a melatonina é um sinal fidedigno dos comprimentos do dia e da noite para o STC (Goldman 1999; Golombek & Aguilar-Roblero 2003; Moore 1999).

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Shirakawa, Honma 2004; Weinert 2005). Também existem evidências da existência de células geradoras de oscilações circadianas em outras regiões cerebrais como o córtex cerebral, o hipocampo, e em vários órgãos periféricos, como fígado, coração, pulmão e músculos. Acredita-se que o STC seja organizado de maneira hierárquica, tendo o NSQ como oscilador principal que se mantém acoplado aos osciladores periféricos por meio de conexões nervosas do sistema nervoso autônomo e por sinais humorais (Brandstaetter 2004; Weinert 2005).

- Sincronização fótica

O sinal de luz diário reajusta os ritmos circadianos a cada ciclo, corrigindo a diferença entre o período endógeno e as 24 horas ambientais, sincronizando os organismos ao ambiente externo (Davidson & Menaker 2003). Uma maneira de se estudar como o ciclo claro-escuro atua sobre o STC é pela construção de uma CRF fótica, através da aplicação de pulsos de luz em indivíduos mantidos em escuro constante, se for uma espécie noturna, ou em claro constante com intensidade luminosa fraca, se for uma espécie diurna (Daan & Aschoff 2001; Marques et al.

2003).

A CRF fótica para roedores noturnos (figura 1) é caracterizada por pequenas mudanças de fase após pulsos de luz aplicados durante o dia subjetivo e grandes mudanças de fase após os pulsos durante a noite subjetiva. No início da noite subjetiva são desencadeados atrasos de fase, enquanto no final da noite subjetiva são desencadeados avanços de fase (Daan & Aschoff 2001). O mesmo é observado para o roedor diurno Arvicanthis ansorgei (Slotten, Krekling, Pévet 2005) e para o primata

diurno sagüi (Callithrix jacchus) (Wechselberger & Erkert 1994). Porém, no sagüi

foram observadas grandes mudanças de fase na atividade motora circadiana durante o dia subjetivo, quando é esperado que o STC não seja muito sensível a mudanças pontuais na intensidade de luz. Os autores sugerem que essas mudanças de fase possam ter sido causadas por influência direta da luz sobre o sistema circadiano ou pelo efeito não-fótico de uma alteração do estado de atividade (arousal) induzida pela

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Figura 1: Curva de resposta dependente da fase para pulsos de luz (quadrados) e pulsos de 3h de corrida na roda atividade (losangos). Esses dados foram obtidos de hamsters da linhagem Syrian sob escuro constante. (Figura copiada de Mistlberger & Skene 2004).

Segundo Glass e colaboradores (2001) as manipulações fóticas não devem induzir respostas comportamentais, pois a luz pode ter um efeito mascarador positivo que aumenta a atividade desencadeando ativação comportamental, que por si só pode ter efeito sobre o STC. Com base nisso aplicaram um pulso diário de luz com flashes estroboscópicos, durante apenas 20 segundos no final do dia subjetivo, por 12 dias, com o objetivo de sincronizar sagüis (Glass, Tardif, Clements, Mrosovsky 2001). Eles observaram que a sincronização ocorreu através de avanços de fase de 1,3 a 1,7 h, quando os pulsos incidiram sobre o fim da noite subjetiva (CT 18-22) dos animais. Por outro lado, ocorreu através de atrasos de fase de 1,0 a 1,6 h, quando incidiram entre o fim do dia subjetivo e o início da noite subjetiva (CT 9-12). Arvicanthis ansorgei

também sincronizou a pulsos diários de luz, com duração de 30 minutos, através de avanços e atrasos de fases (Slotten et al. 2005).

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significado adaptativo de otimizar a sincronização fótica de oscilações circadianas (Challet & Pévet 2003; Daan & Aschoff 2001).

- Sincronização não-fótica

Todas as pistas temporais que não são luz são denominadas pistas não-fóticas. Elas podem mudar a fase do oscilador biológico e modular a sincronização fótica (Challet & Pévet 2003).

A CRF para pulsos de estímulos não-fóticos em roedores noturnos (figura 1) é caracterizada por avanços de fase durante o meio e o final do dia subjetivo e atrasos no início do dia subjetivo ou no final da noite subjetiva (Challet & Pévet 2003; Mrosovsky, Reebs, Honrado, Salmon 1989). Essas características parecem ser independentes da natureza do estímulo não-fótico, como foi observado no hamster

Mesocricetus auratus, que apresentou as mesmas mudanças de fase após encontros

agonistas com co-específicos, mudança de gaiola, corrida induzida por uma nova roda de atividade e administração de triazolam (Mrosovsky et al. 1989). Embora esses

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subjetiva desencadeia atraso de fase. Apoiando esta hipótese, a repetição do procedimento de restrição física, promovendo habituação, foi associada à ausência tanto dos rebotes de atividade como dos atrasos de fase.

Existe uma hipótese de que deve haver pelo menos dois mecanismos diferentes por trás das mudanças de fase não-fóticas, sendo um claramente dependente de atividade e outro independente (Bobrzynska & Mrosovsky 1998; Rosenwasser & Dwyer 2001). Essa parece ser a hipótese mais provável, visto que estudos de restrição física indicam que as mudanças de fase desencadeadas por triazolam são dependentes de atividade, enquanto as induzidas por chlordiazepoxide parecem ser mediadas apenas por ativação (Mrosovsky 1995). É possível que em algumas fases circadianas os dois mecanismos atuem concomitantemente, pois mudanças de fase associadas com ativação durante o repouso em hamsters foram dependentes da ocorrência de atividade (Mistlberger et al. 2003).

Com o objetivo de verificar se a atividade induzida ou a ativação comportamental, ou ambos, podem induzir mudanças de fase em mamíferos diurnos, Wechselberger (1994) aplicou pulsos de reprodução de sons de co-epecíficos associados à apresentação de um espelho em sagüis. Esses pulsos provocaram aumento na atividade locomotora tanto durante a fase de repouso como na fase ativa. Os pulsos desencadearam atrasos de fase no início e no meio da noite subjetiva e avanços no fim da noite subjetiva. Contudo, essas respostas foram semelhantes às desencadeadas por estímulos fóticos isoladamente. Como os sagüis estavam sob claro constante de 430 lux, é provável que a ativação comportamental tenha aumentado a quantidade de luz recebida pelos animais e que as mudanças de fase tenham sido primariamente fóticas ao invés de não-fóticas. Glass et al. (2001) sugeriram que se deve considerar a possível

interferência da luz quando ocorrem eventos não-fóticos, embora o ideal seja que as manipulações não-fóticas não resultem em mudança na quantidade de luz recebida pelo sujeito. Portanto, os dados de Wechselberger (1994) provavelmente não refletem um mecanismo não-fótico.

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escuro total, durante 76 dias. Mesmo com esse tipo de pulso comportamental estando fora do contexto ecológico dos animais, foi observada sincronização da atividade motora circadiana. Porém, a sincronização não foi permanente, durando aproximadamente 3 semanas. Como controle desse experimento, foram aplicados pulsos de escuro na ausência de atividade induzida durante 42 dias, os quais não tiveram efeito sincronizador. Uma possibilidade para a sincronização temporária pelos pulsos comportamentais é que esse estímulo não-fótico seja um sincronizador fraco, por não ter significado ecológico para essa espécie. Deve-se considerar também que os tipos de estímulos não-fóticos efetivos na mudança de fase diferem inter-especificamente. Outra hipótese é que a duração ou a intensidade do estímulo, ou ambos, tenham sido insuficientes para manter a sincronização. Contudo, quando a sincronização ocorreu, foi através de atrasos de fase produzidos pelos pulsos de atividade no final da noite subjetiva ou no início do dia subjetivo, sempre seguidos de atividade (Glass et al. 2001).

Por outro lado, Slotten et al. (2005) e Hut, Mrosovsky & Daan (1999)

obtiveram sincronização permanente a estímulos não-fóticos em seus experimentos com mamíferos diurnos. Slotten et al. sincronizaram o roedor Arvicanthis ansorgei por

meio de pulsos diários de 1 hora de melatonina nas fases circadianas de avanços e atrasos a estímulos não-fóticos. Hut, Mrosovsky & Daan sincronizaram o esquilo

Spermophilus citellus a pulsos de 3 horas de confinamento a uma roda de atividade,

observando avanços de fase no fim do dia subjetivo.

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Pistas sociais também devem ser importantes zeitgebers para Castor canadensis, já que famílias dessa espécie exibem sincronização mútua dos ritmos

circadianos da atividade durante o inverno, quando estão em tocas cobertas de neve, ou seja, sob escuro constante (Mistlberger & Skene 2004).

Estudos com primatas sociais não-humanos apontam para a importância de pistas sociais na expressão de ritmos circadianos. Por exemplo, foram observados pseudo-bipartição, coordenação relativa, mudanças no período endógeno e na duração

da fase ativa do ritmo circadiano da atividade motora de dois sagüis machos adultos, um da espécie Callithrix jacchus jacchus e o outro, C. j. penicillata. Essas mudanças

foram induzidas socialmente por uma fêmea presente na mesma sala, provavelmente por pista acústica (Erkert, Nagel, Stephani 1986). Somando-se a esses resultados, o contato sonoro entre sagüis promoveu a sincronização do ritmo circadiano da atividade motora entre pais e filhas, enquanto que entre casais sem relação de parentesco, induziu apenas mascaramento social positivo (Erkert & Schardt 1991). Esse resultado indica que o grau de parentesco é um fator importante na sincronização por pistas sociais. Além disso, um casal que conviveu durante anos não sincronizou mutuamente nem pelo contato acústico, nem pelo acústico e visual. Só houve sincronização mútua quando voltaram a coabitar a mesma gaiola, ou seja, foi necessário o contato social completo para a sincronização mútua. Isso se deu devido à considerável diferença entre seus períodos endógenos de 23,1 e 23,7 h, pois, para animais cujos períodos endógenos fossem mais próximos é provável que um zeitgeber social mais fraco levasse à sincronização mútua. Nesse sentido, quanto maior a proximidade dos períodos endógenos, maior a probabilidade de sincronização mútua apenas por pistas sociais. Em suma, estímulos auditivos são zeitgebers fracos e pode ocorrer sincronização social dos ritmos circadianos em primatas não-humanos dependendo do grau de parentesco e das diferenças individuais nos períodos endógenos (Erkert & Schardt 1991).

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luz doméstica (200: < 8 lux) não foram suficientes para manter a sincronização entre indivíduos (Middleton, Stone, Arendt 2002).

Em experimento realizado por Klerman et al. (1998), um sujeito cego foi capaz

de sincronizar a um esquema de atividade-repouso no laboratório (Davidson & Menaker, 2003). Porém, os pesquisadores escolheram um sujeito que era normalmente sincronizado em sua vida diária, dentro de uma amostra que incluía sujeitos com ritmos em livre-curso. Isso sugere que a sensibilidade dos ritmos circadianos às pistas sociais varia entre seres humanos.

A sensibilidade às pistas sociais varia largamente entre as espécies, o que é esperado, já que a organização social e os estilos de vida são muito variados. Umas são altamente dependentes das interações sociais, enquanto outras são praticamente independentes. Além disso, em condições naturais o ciclo claro-escuro é um zeitgeber quase sempre disponível. Portanto, parece improvável que as pistas sociais desempenhem um papel na sincronização básica dos organismos ao ambiente. Contudo, os sinais sociais devem ser importantes para o refinamento das respostas circadianas, em particular as respostas temporizadas envolvidas nas interações sociais adaptativas (Davidson & Menaker 2003).

As diferenças entre os mecanismos de sincronização fóticos e não-fóticos pode ser uma característica geral dos osciladores circadianos em mamíferos. De um ponto de vista ecológico, essas diferenças poderiam estar por trás da capacidade do animal em responder adaptativamente à variedade de pistas sincronizadoras existentes no ambiente natural (Glass et al. 2001).

- Efeito do Escuro

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Entretanto, hamsters da linhagem Syrian apresentaram avanços de fase a pulsos de escuro no meio e no final do dia subjetivo e no início da noite subjetiva e atrasos de fase entre o final da noite subjetiva e o início do dia subjetivo, independentes do nível de atividade (Mendoza, Dardente, Escobar, Pevet & Challet 2004; Rosenwasser & Dwyer 2001, 2002). Além disso, a restrição física bloqueou as mudanças de fase induzidas pelo escuro no meio do dia subjetivo. No início da noite subjetiva, a restrição física e o pulso de escuro produziram mudanças de fase independentes que se somaram. Essas observações dão suporte à hipótese dos autores de que as mudanças de fase induzidas por escuro dependem de mecanismos diferentes de acordo com as fases circadianas. Especificamente, mudanças de fase induzidas por escuro podem refletir um mecanismo não-fótico durante o meio do dia subjetivo, quando os níveis de atividade são normalmente mínimos, e um mecanismo de imagem especular fótica no início da noite subjetiva, quando os níveis de atividade são normalmente máximos (Rosenwasser & Dwyer 2002). Porém, são os animais noturnos que estão em vigília e com elevados níveis de atividade no início da noite subjetiva. Sendo assim, seria esperado que os animais diurnos apresentassem respostas opostas a pulsos de escuro no início da noite subjetiva. Contudo, não é isso que se observa.

A CRF para pulsos de escuro em Octodon degus, um roedor diurno, é

semelhante à CRF para animais noturnos (Labyak e Lee 1997). Além disso, sagüis (Callithrix jacchus) cegos ou com visão normal apresentaram atrasos de fase na

atividade motora após pulsos no início do dia subjetivo e avanços de fase após pulsos no final do dia subjetivo (Silva, Albuquerque, Araujo 2005), ou seja, respostas semelhantes às do degus e de roedores noturnos. Essas mudanças de fase não foram

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- Interação entre estímulos fóticos e não-fóticos

Nas situações reais, múltiplas interações entre pistas fóticas e não-fóticas devem ser importantes para o ajuste de fase diário do relógio circadiano e o controle da organização temporal de todo o organismo. Por exemplo, a exposição à luz durante o dia pode modificar o processamento de sinais não-fóticos pelo NSQ, assim como fatores não-fóticos podem modular respostas circadianas a pulsos de luz durante a noite e a mudanças no ângulo de fase da sincronização ao ciclo claro-escuro (Challet & Pévet 2003). A resposta do sistema circadiano a diferentes estímulos fóticos e não-fóticos é de grande importância porque implica que os sistemas circadianos são capazes de usar muitas fontes de informação (Silva et al. 2005).

Por exemplo, foi demonstrado que Octodon degus, um roedor diurno da

América do Sul, ressincroniza mais rapidamente após mudanças de fase do ciclo de luz devido a experiências sociais, e que essa aceleração é dependente do olfato. Por outro lado, não foi observada sincronização mútua nesses animais. Dessa forma, pistas sociais são consideradas zeitgebers fracos em degus (Goel & Lee 1995ab, 1996; Goel, Lee, Pieper 1998).

O hamster Mesocricetus auratus também ressincroniza mais rapidamente a

avanços de fase após experiências sociais, como a proximidade do macho a uma fêmea no estro durante as três primeiras horas no primeiro dia após um avanço de fase de 8 horas no ciclo CE. Contudo, machos que acasalaram com fêmeas não apresentaram aceleração na ressincronização (Honrado & Mrosovsky 1989).

Em primatas, pistas sociais aceleram a ressincronização fótica em sagüis durante atrasos de fase, possivelmente associado à maior captação de luz em decorrência do aumento na atividade dos animais na presença de um co-específico previamente sincronizado (Mendes 2004).

O ser humano está cada vez mais sujeito a variações bruscas na exposição ao fotoperíodo, devido à luz artificial, ao horário de verão, às viagens transmeridianas, que provocam os sintomas de jet lag, ou ao trabalho em turno, em que os trabalhadores

(26)

cegueira total que não conseguem sincronizar ao ambiente externo sofrem as mesmas conseqüências (Mistlberger & Skene 2005).

Com o objetivo de encontrar medidas comportamentais que minimizem os efeitos ocasionados pelas situações citadas acima e que auxiliem na ressincronização ao ambiente externo, vários estudos avaliaram a interação do exercício físico com a luz. Em um desses estudos, hamsters apresentaram avanços de fase de 2-3 h após pulsos de 3 h de corrida na roda de atividade induzida por novidade, do início para o meio do dia subjetivo. Essa mudança de fase foi quase totalmente anulada por um pulso de luz aplicado logo após o pulso de exercício, enquanto um pulso de luz aplicado cerca de 8 h após o pulso de exercício potencializou a mudança de fase. Comparando esses resultados com aquele desencadeado apenas por pulsos de luz, observa-se que as mudanças de fase fóticas e não-fóticas não se combinam aditivamente (Mrosovsky 1991).

Pessoas que praticaram diariamente exercício à noite sob luz fraca (~ 0,65 lux), após um atraso de fase de 9 horas no ciclo vigília-sono, apresentaram atrasos de fase significativos no ritmo circadiano da melatonina, sendo a magnitude da resposta dependente do horário circadiano em que foi efetuado (Barger, Wright, Hughes, Czeisler 2004). Segundo os autores pode existir um possível efeito sinérgico da luz com o exercício, já que a magnitude dos atrasos de fase desencadeados pelo exercício realizados sob luz fraca é menor do que quando o exercício é realizado sob luz forte. Por isso, o exercício é investigado como uma medida comportamental facilitadora da adaptação circadiana a atrasos de fase no ciclo sono-vigília (Barger et al. 2004;

Mrosovsky 1991).

(27)

de alternativas que minimizem os efeitos provocados pelas situações que provocam distúrbios na expressão da ritmicidade circadiana, assim como alternativas para facilitar a ressincronização. Dessa forma, os prejuízos para o organismo podem ser minimizados e a qualidade de vida das pessoas que sofrem com esses problemas, melhorada (Mistlberger & Skene 2005). Contudo, antes é necessário conhecer como cada pista age isoladamente sobre o STC para entender o efeito associado, principalmente o efeito das pistas sociais. Visto que, como os humanos vivem organizados em sociedade, este tipo de pista deve ter um papel muito importante no ajuste de fase diário dos ritmos circadianos ao ambiente.

c) O sagüi como modelo experimental

O sagüi (Callithrix jacchus) é um pequeno primata neotropical encontrado no

nordeste do Brasil. Por ter boa adaptação às condições de cativeiro e laboratoriais é muito usado em pesquisas biomédicas (Abbott et al. 2003). Em ambiente natural vive

em grupos sociais compostos de 3 a 15 animais (Stevenson & Rylands 1988).

É um animal estritamente diurno, com os padrões de atividade variando intra e inter-individualmente. Geralmente, apresenta um perfil bimodal na atividade motora diária (Erkert 1989; Menezes, Moreira, Azevedo, Costa, Castro 1993; Moreira et al.

1991). Sob condições ambientais constantes exibe ritmos circadianos de atividade motora estáveis (Erkert 1989; Glass et al. 2001), com o período endógeno em torno de

23,3 ± 0,4 h (Erkert 1989; Glass et al. 2001; Silva et al. 2005). O ritmo circadiano de

atividade ressincroniza mais rapidamente a atrasos de fase do que a avanços de fase no ciclo CE (Erkert 1989).

Nesta espécie, fatores sociais, como nascimentos de filhotes, estado reprodutivo da fêmea, status social e tamanho do grupo, influenciam o ritmo circadiano de catação (Azevedo et al. 2001), comportamento de extrema importância social por favorecer o

estabelecimento, manutenção e fortalecimento dos laços afiliativos entre os animais (Yamamoto 1991).

(28)

eficientes de comunicação em seu habitat natural deve ser através das vocalizações (Epple 1968; Schrader & Todt 1993). Além disso, cada vocalização tem uma função social. Por exemplo, phee e twitter, considerados “chamadas de contato”, são emitidos

com a função de manutenção de contato entre os animais do grupo, mesmo quando há uma grande distância entre eles, ou para se comunicarem com outros grupos. Tsee e tsik têm sons semelhantes, porém estruturas e funções diferentes. O primeiro é

vocalizado em encontros agonistas com co-específicos, enquanto o segundo é vocalizado para avisar da presença de predadores (Epple 1968). Em suma, o sinal sonoro é uma pista social muito importante para os sagüis.

Devido a essa importância social, Erkert et al. (1986) e Erkert & Schardt (1991)

avaliaram a eficácia de sinais sonoros como sincronizadores do ritmo circadiano da atividade motora de sagüis. Eles encontraram que os sinais sonoros emitidos por co-específicos são um zeitgeber fraco e que a sincronização social é dependente do grau de parentesco entre os indivíduos e da proximidade de seus períodos endógenos. Em estudo posterior foi analisado o efeito de pulsos de vocalizações de co-específicos associados à presença de um espelho. Contudo, as respostas de fase encontradas foram semelhantes às respostas de fase induzidas por pulsos de luz (Wechselberger 1994). Como os sagüis estavam sob claro constante de 430 lux, é provável que a ativação comportamental provocada pelos pulsos tenha aumentado a quantidade de luz recebida pelos sagüis e que as mudanças de fase tenham sido primariamente fóticas, ao invés de não-fóticas. Outra possibilidade é que as respostas de fase sejam decorrentes da interação do estímulo fótico com o não-fótico.

O mecanismo envolvido na ação de vocalizações de co-específicos sobre o ritmo circadiano da atividade motora de sagüis ainda não é bem compreendido, na medida em que não foi avaliado de forma sistematizada na ausência de luz. Além disso, a caracterização do efeito de estímulos não-fóticos sobre o STC em mamíferos diurnos ainda é escassa quando comparada aos noturnos, particularmente no que diz respeito à avaliação de pistas não-fóticas com significado ecológico.

(29)

(30)

2. Objetivos

Objetivo Geral

Verificar o efeito de pulsos de vocalizações de co-específicos e de escuro sobre o ritmo circadiano de atividade motora em sagüis.

Objetivos Específicos

• Comparar as respostas de fase do ritmo circadiano de atividade motora de

sagüis após:

- pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro; - pulsos de escuro.

• Avaliar o potencial sincronizador da reprodução de vocalizações de

co-específicos em escuro total sobre o ritmo circadiano de atividade motora de sagüis.

Hipóteses e Predições

H1) O efeito de estímulos não-fóticos sobre o ritmo circadiano da atividade motora é independente da natureza do estímulo.

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H2) Mudanças de fase por pulsos de escuro são mediadas por mecanismo não-fótico durante o dia subjetivo e no final da noite subjetiva, e via mecanismo imagem especular fótico no fim do dia subjetivo e início da noite subjetiva.

P2.1) As respostas de fase aos pulsos de escuro durante o dia subjetivo e no final da noite subjetiva terão características semelhantes às desencadeadas pelos pulsos de vocalizações de co-específicos.

P2.2) As respostas de fase aos pulsos de escuro no fim do dia subjetivo e no início da noite subjetiva terão características opostas às desencadeadas por pulsos de luz.

H3) Vocalizações de co-específicos sincronizam o ritmo circadiano da atividade motora de sagüis.

(32)

3. Metodologia

a) Sujeito Experimental

Foram estudados 7 sagüis (Callithrix jacchus) machos adultos entre 3 e 6 anos

de idade, sem parentesco, nascidos em cativeiro no Núcleo de Primatologia da UFRN, à exceção de Pipoca, de origem selvagem. Antes do experimento cada animal estava sob condições ambientais naturais em uma gaiola que impedia apenas o contato físico entre os animais. Cada animal foi identificado de acordo com o cadastro do Núcleo (Quadro 1).

Quadro 1: Animais observados nesse trabalho.

Nome Idade no Início do Experimento Peso Médio ± DP (gr)

BorgesC 5 anos 351 ± 21

DokoC 5 anos 451 ± 8

PipocaS 3 anos 308 ± 14

PaoloC 6 anos 367 ± 15

XerxesC 5 anos 381 ± 24

LuizC 3 anos 341 ± 11

XandoC 6 anos 301 ± 16

C _{nascido em cativeiro no Núcleo de Primatologia da UFRN,}S_selvagem.

(33)

Mês Borges Doko Pipoca Paolo Xerxes Luiz Xando abr-06

mai-06 jun-06 jul-06 ago-06 set-06 out-06 nov-06 dez-06 jan-07 fev-07 mar-07 abr-07

Figura 2: As barras cinzas representam o tempo de permanência de cada animal no experimento.

b) Condições de Manutenção

Cada sagüi foi mantido em uma gaiola de tela de arame com 76 cm de altura x 40 cm de largura x 60 cm de profundidade, equipada com comedouro, bebedouro, poleiro e toca de PVC pintada de preto no interior para evitar a entrada de luz. Foi utilizado um anteparo branco de madeira entre cada gaiola que evitava o contato visual e físico entre os animais, porém não impedia o contato auditivo e olfativo entre eles (Figuras 3 e 4).

(34)

Os animais tinham água, ração para primatas (Megazoo P-25, fabricante Vale Verde Destilaria e Parque Ecológico, Minas Gerais, Brasil) e uva-passa ad libitum. A

alimentação era fornecida duas vezes ao dia: pela manhã entre 05:30 e 11:00 h, e à tarde entre 12:00 e 19:00 h. Pela manhã os sagüis recebiam papa* e frutas da época, como banana, melancia, mamão, manga, entre outras. À tarde, a alimentação colocada pela manhã era substituída por frutas da época ou batata-doce cozida. Adicionalmente eles recebiam leite fermentado com lactobacilos vivos, goma arábica ou ovo em dias e horários aleatórios, como formas de reforço alimentar e enriquecimento ambiental.

Figura 4: Gaiolas da sala experimental em detalhe. É possível observar os sagüis separados por anteparos brancos de madeira, os comedouros, as garrafas d’água, os poleiros, as tocas de pvc, os potes de passas e um sensor de movimento por infravermelho sobre cada gaiola.

Os sagüis foram mantidos em uma sala com isolamento acústico parcial, que possibilitava a entrada de silvos longos, denominados phees, emitidos pelos

co-específicos da colônia.

(35)

A temperatura média da sala foi 26,7 ± 0,3°C e a média da umidade relativa do

ar foi 78,2 ± 6%. A renovação do ar foi feita por um exaustor ligado em dias e horários aleatórios.

Inicialmente a condição de iluminação da sala foi de claro-escuro (CE) 12:12 (~ 300:2 lux), sendo a fase de claro entre 07:00 e 19:00 h. Posteriormente, a condição de iluminação passou a ser claro constante (CC) fraco de aproximadamente 2 lux. Na fase de claro do CE, a iluminação da sala foi realizada por quatro lâmpadas fluorescentes de luz branca de 32 watts (~ 300 lux). Na fase de escuro do CE e durante o CC fraco, a iluminação foi realizada por uma pequena lâmpada incandescente de luz amarela de 7 watts (~ 2 lux).

c) Procedimentos (Figura 6) c1) Adaptação

Para adaptação às condições ambientais e às gaiolas da sala experimental, os animais ficaram entre 26 de abril e 17 de julho de 2006 (~ 83 dias) sob CE 12:12 (~ 300:2 lux), sendo a fase de claro entre 7:00 e 19:00 h. Como no cativeiro em ambiente natural, onde eles estavam, a fase de claro inicia em torno das 05:00 h e a de escuro em torno das 17:00 h, eles sofreram um atraso de fase de 2 horas ao serem transferidos para a sala experimental.

c2) Estímulos Não-Fóticos

- Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro

Após a fase de adaptação, os animais ficaram sob CC fraco de aproximadamente 2 lux até o ritmo circadiano da atividade motora (RCA) endógeno da maioria dos animais se expressar de forma estável. Então, foi aplicado um pulso de vocalizações de co-específicos em escuro total entre 7:30 h e 08:30 h (horário local), sendo esse procedimento repetido após 22 dias.

(36)

anterior à aplicação dos pulsos. Dessa forma, para a aplicação dos pulsos, o pesquisador entrava apenas na Sala 1, onde conectava os fios da caixa de som ao “notebook”, que reproduzia as vocalizações através do programa “Windows Media Player”, com intensidade de ∼ 92 decibéis.

As vocalizações foram gravadas de animais em cativeiro em ambiente natural no Núcleo de Primatologia da UFRN, entre 5:20 e 7:00 h da manhã, nos dias 04 de junho, 01, 07 e 08 de novembro de 2006. As gravações foram feitas através de um microfone (Electret Condenser Telescopic Microphone V-6502, fabricante Saul Mineroff Electronics, NY, USA) conectado a um gravador Tascan DA-P1 DAT (fabricante TEAC Corporation, Tokyo, Japão). A gravação era composta por phee, twitter, peep de animais adultos e tsik de adultos e filhotes (Epple 1968), que eram

reproduzidos aleatoriamente com o objetivo de evitar habituação à seqüência da reprodução. Os animais da sala experimental vocalizavam freqüentemente durante a reprodução das vocalizações, principalmente após a reprodução de phee.

- Pulsos de Escuro

Após a etapa dos pulsos de vocalizações de co-específicos, foram aplicados dois pulsos de escuro entre 07:30 h e 08:30 h (horário local), com intervalo de 14 dias entre eles. Para excluir a influência da presença do pesquisador nas respostas aos pulsos, o timer era ajustado no dia anterior à aplicação dos pulsos.

- Reprodução de vocalizações de co-específicos em escuro diariamente

Com o objetivo de sincronizar o ritmo circadiano da atividade motora dos sagüis foram aplicados pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro total entre 19:00 h e 20:00 h, por 5 dias consecutivos. Após 21 dias o procedimento foi repetido durante 30 dias consecutivos. Os pulsos diários foram executados da mesma forma que os pulsos isolados descritos anteriormente.

(37)

Fio Mesa

Luiz Borges Doko Pipoca Paolo

Sala Experimental

Sala 2

Sala 1

Xerxes

PC G7

CS

Figura 5: Diagrama das salas onde foi realizado o experimento. Como o exaustor de ar ficava na Sala 2, a porta entre esta sala e a sala experimental era mantida aberta, enquanto as outras portas eram mantidas fechadas. A gaiola 7 ficou vazia durante todo o experimento. Durante o tempo em que ficou no experimento, Xando permaneceu na gaiola que foi ocupada posteriormente por Doko. (PC – computador; CS – caixa de som; EX – exaustor de ar; G7 – gaiola 7).

d) Método de coleta de dados

A atividade motora dos sagüis foi registrada continuamente através de sensores de movimento por infravermelho sobre as gaiolas (Figuras 3 e 4), conectados a um computador através de uma placa de aquisição de dados da National Instruments (NI PCI – 6025E). Os dados foram totalizados e registrados em intervalos de 5 minutos

pelo software Aschoff (desenvolvido pelo Laboratório de Cronobiologia – UFRN).

(38)

CE 12:12 (07:00 às 19:00 h) – 83 dias ↓

CC fraco – 137 dias ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 07:30 h (02/12/06) ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 07:30 h (25/12/06) ↓

1h Pulso de escuro às 07:30 h (14/01/07) ↓

1h Pulso de escuro às 07:30 h (29/01/07) ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 19:00 h – 5 dias (13 a 17/02/07) ↓

1h vocalização de co-específico + escuro às 19:00 h – 30 dias (11/03 a 09/04/07) ↓

CC fraco – 17 dias

Figura 6: Esquema das condições a que os sagüis foram expostos com a data e a duração de cada fase. A duração total do experimento foi 366 dias.

e) Análise dos dados

O ritmo circadiano da atividade motora (RCA) de cada sagüi foi analisado através de inspeção visual dos actogramas, do cálculo do período endógeno (τ) e da

duração da fase ativa (α) por décadas*, nas condições de iluminação de CE e CC fraco

ao longo de todo o experimento. Por meio do programa El Temps (Díez-Noguera,

Barcelona, Espanha) foram construídos os actogramas, calculado o α e calculado o _τG

utilizando o periodograma Lomb-Scargle.

(39)

dias em que a fase ativa dos animais da sala experimental coincidiam com o horário entre o nascer do sol e 08:00 h do ambiente externo e os dias em que não coincidiam. Esta análise abrangeu os dados do primeiro dia de CC até o dia imediatamente anterior ao início da etapa de aplicação diária de pulsos de vocalização.

Para a análise das respostas de fase após os pulsos foram estimados os horários do início da atividade no dia seguinte a cada pulso, pela regressão linear com o método dos quadrados mínimos utilizando o início da atividade dos 7 dias anteriores e do segundo ao sétimo dia posterior ao pulso. As respostas de fase foram determinadas pela diferença entre o início da atividade estimado com base nos 7 dias anteriores ao pulso e o início da atividade calculado com base no segundo ao sétimo dia posterior ao pulso. Para essa análise, como início da atividade foi considerado o primeiro intervalo de 15 minutos com valor superior ou igual a 10% da média horária diária, que se mantinha por um mínimo de 30 minutos dentro de 1 hora (critério adaptado a partir de Glass et al. 2001).

As horas circadianas (HCs) atingidas pelos pulsos foram definidas com base no

τ definido pelo periodograma Lomb-Scargle a partir dos dez dias imediatamente

anteriores a cada pulso.

Para avaliar o efeito sincronizador dos pulsos aplicados entre 19:00 h e 20:00 h (horário local) diariamente, foi realizada inspeção visual dos actogramas e análise do τ

nas duas etapas de aplicações de pulsos. Na primeira etapa, durante os 5 dias de aplicação dos pulsos e nas 2 décadas anteriores e posteriores. Na segunda etapa, nas 3 décadas durante a aplicação dos pulsos e nas 2 décadas anteriores e posteriores. O Teste t para amostras dependentes foi utilizado para comparar o τ dos sagüis entre as

décadas.

(40)

4. Resultados

• Ritmo circadiano da atividade motora ao longo do experimento

Sob CE 12:12, todos os animais apresentaram o ritmo circadiano de atividade motora (RCA) com período de 24 h e duração da fase ativa (α) média de 10,7 ± 0,7 h

(Tabela 1). Durante todo o tempo sob CC fraco os animais exibiram o RCA com período endógeno (τ) médio de 23,6 ± 0,3 h e α médio de 9,4 ± 1,2 h. Os dados da

atividade motora de Xando não foram analisados por ele ter sido retirado do experimento antes das manipulações experimentais.

Tabela 1: Média e desvio padrão do período endógeno (τ) e da duração da fase ativa (α) dos sagüis durante as

condições de iluminação de claro-escuro 12:12 (∼300:2 lux) e claro constante fraco (∼2 lux).

Animal tau (CE) α (CE) α (CC)

Borges 24 9,0 ± 1,0 8,6 ± 1,2

Doko 24 9,6 ± 2,0

Pipoca 24

Paolo 24 10,1 ± 0,7 9,2 ± 0,9

Xerxes 24 11,2 ± 0,5 10,2 ± 1,0

Luiz 24 12,6 ± 0,5 9,3 ± 0,7

Todos 24 23,6 ± 0,3 10,7 ± 0,7 9,4 ± 1,2

23,4 ± 0,4 23,6 ± 0,2 23,7 ± 0,3 23,8 ± 0,4 23,9 ± 0,5 23,1 ± 0,2

tau (CC)

Ao longo do CC fraco foram observadas mudanças no τ, no α e na amplitude

(figuras 7 a 14). O τ tendeu a diminuir com o tempo. Contudo, quando a fase ativa dos

sagüis coincidiu com o horário entre o nascer do sol e 08:00 h no ambiente externo, ocorreu alongamento do τ e da duração da fase ativa (α), juntamente com aumento na

intensidade da atividade (figuras 7 e 8). O τ alongou em todos os animais (t[20] = 8,29;

p < 0,01), enquanto apenas Paolo (t[8] = 2,9; p < 0,05) e Xerxes (t[5] = 2,9; p <0,05)

alongaram o α. Algumas vezes o _τ assumiu o valor de 24 h, persistindo dessa forma

por vários dias (Tabela 1 e figuras 9, 10, 12 e 13). Somente Paolo não exibiu τ de 24 h

(41)

22,5 22,8 23,1 23,4 23,7 24,0 24,3

CE N C N C N C N C N C N C N C N C N

Relação co m a fase ativa da co lô nia

Borges

Doko

Paolo

Xerxes

Luiz

Figura 7: Período endógeno (τ) do ritmo circadiano da atividade motora em relação à coincidência (C) e não coincidência (N) da fase ativa dos sagüis em experimento com a fase ativa dos sagüis da colônia entre o nascer do sol e 08:00 h da manhã do ambiente externo durante o experimento (Periodograma Lomb-Scargle). Não foram incluídos nesse gráfico os dados da atividade dos sagüis após o início da aplicação dos pulsos diários de vocalizações de co-específicos em escuro total. CE refere-se à etapa em que os animais estavam sob claro-escuro 12:12.

6 7 8 9 10 11 12 13

CE N C N C N C N C N C N C N C N C N

Relação com a fase ativa da colônia

Borges

Doko

Paolo Xerxes

Luiz

Figura 8: Média e desvio padrão da duração da fase ativa (α) em relação à coincidência (C) e não coincidência

(42)

Para a maioria dos animais, as mudanças observadas no RCA relacionadas à coincidência ou não da fase ativa dos sagüis com o horário entre o nascer do sol e 08:00 h no ambiente externo, tenderam a diminuir ao longo do CC fraco (figuras 9 a 12). A única exceção foi Luiz, cujas mudanças tenderam a ser mais evidentes com o decorrer do tempo de manutenção em CC fraco (figura 13).

Pipoca apresentou o RCA diferente de todos durante o CC fraco (figura 14). Do primeiro dia sob a condição de iluminação constante até 08 de agosto, expressou o RCA em livre-curso de forma estável com τ médio de 23,1 ± 0,5 h. A partir de 09 de

agosto, o τ alongou assumindo o valor médio de 23,9 ± 0,2 h, ou seja, próximo a 24 h.

Depois de 04 de dezembro o τ alongou mais ainda, passando a ser maior que 24 h

(24,3 ± 0,6 h). Além dessas mudanças no período, ocorreram mudanças na intensidade da atividade, que reduziu entre 09 de agosto e 20 de outubro. Em seguida, a intensidade da atividade aumentou juntamente com o α, o que impossibilitou a

determinação dos horários de início e fim de sua atividade, necessários para a análise de dados. Por esse motivo e pelo fato de Pipoca apresentar sintomas da SEP, seus dados foram excluídos das análises das respostas aos pulsos de vocalizações associadas ao escuro e da variação do α e do _τ ao longo do experimento.

(43)

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Hora do Dia

6/jul 13/jul 20/jul 27/jul 3/ago 10/ago 17/ago 24/ago 31/ago 7/set 14/set 21/set 28/set 5/out 12/out 19/out 26/out 2/nov 9/nov 16/nov 23/nov 30/nov 7/dez 14/dez 21/dez 28/dez 4/jan 11/jan 18/jan 25/jan 1/fev 8/fev 15/fev 22/fev 1/mar 8/mar 15/mar 22/mar 29/mar 5/abr 12/abr 19/abr 26/abr Da ta

Figura 9: Actograma da intensidade da atividade motora de Borges ao longo do experimento. As barras cinzas representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinzas marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 9 (Vocalizações)

HC 2 (Escuro)

HC 8

5 dias de Vocalizações

(44)

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Hora do Dia

Figura 10: Actograma da intensidade da atividade motora de Doko ao longo do experimento. As barras cinzas representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinzas marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia.Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 11 (Escuro)

HC 10 (Escuro)

(45)

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Hora do Dia

Figura 11: Actograma da intensidade da atividade motora de Paolo ao longo do experimento. As barras cinzas representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinzas marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 14 (Escuro)

HC 8 (Escuro)

(46)

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Hora do Dia

Figura 12: Actograma da intensidade da atividade motora de Xerxes ao longo do experimento. As barras cinzas representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinzas marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 19 (Escuro) HC 10 (Vocalizações)

HC 10 (Escuro)

(47)

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Hora do Dia

Figura 13: Actograma da intensidade da atividade motora de Luiz ao longo do experimento. As barras cinza representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinza marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12, 13 a 17/02 e 11/03 a 09/04 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total; nos dias 14 e 29/01 representam os pulsos de 1h de escuro total. À direita do actograma estão as HCs atingidas pelos pulsos. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

HC 18 (Escuro)

HC 3 (Escuro) HC 9 (Vocalizações) HC 23 (Vocalizações)

(48)

LD

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Hora do Dia

Figura 14: Actograma da intensidade da atividade motora de Pipoca ao longo do experimento. As barras cinza representam a etapa de CE (12:12). As linhas cinza marcam os horários do nascer e por do sol durante o experimento (Fonte: aa.usno.navy.mil/data/docs/RS_OneYear.html). As barras vermelhas nos dias 02 e 25/12 representam os pulsos de 1 h de vocalizações associadas ao escuro total. À direita do actograma está apenas a HC atingida pelo pulso aplicado em 02/12, pois não foi possível determinar a HC atingida pelo pulso em 25/12. As barras azuis representam as faltas de energia. Os dados estão totalizados em intervalos de 5 min.

(49)

• Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro

Todas as mudanças de fase com os respectivos níveis de significância estão descritos na Tabela 2. Apenas as médias e o desvio padrão das mudanças de fase estatisticamente significativas (p ≤ 0,05) estão representadas na figura 15.

Observam-se atrasos de faObservam-se quando os pulsos incidem nas HCs 1 (-53 min) e 10 (-93 min) e a predominância de avanços de fase quando os pulsos incidem nas HCs 9 (+11 ± 17 min) e 15 (+44 ± 67 min).

Os animais estiveram ativos sempre que os pulsos incidiram no final da noite subjetiva (HC 23), no início do dia subjetivo (HC 1), e algumas vezes no final do dia subjetivo (HCs 9 e 10) (figuras 9, 12 e 13). Por outro lado, permaneceram em repouso sempre que os pulsos incidiram no meio da noite subjetiva (HC 15) (figuras 9 e 11).

Embora a mudança de fase de Luiz após o primeiro pulso tenha sido estatisticamente significativa, não foi colocada na CRF devido à ocorrência de falta de energia, por aproximadamente 45 minutos, dois dias após o pulso (Tabela 2 e figura 13). Essa falta de energia aconteceu durante a fase ativa do mesmo, agindo como pulso de escuro. Como na análise das respostas de fase foram utilizados os 7 dias antes e os 7 dias depois dos pulsos, então a resposta obtida pode ter sofrido a influência do pulso de vocalizações sob escuro previsto no experimento e do pulso de escuro em decorrência da falta de energia. Não foram evidenciadas mudanças de fase na atividade dos outros animais em decorrência do pulso de escuro ocasionado por essa falta de energia que aconteceu durante a fase de repouso (figuras 9 a 12).

Ocorreu outra falta de energia, por aproximadamente 25 minutos, dois dias após a aplicação do segundo pulso. Contudo não foram evidenciadas mudanças de fase em decorrência desse pulso de escuro no RCA de nenhum animal, que aconteceu durante a fase de repouso (figuras 9 a 13).

Devido ao RCA de Doko não estar em livre-curso quando os pulsos foram aplicados e suas respostas de fase não terem sido estatisticamente significativas (p ≥

(50)

Tabela 2: Respostas de fase do início da atividade dos sagüis após os pulsos de vocalizações de co-específicos associadas ao escuro total. Níveis de significância para a estimativa do início da atividade no dia seguinte à aplicação do pulso calculados pela regressão linear com o método dos quadrados mínimos a partir do início da atividade 1-7 dias antes e 2-7 dias depois do pulso. Os níveis de significância estatisticamente significativos (p ≤

0,05) estão em vermelho.

Animal HC Resposta (min) p (1-7 dias antes) p (2-7 dias depois) HC Resposta (min) p (1-7 dias antes) p (2-7 dias depois)

Borges 9 +23 0,000 0,000 15 +16 0,002 0,014

Doko 9 +1 0,661 0,005 9 -1 0,204 0,072

Pipoca 8 -36,25 0,381 0,050

Paolo 15 +121 0,011 0,000 15 -4 0,000 0,000

Xerxes 10 -95,31 0,001 0,004 1 -54 0,001 0,000

Luiz 23 +20 0,000 0,001 9 -1 0,000 0,000

Respostas de Fase do Início da Atividade após os Pulsos de Som Associados ao Escuro Pulso Aplicado em 02/12/2006 Pulso Aplicado em 25/12/2006

Tabela 3: Respostas de fase do início da atividade dos sagüis após os pulsos de escuro total. Níveis de significância para a estimativa do início da atividade no dia seguinte à aplicação do pulso calculados pela regressão linear com o método dos quadrados mínimos a partir do início da atividade 1-7 dias antes e 2-7 dias depois do pulso. Os níveis de significância estatisticamente significativos (p ≤ 0,05) estão em vermelho.

Animal HC Resposta (min) p (1-7 dias antes) p (2-7 dias depois) HC Resposta (min) p (1-7 dias antes) p (2-7 dias depois)

Borges 2 -5 0,000 0,000 8 -3 0,000 0,000

Doko 11 +3 0,105 0,151 10 -14 0,765 0,065

Paolo 14 -3 0,000 0,001 8 +36 0,000 0,001

Xerxes 19 +38 0,000 0,000 10 +15 0,000 0,000

Luiz 18 -74 0,001 0,015 3 -72 0,000 0,027

(51)

-120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Hora Circadiana (HC)

Mi

n

u

to

s

Figura 15: Curva de resposta dependente da fase do início da atividade de sagüis após pulsos de 1h de vocalizações de co-específicos em escuro total. Hora circadiana 0 h (HC 0) corresponde ao início da atividade e as 24 h circadianas representam o período circadiano. Foram apresentadas apenas as mudanças de fase estatisticamente significativas obtidas através da regressão linear com o método dos quadrados mínimos (p ≤

0,05).

-120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Hora Circadiana (HC)

M

inut

o

s

(52)

• Pulsos de Escuro

Todas as mudanças de fase com os respectivos níveis de significância estão descritos na Tabela 3. Apenas as médias e o desvio padrão das mudanças de fase estatisticamente significativas (p ≤ 0,05) estão representados na figura 16.

Observam-se atrasos de faObservam-se quando os pulsos incidem nas HCs 2 (-5 min), 3 (-72 min) e 18 (-74 min), predominância de avanços de fase nas HCs 8 (+16 ± 28 min), 10 (+15 min) e 19 (+38 min), e ausência de mudança na HC 14.

Ocorreu atividade durante os pulsos no início do dia subjetivo (HCs 2 e 3) (figuras 9 e 13), na maioria dos pulsos no final do dia subjetivo (HCs 8, 10 e 11) e apenas em uma HC no meio da noite subjetiva (HC 18) (figuras 9 a 13). Por outro lado, os animais permaneceram em repouso durante os pulsos nas HCs 14 e 19 (figuras 11 e 12).

• Pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro durante 5 dias

Nenhum animal apresentou uma relação de fase estável entre o RCA e os pulsos de vocalizações de co-específicos em escuro aplicados diariamente entre 19:00 h e 20:00 h, durante 5 dias. O τ do RCA dos sagüis variou antes, durante e depois dos 5 dias de

pulsos (Figura 17). Durante os pulsos, dois animais alongaram o τ, dois animais

encurtaram o τ, e um exibiu o mesmo τ da década anterior aos 5 dias dos pulsos. Ou

seja, não houve um padrão nas mudanças do τ devido aos pulsos. Além disso, não

houve diferença no τ entre os 5 dias de pulso e as 2 décadas anteriores (Década 1

anterior: t[5] = 0,19, p > 0,05; Década 2 anterior: t[5] = -0,51, p > 0,05) e posteriores

(Década 1 posterior: t[5] = 0,09, p > 0,05; Década 2 posterior: t[5] = -0,2, p > 0,05).

(53)

22,5 23 23,5 24 24,5

1A 2A 5 DIAS 1P 2P

Década

Borges Doko Paolo Xerxes Luiz

Figura 17: Período endógeno do ritmo circadiano da atividade motora dos sagüis nas 2 décadas anteriores e posteriores, e durante os 5 dias de aplicação dos pulsos de vocalizações sob escuro total entre 19:00 h e 20:00 h (representado pela barra cinza). (A= anterior, P = posterior)

Figura 18: Período endógeno do ritmo circadiano da atividade motora dos sagüis 2 décadas antes e depois, e nas 3 décadas de aplicação dos pulsos de vocalizações sob escuro total entre 19:00 h e 20:00 h (representado pela barra cinza). Os asteriscos estão marcando as diferenças estatisticamente significativas obtidas através do teste t

para amostras dependentes. (A = anterior, D = durante, P = posterior)

* Entre 2A e D1– t[5] = 4,2; p< 0,05.

** Entre D1 e 1P – t[5] = -3,6; p< 0,05.

*** Entre D1 e 2P – t[5] = -5,8; p< 0,05.

22,5 23 23,5 24 24,5

1A 2A D1 D2 D3 1P 2P

Década

P

er

íodo (

h

Borges Doko Paolo Xerxes Luiz

* _***