Objetivos específicos

1- Isolar e selecionar bactérias, a partir de lodo de um reator anaeróbio alimentado com bagaço de cana hidrolisado, com a capacidade de usar a xilose e arabinose em processo fermentativo.

2- Caracterizar e identificar os isolados de acordo com suas características bioquímicas e moleculares.

3- Avaliar o consumo dos açúcares xilose, arabinose e glicose, e da geração de hidrogênio e de outros produtos de fermentação, para os isolados selecionados. 4- Avaliar o efeito do uso do hidrolisado lignocelulósico no consumo dos açúcares e na

geração de produtos de fermentação, com ênfase na produção de biohidrogênio, para os isolados selecionados.

5- Avaliar o efeito dos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico no consumo dos substratos e produção de hidrogênio para os isolados selecionados.

6- Avaliar o uso de carvão ativado e MIP como adsorventes em ensaios de fermentação do hidrolisado para produção de hidrogênio.

CAPITULO V 5. METODOLOGIA

A metodologia geral encontra-se descrita e resumida no fluxograma apresentado na Figura 10.

5. 1. Obtenção e seleção das culturas bacterianas 5.1.1. Isolamento das bactérias

O isolamento das bactérias foi feito a partir de amostras retiradas de um reator anaeróbio do tipo batelada, alimentado com hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar a 10%. Esta amostra foi gentilmente cedida pelo Prof. Sérgio Aquino do Laboratório de Química Tecnológica e Ambiental da UFOP. O hidrolisado que foi usado para alimentar o reator foi produzido por auto-hidrólise, considerando os seguintes parâmetros: temperatura de 185ºC por 35 minutos e uma relação sólido líquido (g/mL) de 1:6.0, com o objetivo de favorecer a liberação dos açúcares da hemicelulose (xilose, arabinose e glicose). A análise química do hidrolisado por HPLC encontra-se na Tabela 5 (BAÊTA, 2014).

Tabela 5.Composição do hidrolisado de bagaço-de-cana submetido a auto-hidrólise

Composto mg/L

Gl Xi Ar HF AcOH HMF FF

2,98 153,55 69,56 67,85 55,66 1,36 29,65

Gl-glicose; Xi-xilose; Ar-arabinose; HF-ácido fórmico; HAc-ácido acético; HMF-hidroximetilfurfural, FF furfural

O isolamento das bactérias foi realizado a partir de 1 mL de amostra de lodo do reator submetida a diluição seriada em solução salina (0,9% NaCl) até o fator 10-5_{. As duas últimas}

diluições foram cultivadas em três meios de cultura sólidos, a saber: PYG (Peptona 20g/L, extrato de levedura 10g/L, Glicose 20g/L), PYX (Peptona 20g/L, extrato de levedura 10g/L, Xilose 20g/L) e EMB (Eosina azul de metileno). O cultivo foi feito por plaqueamento em superfície e inoculado em aerobiose a 36±1o_{C, por 24 horas. Após deste período foi}

observado o crescimento de diversas colônias, as mesmas foram caracterizadas em quanto a tipo de cor e borda e um representante de cada morfotipo foi inoculado em nova placa de Petri. As placas foram incubadas nas mesmas condições descritas anteriormente.

5.1.2. Caracterização morfológica e bioquímica dos isolados

Os diferentes morfotipos foram caraterizados pela técnica de coloração de Gram e as lâminas obtidas foram visualizadas no microscópio óptico para caracterização da forma bacteriana. A caracterização bioquímica dos isolados foi feita utilizando os seguintes testes: produção de H2S, motilidade, produção de indol, vermelho de metila (VM), Voges-Proskauer

(VP), citrato, hidrólise de ureia, consumo de açúcares (glicose e lactose), produção de gás e ágar triplo açúcar e ferro (TSI) de acordo com os protocolos da American Society For Microbiology (2014). O objetivo da aplicação dos testes bioquímicos foi de agrupar isolados bacterianos definindo representantes de um grupo morfo-fisiológico similar.

5.1.3. Identificação dos isolados bacterianos pelo sequenciamento do DNAr 16S

A extração do DNA genômico foi feita segundo Cheng e Jiang (2006), 1 mL das células em suspensão foi centrifugado a 8.000g por 2 minutos; o sobrenadante foi removido e as células lavadas com 400 µL de tampão STE (100 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) e centrifugadas a 8.000g por 2 minutos; o pellet foi ressuspendido em 200 µl de tampão TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0); adicionou-se 100 µL de fenol saturado em Tris (10 mM) e a mistura foi agitada por 60 segundos e centrifugada a 13.000g por 5 minutos a 4o_{C; transferiu-se 160 µL da fase aquosa para um novo tubo acrescido de 40}

µL de tampão TE e 100 µL de clorofórmio; centrifugou-se a 13.000g por 5 minutos a 4o_C;

repetiu-se a transferência da fase aquosa e adição de TE e clorofórmio como descrito anteriormente até que não houvesse mais uma interface branca.

Após a extração do DNA, o gene DNAr 16S foi amplificado, com os iniciadores Epsilon 10 (5´-GAGASTTGATCMTGGCTCAG-3´) e 1541R (5’-AAGGAGGTGATC CAGCC-3’) para o domínio Bacteria. A mistura de PCR continha: 2,5 µl de Tampão (1X), 2,0 µl de MgCl2 (2,0 mM),1,25 µL de cada iniciador (0,5 pmol/µL), 0,5 µl de dNTP (0,2

mM), 0,125 µL de Taq polimerase (1,25 u/µL fermentas) e 2,0 µL de DNA e água para um volume final de 25 µL.

a 72o_{C; e uma extensão final de 10 minutos a 72}o_{C. As amostras amplificadas foram}

visualizadas em gel de agarose a 1%.

Os amplicons foram purificados em gel de agarose de acordo com o seguinte protocolo (AITKEN; RAGUZ; ANTONIOU, 1998): a banda com DNA foi cortada e colocada em um microtubo em banho-maria a 65ºC até derreter a agarose. Colocou-se a mesma quantidade de fenol. O microtubo foi agitado e centrifugado por 10 minutos a 12.470g. A fase aquosa foi transferida para outro tubo, adicionou-se o mesmo volume de fenol/clorofórmio. Agitou-se e centrifugou-se a 12.470g por 10 minutos e a fase aquosa foi transferida para outro tubo. Mediu-se o volume novamente e adicionou-se 1/10 desse volume de acetato de sódio 3M pH 5,5. Adicionou-se o dobro do volume medido anteriormente de etanol 100%. Agitou-se e centrifugou-se a 12470g durante 15 minutos. O etanol foi removido e foram adicionados 500 µL de etanol 70%, a seguir, centrifugou-se por 2 minutos na velocidade máxima e descartou-se todo o etanol. Deixou-se os microtubos secarem ao ar, e ressuspendeu-se o pellet em 20 µL de água destilada. As amostras foram enviadas para sequenciamento na empresa Genomic Engenharia Molecular Ltda. e os resultados obtidos foram analisados no programa Ribosomal Database Program (RDP, Release 8.1), segundo Wang e colaboradores (2007).

5.1.4. Ensaio inicial para screening dos isolados com capacidade de fermentar xilose e arabinose

O meio mínimo mineral utilizado nos ensaios continha por litro: 3.4g de K2HPO4,

1.3g de KH2PO4, 2.0g de (NH4)2SO4, 0.005g de FeSO4.7H2O, 0.2g de MgSO4.7H2O, 0.02g

de CaCl2.2H2O, 0.25g de NaHCO3 e 1g de extrato de levedura com pH ajustado para 6,5.

Em todos os ensaios foi feito um pré-inóculo, o cultivo foi realizado em tubos de ensaio fechados contendo 4,75 mL de meio mínimo mineral líquido e enriquecido com 1 g/L da fonte de carbono (xilose, glicose ou arabinose). Os tubos foram incubados sob agitação a 170 rpm por 18-24 horas a 36±1o_{C. Mediu-se a densidade óptica (DO}

550nm) para cada cultura

Para os ensaios de fermentação, foram utilizados frascos lacrados de 50 mL com um volume de trabalho de 30 mL de meio mínimo mineral estéril e atmosfera anaeróbia (purgado com N2). Inoculou-se 100 µL do pré-inóculo e 1 g/L da fonte de carbono. Os frascos foram

incubados sob agitação a 170 rpm e 36±1o_{C. O crescimento foi avaliado pela medida da}

DO550nm de 1 mL da cultura. Adicionalmente, retirou-se uma alíquota de 1 mL da cultura

para avaliação do consumo de substratos e quantificação dos produtos de fermentação (metodologia descrita no item 3.2).

5.2. Métodos analíticos para análise dos substratos e produtos da fermentação