UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
BIOPROSPECÇÃO BACTERIANA PARA PRODUÇÃO DE BIO-HIDROGÊNIO A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO E AVALIAÇÃO DO
PROCESSO FERMENTATIVO
IVON MARITZA CAMPOS RINCON
OURO PRETO, MG 2018
BIOPROSPECÇÃO BACTERIANA PARA PRODUÇÃO DE BIO-HIDROGÊNIO A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO E AVALIAÇÃO DO
PROCESSO FERMENTATIVO
IVON MARITZA CAMPOS RINCON
Orientadora: Dra. Silvana De Queiroz Silva
Ouro Preto, MG 2018
Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.
C150b Campos, Ivon Maritza.
Bioprospecção bacteriana para produção de bio-hidrogênio a partir de hidrolisado hemicelulósico e avaliação do processo fermentativo [manuscrito] / Ivon Maritza Campos. - 2018.
127f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientadora: Profª. Drª. Silvana de Queiroz.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Área de Concentração: Biotecnologia Industrial.
1. Fermentação . 2. Hidrogênio. 3. Hidrolise. I. Queiroz, Silvana de. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Titulo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha família pelo amor, apoio incondicional nos momentos difíceis e na distância e por sempre acreditar e sentir-se orgulhosos de mim.
Aos melhores presentes que Ouro Preto me deu, meus amigos Lina, Christ, Yesser e German obrigada pela amizade e por tudo o tempo compartilhado, pelos jantares, almoços no RU, pelas risadas, pela amizade em todo esse tempo e por permitir-me conhecer um pouco mais de outras culturas. Às minhas amigas brasileiras Emília e Giana pelos bons momentos compartilhados e a Camila e Tales pelas conversas, cafés e desabafos.
Ao Zé Zorel, sou grata porque você foi uma pessoa que ajudou demais em todo o processo, nos ensaios, nas dúvidas, no transporte e sem sua ajuda o caminho teria sido mais difícil.
À todos meus colegas do laboratório LBTM, Leticia e Erica pela simpatia o boa convivência no laboratório, a Flaviane pelas noites que passou medindo o gás no galpão, a Marilinha e Isabela pela ajuda oferecida sempre que foi possível.
Agradeço aos meus colegas do laboratório LQTA, Diego, Aline e Oscar, obrigada pela ajuda oferecida.
A minha orientadora Silvana, obrigada pela oportunidade, pela sua disponibilidade e apoio na elaboração deste trabalho.
Enfim, quero demonstrar o meu agradecimento a todos aqueles que, de um modo ou de outro, estiveram do meu lado neste caminho e tornaram possível a realização da presente tese.
RESUMO
A substituição das energias baseadas no petróleo por outras fontes energéticas mais ambientalmente amigáveis é uma ideia que ganha mais força a cada dia. Os resíduos da atividade agrícola e florestal são considerados matéria-prima renovável, de baixo custo e abundante, principalmente, considerando que o Brasil é um grande produtor de cana-de-açúcar. No contexto da biorrefinaria, a partir dos resíduos desta atividade agrícola podem ser produzidos vários biocombustíveis implicando no uso eficaz dos recursos e dos produtos gerados. Desse modo, este trabalho buscou isolar e selecionar linhagens bacterianas capazes de produzir bio-hidrogênio a partir da fermentação de açúcares hemicelulósicos. O processo fermentativo foi investigado utilizando substratos sintéticos e um hidrolisado lignocelulósico real. Dentre vários isolados, duas culturas se destacaram quanto à utilização dos açúcares, Enterobacter sp (isolado 2) e Raoultella sp (isolado 11). As melhores conversões na produção de bio-hidrogênio foram obtidas a partir da fermentação de 11 g/L de xilose com valores de 1,17 e 1,74 mmol H2/mmol substrato, respectivamente para Raoultella sp e
Enterobacter sp, tendo o ácido acético como principal subproduto desta fermentação. Os valores das conversões diminuíram para 0,4 e 0,3 mmol H2/mmol substrato, para o isolado 2
e 11 respectivamente, quando utilizado o hidrolisado hemicelulósico real diluído. Para investigar a toxicidade do hidrolisado, inibidores foram adicionados na fermentação e para ambos os isolados, a adição de ácido acético afetou negativamente a conversão e a produção de H2. Dois métodos de destoxificação do hidrolisado lignocelulósico foram testados, os
resultados mostraram que o uso de carvão ativado no ensaio de fermentação promoveu um aumento de 2x na produção de H2 (0,31mmol) para o isolado 2. Levando-se em consideração
todos os resultados as linhagens Enterobacter sp 2 e e Raoultella sp 11 apresentam potencial de aplicação em processos fermentativos no contexto da biorrefinaria.
ABSTRACT
The replacement petroleum-based energies with other energy sources, more environmentally friendly is an idea that gets stronger every day. Residues from agricultural and forestry activities are a good renewable, low-cost and abundant raw material, considering that Brazil is a major producer of sugarcane. In the context of biorefinery, from the residues of this agricultural activity can be produced several biofuels implying the effective use of resources and products generated. Thus, this work sought to isolate and select bacterial strains capable of producing biohydrogen from the fermentation of hemicellulosic sugars. The fermentative process was investigated using synthetic substrates and a real lignocellulosic hydrolisate. Among several isolates, two cultures were distinguished for the use of sugars, Enterobacter sp (strain 2) and Raoultella sp (strain 11). The best conversions in the production of biohydrogen were obtained from the fermentation of 11 g/L xylose with values of 1.17 and 1.74 H2/mmol substrate, respectively for Raoultella sp and Enterobacter sp, with acetic acid
as the main by-product of this fermentation. Conversion values decreased to 0.4 and 0.3 H2/mmol substrate, for strains 2 and 11 respectively, when using the diluted real
hemicellulosic hydrolysate. To investigate the toxicity of the hydrolysate, inhibitors were added in the fermentation for both strains, the addition of acetic acid adversely affected conversion and H2 production. Two methods of detoxification of the lignocellulosic
hydrolysate were tested, the results showed that the use of activated charcoal in the fermentation test promoted a 2x increase in H2 production (0.31 mmol) for strain 2. Taking
into account all results the strains Enterobacter sp 2 and Raoultella sp 11 present potential of application in fermentative processes in the context of the biorefinery.
ÍNDICE AGRADECIMENTOS ... IV RESUMO ... V ABSTRACT ... VI LISTA DE FIGURAS ... X LISTA DE TABELAS ... XIII LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... XIV CAPÍTULO I ... 1 1. REVISÃO DE LITERATURA ... 1 1.1. Biocombustíveis ... 1 1.2. Resíduos lignocelulósicos e pré-tratamentos. ... 4 1.2.1. Composição dos resíduos lignocelulósicos. ... 4 1.2.2. Pré-tratamento e inibidores ... 7 1.3. Estratégias de destoxificação do hidrolisado ... 10 1.4. Crescimento microbiano em açúcares da hemicelulose ... 13 1.5. Fermentação bacteriana ... 17 1.5.1. Via metabólica do tipo acetato-etanol ... 22 1.5.2. Via metabólica tipo butirato ... 23 1.5.3. Via metabólica tipo propionato ... 23 1.5.4. Via metabólica de ácido mista ... 24 1.5.5. Via metabólica do tipo lactato ... 24 1.6. Produção fermentativa de hidrogênio ... 25 1.6.1. Gás hidrogênio ... 25 1.6.2. Micro-organismos produtores de gás hidrogênio ... 26 1.6.3. Rotas metabólicas de produção de hidrogênio ... 28 1.7. Produtos de valor agregado ... 31 CAPITULO II ... 34 JUSTIFICATIVA ... 34 CAPITULO III ... 36 3. Hipóteses ... 36
3.1. Hipótese central ... 36 3.2. Sub- hipóteses ... 36 CAPITULO IV ... 37 4. OBJETIVOS ... 37 4.1. Objetivo geral ... 37 4.2. Objetivos específicos ... 37 CAPITULO V ... 38 5. METODOLOGIA ... 38 5. 1. Obtenção e seleção das culturas bacterianas ... 39 5.1.1. Isolamento das bactérias ... 39 5.1.2. Caracterização morfológica e bioquímica dos isolados ... 40 5.1.3. Identificação dos isolados bacterianos pelo sequenciamento do DNAr 16S ... 40 5.1.4. Ensaio inicial para screening dos isolados com capacidade de fermentar xilose e arabinose ... 41 5.2. Métodos analíticos para análise dos substratos e produtos da fermentação ... 42 5.2.1. Teor de ácidos orgânicos e açúcares ... 42 5.2.2. Quantificação do hidrogênio no biogás ... 42 5.2.3. Análise da cinética ... 43 5.3. Avaliação do processo fermentativo e produção de hidrogênio de ensaios em batelada ... 43 5.3.1. Fermentação dos açúcares adicionados isoladamente e em mistura, pelas culturas selecionadas ... 43 5.3.2. Ensaios de fermentação com hidrolisado sintético, na presença e ausência de inibidores, e hidrolisado hemicelulósico. ... 44 5.3.3. Ensaios de destoxificação do hidrolisado com carvão ativado, MIPs e ajuste do pH para a produção de hidrogênio. ... 45 CAPÍTULO VI ... 47 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 47 6.1. Caracterização e seleção das culturas bacterianas ... 47 6.2. Estudo comparativo dos substratos glicose, xilose e arabinose no processo fermentativo e determinação dos parâmetros cinéticos da produção de hidrogênio para as culturas selecionadas. ... 56 6.3. Influência da concentração do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana (HH) em comparação ao hidrolisado sintético (HS) no crescimento microbiano, na produção de H2 e nos produtos da fermentação. ... 64 6.4. Efeito dos compostos inibitórios presentes no hidrolisado sobre o crescimento bacteriano, produção de hidrogênio e produtos da fermentação ... 72
6.5. Avaliação do ajuste do pH do hidrolisado hemicelulósico para a produção de hidrogênio por Enterobacter sp. ... 79 6.6. Avaliação do uso de adsorventes no processo fermentativo por Enterobacter sp a partir de hidrolisado hemicelulósico. ... 83 6.7. Ensaios de destoxificação do hidrolisado usando polímeros molecularmente impressos (MIPs) em ensaios de fermentação por Enterobacter sp. ... 90 7. CONCLUSÕES ... 95 8. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 96 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 97 ANEXO 1 ... 111 ANEXO 2 ... 112
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.INTEGRAÇÃO DA FERMENTAÇÃO DE DIVERSOS RESÍDUOS NA BIORREFINARIA.FONTE:ADAPTADO DE
BASTIDAS-OYANEDEL ET AL.,(2015). ... 2
FIGURA 2.PRINCIPAIS COMPONENTES E ESTRUTURA DA LIGNOCELULÓSE (LIGNINA, CELULOSE E HEMICELULOSE).
FONTE:ADAPTADO DE ISIKGOR;BECER,(2015). ... 5
FIGURA 3.ESTRUTURA DA LIGNINA.(A)MONOLIGNÓIS PRESENTES NA LIGNINA,(B)ESTRUTURA DA LIGNINA COM Β-O-4 LIGAÇÕES DE ÉTERES AROMÁTICOS. FONTE: ADAPTADO DE PICART; DE MARÍA;
SCHALLMEY,(2015) ... 6 FIGURA 4.COMPOSTOS INIBITÓRIOS GERADOS NO PRÉ-TRATAMENTO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA.FONTE:
ADAPTADO DE IBRAHEEM;NDIMBA,(2013). ... 8
FIGURA 5. MECANISMOS DE AÇÃO DOS DIFERENTES COMPOSTOS PRESENTES NO HIDROLISADO. FONTE:
ADAPTADO DE IBRAHEEM;NDIMBA,(2013). ... 10
FIGURA 6.FERMENTAÇÃO DE DUAS FONTES DE CARBONO (GLICOSE E XILOSE).NO MOMENTO DA EXAUSTÃO DE GLICOSE NO MEIO (PONTO DE TROCA), A RCC NA CÉLULA DIMINUI.UMA VEZ QUE A REPRESSÃO É ALIVIADA, A CÉLULA PODE MUDAR PARA CONSUMIR A XILOSE.FONTE:ADAPTADO DE SOLOPOVA ET AL.,(2014).
... 15 FIGURA 7.RESUMO DAS VIAS METABÓLICAS DA FERMENTAÇÃO ANAERÓBIA DA GLICOSE, XILOSE E ARABINOSE EM ENTEROBACTER SP.FONTE:ADAPTADO DE WANG ET AL.,(2013). ... 19
FIGURA 8. DIFERENTES PROCESSOS DE PRODUÇÃO BIOLÓGICA DE HIDROGÊNIO. FONTE: ADAPTADO DE
VENKATAMOHAN;PANDEY,(2011). ... 25 FIGURA 9.PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO VIA PIRUVATO FORMIATO LIASE (PFL).O PIRUVATO É CONVERTIDO EM ACETIL-COA E FORMIATO, O FORMIATO PODE SER CONVERTIDO EM HIDROGÊNIO E CO2, PELA FORMIATO HIDROGÊNIO LIASE QUE CONTÉM UMA HIDROGENASE ([NIFE] OU [FEFE]). ADAPTADO DE GOYAL;
KUMAR;GAYEN,(2013). ... 29 FIGURA 10. FLUXOGRAMA DAS ETAPAS METODOLÓGICAS REALIZADAS NESTE ESTUDO. HS: HIDROLISADO SINTÉTICO,HH: HIDROLISADO HEMICELULÓSICO. ... 38
FIGURA 11. CONSUMO DE XILOSE E ARABINOSE APÓS 24 HORAS DE INCUBAÇÃO PARA CADA ISOLADO INVESTIGADO. ... 50
FIGURA 12.CRESCIMENTO DOS ISOLADOS NOS MEIOS ADICIONADOS COM ARABINOSE OU XILOSE, APÓS 24 HORAS DE INCUBAÇÃO. ... 50
FIGURA 13.PRODUTOS FINAIS DA FERMENTAÇÃO GERADOS POR CADA LINHAGEM NA PRESENÇA DE ARABINOSE
FIGURA 15. CONSUMO DA FONTE DE CARBONO (GLICOSE) PELAS LINHAGENS ENTEROBACTER SP (2),
ENTEROBACTER SP (4) E RAOULTELLA SP (11). ... 54
FIGURA 16. PRODUÇÃO ACUMULADA DE HIDROGÊNIO PELAS LINHAGENS (l): ENTEROBACTER SP (2), (n):
ENTEROBACTER SP (4) E ():RAOULTELLA SP (11) UTILIZANDO GLICOSE COMO ÚNICA FONTE DE CARBONO.
... 55 FIGURA 17. CURVAS DE CRESCIMENTO DE RAOULTELLA SP E ENTEROBACTER SP NA PRESENÇA DOS SUBSTRATOS: GLICOSE
(•), XILOSE (<) E ARABINOSE (5), ADICIONADOS INDIVIDUALMENTE E EM MISTURA (GXA 6) (11G/L). ... 57
FIGURA 18. CONSUMO DOS AÇÚCARES GLICOSE (•), XILOSE (<) E ARABINOSE (5), QUANDO FORAM ADICIONADOS ISOLADAMENTE AO MEIO DE FERMENTAÇÃO PELAS LINHAGENS RAOULTELLA SP (11) E ENTEROBACTER SP (2). ... 58
FIGURA 19. EVOLUÇÃO NA PRODUÇÃO ACUMULADA DE HIDROGÊNIO NAS FONTES DE CARBONO: GLICOSE (•), XILOSE (<) E ARABINOSE (5) ADICIONADOS INDIVIDUALMENTE E EM MISTURA (GXA 6) PELAS LINHAGENS RAOULTELLA SP (11) E ENTEROBACTER SP (2). ... 60
FIGURA 20. PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO DOS DIFERENTES AÇÚCARES (ARABINOSE, XILOSE, GLICOSE, MISTURA-GXA) PELAS LINHAGENS RAOULTELLA SP (11) E ENTEROBACTER SP (2). ÁC. SUCCÍNICO (l),ÁC. LÁCTICO (¨),ÁC. FÓRMICO
(), ÁC. ACÉTICO (), 2,3-BUTANODIOL, ÁC. PROPIÔNICO (u), ETANOL (n). ... 63
FIGURA 21.CURVAS DE CRESCIMENTO NO HIDROLISADO SINTÉTICO (HS) E NO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO
(HH) EM ENTEROBACTER SP (A)RAOULTELLA SP (B).HS10(l),HS20(n),HS30(),HH10(),HH20
(u),HH30(¡). ... 65 FIGURA 22. PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO NO HIDROLISADO SINTÉTICO E NO HH PARA RAOULTELLA SP. ÁC. FÓRMICO (l), ÁC. ACÉTICO (n), ÁC. PROPIÔNICO (), ÁC. ISOBUTIRICO (). ... 69
FIGURA 23.PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO NO HIDROLISADO SINTÉTICO E NO HH EM ENTEROBACTER SP.. ÁC. FÓRMICO (l), ÁC.ACÉTICO (n), ÁC.PROPIÔNICO (), ÁC.ISOBUTIRICO (). ... 71 FIGURA 24. CURVAS DE CRESCIMENTO BACTERIANO NA PRESENÇA DE INIBIDORES PELAS LINHAGENS
RAOULTELLA SP E ENTEROBACTER SP. HS10 (), HS10FF(l), HS10FA (n), HS10HAC (¡),
HS10FF/HAC/FA(u). ... 73
FIGURA 25.PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO NA PRESENÇA DE INIBIDORES EM RAOULTELLA SP E ENTEROBACTER SP. ÁC.FÓRMICO (l), ÁC.ACÉTICO (n), ÁC.PROPIÔNICO (), ÁC.ISOBUTIRICO () ... 76 FIGURA 26.MONITORAMENTO DO PH NOS ENSAIOS NA PRESENÇA DE FURFURAL (=), ÁCIDO FÓRMICO (n), ÁCIDO ACÉTICO () E O CONTROLE (). ... 77
FIGURA 27.CURVAS DE CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO EM ENTEROBACTER SP QUANDO O PH FOI AJUSTADO.HH10(l),HH20(n),HH30(o). ... 80
FIGURA 28.PRODUTOS DA FERMENTAÇÃO NO ENSAIO FEITO COM AJUSTE DE PH6.5 PELA ENTEROBACTER SP. ÁC. FÓRMICO (l), ÁC.ACÉTICO (n), ÁC.PROPIÔNICO (), ÁC.ISOBUTIRICO () ... 82
FIGURA 29. DIAGRAMA DE PARETO DO EFEITO DO CARVÃO ATIVADO, A DILUIÇÃO E O QUANTIDADE DE CÉLULAS NA PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO. ... 84
FIGURA 30. SUPERFÍCIE DE RESPOSTA APRESENTANDO A RELAÇÃO ENTRE O CARVÃO ATIVADO, A DILUIÇÃO E A PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO. ... 85
FIGURA 31.DIAGRAMA DE PARETO PARA AVALIAR O EFEITO DO CARVÃO ATIVADO E A DILUIÇÃO NO RENDIMENTO DE HIDROGÊNIO. ... 86
FIGURA 32. SUPERFÍCIE DE RESPOSTA APRESENTANDO A RELAÇÃO ENTRE O CARVÃO ATIVADO, A DILUIÇÃO NO RENDIMENTO DE HIDROGÊNIO. ... 86
FIGURA 33.DIAGRAMA DE PARETO PARA AVALIAR O EFEITO DO CARVÃO ATIVADO E A DILUIÇÃO NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO. ... 88
FIGURA 34. SUPERFÍCIE DE RESPOSTA APRESENTANDO O EFEITO DO CARVÃO ATIVADO E A DILUIÇÃO NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO. ... 88
FIGURA 35.DIAGRAMA DE PARETO PARA AVALIAR O EFEITO DO CARVÃO ATIVADO E A DILUIÇÃO NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ISOVALÉRICO. ... 89
FIGURA 36. SUPERFÍCIE DE RESPOSTA APRESENTANDO O EFEITO DO CARVÃO ATIVADO E A DILUIÇÃO NO RENDIMENTO DO ÁCIDO ISOVALÉRICO. ... 90
FIGURA 37.CURVAS DE CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO AO LONGO DO TEMPO PARA ENTEROBACTER SP.M1(¡),M2(n),M3(),M4(),M5(u). ... 91 FIGURA 38.CONCENTRAÇÃO INICIAL (2H) E FINAL (24H) DO ÁCIDO ACÉTICO. ... 93
FIGURA 39. PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO DOS EXPERIMENTOS REALIZADOS COM HIDROLISADO HEMICELULÓSICO E MIPS PARA ADSORÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO. ÁC.FÓRMICO (l), ÁC.ACÉTICO (n), ÁC. PROPIÔNICO (), ÁC.ISOBUTIRICO () ... 94
LISTA DE TABELAS
TABELA 1.MÉTODOS UTILIZADOS PARA A DESTOXIFICAÇÃO DE HIDROLISADOS LIGNOCELULÓSICOS. ... 11
TABELA 2.PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO POR DIFERENTES ESPÉCIES E DIFERENTES FONTES DE CARBONO. ... 21
TABELA 3.EQUAÇÕES ESTEQUIOMÉTRICAS NA PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO A PARTIR DA HEXOSES E PENTOSES.
... 22 TABELA 4.PREÇOS E DIMENSÃO DO MERCADO DE DIFERENTES METABOLITOS.FONTE:
BASTIDAS-OYANEDEL ET AL.,(2015). ... 31
TABELA 5.COMPOSIÇÃO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO-DE-CANA SUBMETIDO A AUTO-HIDRÓLISE ... 39
TABELA 6.CONDIÇÕES USADAS NOS ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO COMPARANDO HIDROLISADO SINTÉTICO (HS), COM E SEM INIBIDORES E HIDROLISADO HEMICELULÓSICO (HH). ... 45
TABELA 7.PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL PARA PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO A PARTIR DE HIDROLISADO E CARVÃO ATIVADO. ... 46
TABELA 8.CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS COLÔNIAS ISOLADAS A PARTIR DO LODO DE REATOR
ANAERÓBICO ALIMENTADO COM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR AO 10%. ... 47
TABELA 9.CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DOS ISOLADOS ... 48
TABELA 10.PORCENTAGEM DE IDENTIDADE ENTRE OS ISOLADOS E OS GÊNEROS DE REFERÊNCIA ... 49
TABELA 11.PRODUÇÃO (ML) E RENDIMENTO DE HIDROGÊNIO PELAS LINHAGENS ENTEROBACTER SP (2),
ENTEROBACTER SP (4) E RAOULTELLA SP (11) USANDO COMO ÚNICA FONTE DE CARBONO A GLICOSE. ... 56
TABELA 12.PARÂMETROS CINÉTICOS OBTIDOS NO MODELO MODIFICADO DE GOMPERTZ USANDO AS TRÊS FONTES DE CARBONO (ARABINOSE, XILOSE, GLICOSE, MISTURA-GXA). ... 61
TABELA 13.PARÂMETROS CINÉTICOS DA PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO OBTIDOS PELO MODELO MODIFICADO DE
GOMPERTZ COM O HIDROLISADO SINTÉTICO E HEMICELULÓSICO. ... 66
TABELA 14.CONCENTRAÇÕES (G/L) E RENDIMENTOS (MOL DE H2/MOL DE SUBSTRATO) FINAIS DOS PRODUTOS DA FERMENTAÇÃO DOS HIDROLISADOS. ... 68
TABELA 15.PARÂMETROS CINÉTICOS DA PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO OBTIDOS NO MODELO MODIFICADO DE
GOMPERTZ NO ENSAIO COM INIBIDORES. ... 74
TABELA 16.CONCENTRAÇÕES (G/L) E RENDIMENTOS FINAIS DOS PRODUTOS DA FERMENTAÇÃO NA PRESENÇA DE INIBIDORES. ... 78
TABELA 17.PARÂMETROS CINÉTICOS DA PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO OBTIDOS NO MODELO MODIFICADO DE
GOMPERTZ ... 81
TABELA 18.CONCENTRAÇÕES E RENDIMENTOS FINAIS DOS PRODUTOS DA FERMENTAÇÃO EM ENTEROBACTER SP.
... 82 TABELA 19.PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO E H2 DO ENSAIO COM CARVÃO ATIVADO. ... 84
TABELA 20.PARÂMETROS CINÉTICOS DA PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO OBTIDOS NO MODELO MODIFICADO DE
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ác. ácido
AGV ácidos graxos voláteis BUT 2,3-butanodiol
CA carvão ativado EtOH etanol
FA ácido formico
FF furfural
GXA glicose, xilose e arabinose HAc ácido acetico
HH hidrolisado hemicelulosico HMF hidroximetilfurfural
HPr ácido propionico HS hidrolisado sintetico IBu ácido isobutirico Iva ácido isovalerico
HPLC cromatografia liquida de alta resolução LAC ácido láctico
MIP polímeros molecularmente impressos P produção máxima (mmol H2)
PFL piruvato formiato liase
RCC represão catabolica do carbono Rm taxa de produção (mmol H2/hora)
λ fase lag (horas) SUC ácido succínico
CAPÍTULO I
1. REVISÃO DE LITERATURA 1.1. Biocombustíveis
Com o desenvolvimento da industrialização e o rápido aumento populacional cuja previsão para 2030 é de 8.5 bilhões, a demanda energética cresce cada vez mais, sendo os combustíveis fósseis como o carvão, gás natural e o petróleo os mais usados (DE BHOWMICK; SARMAH; SEN, 2018). Dentre os combustíveis mencionados, o petróleo tem um alto consumo mundial de 336 milhões de litros por dia. Todavia, o uso desse combustível contribui com o aumento da poluição e da emissão dos gases que provocam o efeito estufa (CO2, CH4 e CO) (ROCHA et al., 2013), e assim, estes fatores aliados à incerteza quanto à
durabilidade de suas reservas presentes na terra incentivam as pesquisas por novas fontes de energia que permitam a mudança da dependência das fontes energéticas baseados no petróleo para fontes de energia renováveis (SARATALE et al., 2008). A substituição do petróleo por outras matérias-primas para produção de combustíveis e produtos químicos é uma opção interessante que promove o desenvolvimento da biorrefinaria (OCTAVE; THOMAS, 2009). A biorrefinaria representa uma abordagem inovadora na gestão ambiental, os resíduos que muitas vezes são descartados tornam-se recursos valiosos usados na produção de bio-produtos de alto valor agregado e biocombustíveis (Figura 1)(STRAZZERA et al., 2018).
Do consumo total da energia global, apenas 13% corresponde a energia renovável, desse valor 10% trata-se de bioenergia, gerada por produtos líquidos, sólidos e gasosos derivados de matérias-primas biológicas (biomassa). Os biocombustíveis são usados para transporte (bioetanol e biodiesel), produção de eletricidade e calor (madeira, pellets), biogás (HO; NGO; GUO, 2014).
Figura 1. Integração da fermentação de diversos resíduos na biorrefinaria. Fonte: Adaptado de BASTIDAS-OYANEDEL et al., (2015).
Os biocombustíveis podem ser classificados como biocombustíveis de primeira a quarta geração, os produzidos a partir de fontes renováveis, como por exemplo cultivos de cana-de-açúcar, cereais e óleos vegetais são conhecidos como biocombustíveis de primeira geração. Quando são produzidos a partir de biomassa lignocelulósica, resíduos agrícolas, florestais e industriais são classificados como biocombustíveis de segunda geração (MOHR; RAMAN, 2013). Os combustíveis de terceira geração incluem a produção específica de biodiesel, etanol e o biogás a base de algas. A engenharia metabólica de algas para produção de biocombustível é considerada como biocombustíveis de quarta geração e tem grande potencial em fornecer energia limpa e sustentável (DUTTA; DAVEREY; LIN, 2014). Um dos inconvenientes do uso dos biocombustíveis de primeira geração, como o biodiesel e o bioetanol, é que são produzidos com matérias-primas (beterraba, milho, cana de açúcar e
plantio de alimentos para produção de combustíveis (AJANOVIC, 2011; NAIK et al., 2010). Este problema pode ser resolvido com os combustíveis de segunda geração que usam resíduos gerados na atividade agrícola e florestal, esses resíduos que na maioria das vezes são descartados no meio ambiente ou são incinerados produzindo CO2, possuem potencial
para produção de biogás, e particularmente de biohidrogênio que é uma fonte de energia limpa e renovável (FANGKUM; REUNGSANG, 2011a).
Vários métodos são usados para produção de hidrogênio tais como: eletrólise da água (4%) ou reforma de vapor de fontes não renováveis: óleo (30%), gás natural (48%) e gaseificação de carvão (18%) (GHIMIRE et al., 2015). O principal problema destes métodos é o uso de combustíveis fósseis como fonte de energia que emitem poluentes no meio ambiente (CHEN et al., 2013). Uma alternativa para uma produção mais limpa do hidrogênio é o uso de processos biológicos, como por exemplo a fermentação bacteriana, a qual consume menos energia e é mais ambientalmente amigável (URBANIEC; BAKKER, 2015).
O gás hidrogênio como biocombustível possui várias vantagens; dentre estás tem-se o fato do hidrogênionão possuir átomos de carbono, portanto, durante sua combustão há produção de água ao invés de gases que causam o efeito estufa; outra vantagem diz respeito ao CO2 gerado durante a produção do H2 o qual é liberado no sistema e pode ser facilmente
capturado; a capacidade calorífica desse gás é maior quando comparado com outros combustíveis. Na produção do gás são utilizados resíduos de baixo custo, é um processo de produção simples, sem a presença de luz e com produção contínua de hidrogênio (HU; ZHU, 2017; RITTMANN; HERWIG, 2012).
Além de ser utilizado como combustível, o hidrogênio pode ser empregado em outras áreas, como por exemplo: na produção de eletricidade em células de combustível, como líquido de refrigeração em geradores elétricos e também pode ser usado para remover quimicamente pequenas quantidades de oxigênio e prevenir a corrosão e oxidação (KUMAR; GHOSH; DAS, 2001); na indústria química, é empregado para hidrogenação na produção de hidrocarbonetos, plásticos, drogas, fertilizantes; e na indústria alimentícia, para o tratamento de óleos e gorduras (BASTIDAS-OYANEDEL et al., 2015).
1.2. Resíduos lignocelulósicos e pré-tratamentos.
1.2.1. Composição dos resíduos lignocelulósicos.
A biomassa lignocelulósica é a mais abundante e renovável no mundo, a taxa de produção dessa biomassa é de aproximadamente 200×109 toneladas/ano, e apenas 3% são
usadas em áreas não alimentares; esse tipo de matéria-prima tem vantagens sobre outras fontes de biomassa, porque as partes da planta usadas para produção de energia são a porção não comestível da planta. Os resíduos lignocelulósicos florestais, agrícolas e agroindustriais são acumulados em grandes quantidades, tendo em conta o conteúdo energético, o custo da matéria-prima lignocelulósica é muito menor (aprox. 50% menor) do que outras matérias-primas (DE BHOWMICK; SARMAH; SEN, 2018). Além da agroindústria, os resíduos lignocelulósicos constituem a maior parte dos resíduos das indústrias do papel e alimentos, sendo uma extensa fonte de biomassa lignocelulósica (REGINATTO; ANTÔNIO, 2015).
No Brasil, a agricultura desempenha um papel muito importante na economia, sendo este o país com a maior produção de cana-de-açúcar no mundo e responsável por mais da metade de todo o açúcar comercializado (CONAB, 2018). Estima-se que a produção total de cana-de-açúcar na safra 2018/19 será de 635,51 milhões de toneladas, com aumento de 0,4% em relação à safra anterior (CONAB, 2018). A indústria sucroalcooleira utiliza apenas o caldo da cana para produzir o açúcar e o etanol combustível, consequentemente, a quantidade de resíduos agroindustriais gerada anualmente é imensa, a cada 1.000 Kg de cana-de-açúcar limpa, são gerados 276 Kg de bagaço e 165 Kg de palha (NOVACANA, 2014).
A biomassa lignocelulósica derivada das diferentes fontes é composta principalmente de lignocelulose, uma mistura dos polímeros de celulose (30-45%), hemicelulose (25-30%) e lignina (25-30%) formando uma estrutura complexa (Figura 2)(PANDEY et al., 2000).
Figura 2. Principais componentes e estrutura da lignocelulóse (lignina, celulose e hemicelulose). Fonte: Adaptado de ISIKGOR; BECER, ( 2015).
A lignina é uma estrutura molecular grande, complexa, altamente ramificada que está presente nas paredes celulares das plantas, conferindo uma resistência rígida e impermeável ao ataque microbiano e ao estresse oxidativo, mecânico e osmótico. Existem três tipos de monolignóis: álcool coniferílico com um grupo aril-OCH3 (guaiacil), álcool sinapílico com
dois grupos aril-OCH3 (siringil) e álcool p-cumarílico sem grupos OCH3, que são
polimerizados e desidratados para formar fenilpropanoides, os quais estão unidos por diferentes tipos de ligações (β-ariléter, di-arilpropano, bifenilo, éter diarilico, fenilcoumarano, espirodienona e pinoresinol) (Figura 3). A composição da lignina difere
entre as plantas em relação aos tipos e quantidades de monolignóis presentes (MATHEWS; PAWLAK; GRUNDEN, 2015).
Figura 3. Estrutura da lignina. (A) Monolignóis presentes na lignina, (B) Estrutura da lignina com β-O-4 ligações de éteres aromáticos. Fonte: Adaptado de PICART; DE MARÍA; SCHALLMEY, (2015)
A celulose é um polímero linear, composto por 500-15.000 moléculas de glico-piranosilo unidas por ligações β-1,4 glicosídicas; fazendo com que sua estrutura seja plana, o que permite o empacotamento de vários filamentos de celulose em fibrilas cristalinas (SOUZA, 2013).
A hemicelulose é um heteropolissacarídeo, de estrutura aleatória e amorfa, o segundo mais abundante na parede celular vegetal. É composta por pentoses (D-xilose, L-arabinose), hexoses (D-glicose, D-galactose e D-manose), ácido acético, ácido D-glicurônico e unidades de 4-O-metil-D-glicurônico (CANILHA et al., 2012) e são classificadas de acordo com os açúcares presentes na cadeia principal do polímero: galactomananos, glicuronoxilanos, xilanos (arabinoxilanos e 4-O-metil-glucuronoxilanos), glicomananos e xiloglicanos. O
unida por uma ligação β-1,4 com pontos de ramificação (1" 2), (1"3) e (1" 6) (AGARWAL; AHLUWALIA; PANDEY, 2017).
1.2.2. Pré-tratamento e inibidores
A composição e a complexa estrutura da lignocelulose fazem que seja necessário um pré-tratamento que permita liberar os açúcares. O objetivo do pré-tratamento é alterar/eliminar restrições estruturais e composicionais para melhorar a taxa de hidrólise e aumentar os rendimentos de açúcares fermentáveis a partir da celulose (CARVALHEIRO; DUARTE; GÍRIO, 2008). O pré-tratamento pode ser mecânico (moagem), físico-químico (auto-hidrólise, vapor, fluidos supercríticos), químico (álcali, ácido, solventes orgânicos, agentes oxidantes), biológico (fungos) ou uma combinação destes (BILAL et al., 2017). No caso do bagaço de cana o pré-tratamento pode romper ou modificar a estrutura da lignocelulose e converter a celulose em moléculas de glicose e a hemicelulose em pentoses (xilose e arabinose) ou hexoses (glicose), esses açúcares ficam livres e podem ser utilizados pelas bactérias durante a fermentação sendo convertidos em outros produtos como, por exemplo, butanol, acetato e hidrogênio (CARVALHEIRO; DUARTE; GÍRIO, 2008; CHENG; TIMILSINA, 2011).
O pré-tratamento também conduz à formação de compostos tóxicos à natureza, sendo que a concentração de tais subprodutos depende da composição da matéria-prima, das condições e do tipo de pré-tratamento (QUE et al., 2011). Quando o objetivo é a fermentação dos açúcares, é preciso selecionar um método de pré-tratamento que minimize a degradação dos carboidratos e evite a formação de compostos inibidores que são tóxicos para os micro-organismos (QUE et al., 2011). Já foi demonstrado que alguns desses compostos inibidores podem interferir na função celular e na pressão osmótica e até mesmo inibir a fermentação, afetando negativamente a produção de hidrogênio (REGINATTO; ANTÔNIO, 2015). Apesar disso, o pré-tratamento é necessário, pois apenas poucos micro-organismos como, por exemplo, Clostridium thermocellum e C. saccharolyticus produzem hidrogênio a partir de material lignocelulósico não tratado. Os membros do gênero Caldicellulosiruptor são capazes de fermentar açúcares C5 e C6 da biomassa, e ainda crescem e degradam biomassa
contendo alto teor de lignina, tornando-se espécies atraentes para a produção de combustíveis e produtos químicos a partir da biomassa vegetal (CHA et al., 2013).
Os compostos inibidores presentes no hidrolisado podem ser classificados em três grupos principais (Figura 4): 1) ácidos fracos (ácido acético, ácido fórmico e ácido levulínico), derivados do furano (furfural e 5-hidroximetilfurfural); 2) compostos fenólicos: ácidos (ácido coumárico, ácido ferúlico, ácidos vanílico, ácido 4-hidroxibenzóico), álcoois (guaiacol, catecol e álcool vanilílico) e; 3) aldeídos (vanilina, aldeído siringico e 4-hidroxibenzaldeído) (LEE et al., 2015). Os ácidos fracos são gerados pela desidratação dos açúcares, o ácido acético é formado pela hidrólise de grupos acetila da hemicelulose, o ácido fórmico é um produto de degradação do furfural e do HMF, enquanto o ácido levulínico é formado pela degradação do HMF (JÖNSSON; ALRIKSSON; NILVEBRANT, 2013). Os derivados do furano (furfural e 5-hidroximetilfurfural) são produtos de desidratação de pentoses e hexoses, respectivamente, e vários compostos fenólicos são gerados pela solubilização e clivagem hidrolítica ou oxidativa da lignina (NILSSON et al., 2016).
Figura 4. Compostos inibitórios gerados no pré-tratamento da biomassa lignocelulósica. Fonte: Adaptado de IBRAHEEM; NDIMBA,(2013).
Esses compostos gerados no pré-tratamento podem afetar os micro-organismos por varias vias, por exemplo os ácidos orgânicos na forma não dissociada podem permear a membrana celular e uma vez dentro, dissociar-se para liberar o ânion e o próton, devido ao pH intracelular isto resulta numa diminuição deste pH conduz à interrupção do potencial de pH transmembrana, causando vários efeitos negativos no metabolismo, na atividade e estabilidade de enzimas e outras proteínas. Para manter o pH intracelular, a célula gera mais ATP e ativa a bomba de prótons da membrana plasmática, o que causa a depleção do ATP, tendo como efeito a inibição da utilização do substrato e redução no crescimento e proliferação celular (MILLS; SANDOVAL; GILL, 2009).
Os derivados do furano são compostos que agem inibindo enzimas das vias metabólicas centrais, como as glicolíticas e fermentativas (por exemplo, piruvato descarboxilase, acetaldeído e álcool desidrogenases) e degradam o DNA em fitas simples. Devido a sua alta hidrofobicidade, o furfural e o HMF causam rompimento da membrana e comprometem sua integridade, o que eventualmente causa redução na taxa de replicação celular e na produção de ATP. Os aldeídos são moléculas que ativam a geração de espécies reativas do oxigênio, os aldeídos furânicos também causam danos oxidativos induzidos pelas espécies reativas do oxigênio, o que leva à inibição de enzimas do metabolismo primário e, por tanto, a um aumento no tempo da fase lag, que só pode ser melhorada com o aumento da densidade do inóculo. Além disso, muitos micro-organismos reduzem ou oxidam aldeídos furânicos a álcoois para diminuir seu efeito tóxico e para fazer tal conversão são necessários os cofatores (NAD/ NADH) que podem ser esgotados, aumentando o tempo da fase Lag (WIERCKX et al., 2011).
Os mecanismos pelos quais os compostos fenólicos causam dano estão relacionados com a divisão das membranas biológicas, alteração da permeabilidade e da relação lipídeos/proteína que aumentam a fluidez da membrana celular e levam à ruptura da célula, além de comprometer a capacidade das membranas celulares de agirem como barreiras seletivas. Este dano da membrana permite a liberação de proteínas, RNAs, ATP, íons fora do citoplasma e, por conseguinte, há uma redução nos níveis de ATP que prejudica a função proteica e o transporte de nutrientes. Tanto os furanos quanto os compostos fenólicos aumentam a geração de espécies reativas de oxigênio (H2O2, O2-, OH-) que interagem com
proteínas e enzimas, levando a sua desnaturação, danificam o citoesqueleto, causam mutagênese do DNA e induzem a morte celular programada (Figura 5). Os compostos fenólicos são mais tóxicos, mesmo em baixas concentrações, comparados ao furfural e HMF (IBRAHEEM; NDIMBA, 2013; MONLAU et al., 2014).
Figura 5. Mecanismos de ação dos diferentes compostos presentes no hidrolisado. Fonte: Adaptado de IBRAHEEM; NDIMBA, (2013).
1.3. Estratégias de destoxificação do hidrolisado
O hidrolisado apresenta uma variedade de compostos que atuam como inibidores do metabolismo microbiano, portanto, a destoxificação é uma alternativa para torná-lo mais adequado para o metabolismo dos micro-organismos. Existem diversos métodos físicos, químicos e biológicos que são usados para transformar os inibidores em compostos inativos
Tabela 1. Métodos utilizados para a destoxificação de hidrolisados lignocelulósicos.
Tipo de
método Procedimento
Biológico
Tratamento enzimático Lacasse Peroxidasse Tratamento
microbiológico
Coniochaeta ligniaria Trichoderma reesei
Ureibacillus thermosphaericus Físico Aquecimento e vaporização Evaporação Tratamento térmico
Químico
Químico
Álcali (Ca(OH)2, NaOH, NH4OH) Agentes redutores (ditionito, ditiotreitol, sulfito)
Extração liquido-liquido
Acetato de etilo
Extração de fluido supercrítico (CO2
supercrítico) Trialquilamina Extração liquido-solido Carvão ativado Troca iônica
Os métodos biológicos empregam o uso de micro-organismos ou de suas enzimas especificas as quais atuam sob os compostos tóxicos e modificam sua composição. Enzimas como lacasses e peroxidasses provenientes de fungos (Trametes versicolor, Phanerochaete chrysosporium, Cyathus bulleri, C. stercoreus, e Pycnoporous cinnabarinus) são eficazes na remoção de compostos fenólicos. Já o uso de micro-organismos inclui a seleção de espécies microbianas que exibem resistência a inibidores ou adaptação de isolados a inibidores. Além disso, a engenharia genética também pode ser empregada para obter isolados resistentes aos diferentes compostos tóxicos (JÖNSSON; ALRIKSSON; NILVEBRANT, 2013).
O uso de membranas e a evaporação a vácuo são métodos físicos usados para concentrar e reduzir o conteúdo de compostos voláteis, como ácido acético, furfural e vanilina presentes no hidrolisado (CANILHA et al., 2012). No entanto, a evaporação a vácuo também aumenta moderadamente a concentração de compostos tóxicos não voláteis (extrativos e derivados de lignina) e consequentemente, o grau de inibição da fermentação (MUSSATTO; ROBERTO, 2004).
Os métodos químicos abarcam as resinas de troca iônica, a neutralização, a extração com solventes orgânicos e o carvão ativado. O carvão ativado é usado por ter alta capacidade de adsorção de compostos orgânicos de baixo peso molecular e por não afetar os níveis de açúcar no hidrolisado, a eficácia do tratamento depende de vários fatores tais como, pH, tempo de contato, temperatura e proporção de carvão ativado em relação ao volume de hidrolisado (CHANDEL, A. K., DA SILVA, S. S., SINGH, 2011). A capacidade de adsorção do carvão ativado está relacionada com vários fatores como: a área total da superfície, estrutura interna dos poros, a presença de grupos funcionais nas superfícies dos poros e a carga elétrica que pode gerar atração ou repulsão (SILVA et al., 2017).
A adsorção envolve dois tipos de forças: físicas e químicas. Quando a adsorção é física, o adsorvato é ligado à superfície por forças de Van der Walls relativamente fracas, no caso da quimiosorção, envolve a troca ou compartilhamento de elétrons entre o adsorvato e a superfície do adsorvente, resultando em uma reação química. A adsorção é um processo complexo que envolve mais de um mecanismo: (1) acumulação na superfície do adsorvato, (2) adsorção polar do adsorvato pelos grupos funcionais do adsorvente, e (3) atração p-p entre o adsorvato cíclico e as camadas do adsorvente (núcleo hidrofílico) (GHANI et al., 2017).
A adsorção de inibidores por carvão ativado é bastante sensível a mudanças no pH, os ácidos orgânicos fracos no estado não ionizado são facilmente adsorvidos a pH baixo, por exemplo os fenóis em pH baixo são altamente adsorvidos. Outros compostos como ácido acético e fenol são absorvidos mais fortemente da fase aquosa, do que suas formas ionizadas (acetato, íons fenolato) porque as propriedades físicas e químicas dos compostos mudam após a ionização, o que afeta sua adsorção. Por outro lado, os compostos básicos são mais facilmente adsorvidos em seu estado não ionizado e sua absorção é favorecida em pH alcalino (MUSSATTO; ROBERTO, 2004).
Além dos métodos anteriormente mencionados, existe outro método alternativo: os polímeros molecularmente impressos (MIPs). Os MIPs são gerados pela formação de um complexo entre o analito (molde) e um monômero funcional, depois de um processo de polimerização, o molde é retirado do polímero, deixando locais de reconhecimento específicos e complementares em forma, tamanho e funcionalidade química à molécula
ligações de hidrogênio, dipolo-dipolo e interações iônicas entre a molécula molde e grupos funcionais presentes na matriz polimérica (VASAPOLLO et al., 2011). Assim, o polímero resultante reconhece e liga seletivamente apenas as moléculas molde. As principais vantagens dos polímeros são sua alta afinidade e seletividade pela molécula alvo, maior resistência física, resistência à pressão e temperatura elevadas e não tem reação contra vários produtos químicos (solventes orgânicos, ácidos, bases e íons metálicos), baixos custos de produção e longa vida útil (vários anos à temperatura ambiente) (CHEONG, WON J; YANG, SONG H; ALI, 2013).
Os polímeros molecularmente impressos são amplamente usados porque são capazes de reconhecer moléculas biológicas e químicas, incluindo aminoácidos e proteínas, poluentes, drogas e alimentos. Além disso, as áreas de aplicação incluem: ciências da separação e purificação, cromatografia, pré-tratamento de amostras, sensores químicos, catálise, administração de fármacos, sistemas biológicos de anticorpos e receptores (VASAPOLLO et al., 2011).
1.4. Crescimento microbiano em açúcares da hemicelulose
A escolha de um bom substrato para produção fermentativa de hidrogênio determina a viabilidade do processo. O substrato deve ser: rico em carboidratos, provenientes de recursos renováveis, suficiente para fermentação e para promover a recuperação de energia energeticamente favorável. Neste contexto, várias pesquisas se voltaram para resíduos lignocelulósicos para produção de hidrogênio (REGINATTO; ANTÔNIO, 2015).
O produto gerado na fermentação depende de vários fatores como: o substrato disponível, enzimas, pH, pressão, temperatura e o micro-organismo envolvido. Alguns dos micro-organismos que realizam fermentação escura são bactérias anaeróbias estritas como Clostridium sp, anaeróbias facultativas como Enterobacter e E. coli ou culturas mistas vindas de reatores, fezes de animais ou do solo. Para produzir hidrogênio a partir de resíduos lignocelulósicos, as culturas puras são mais desejadas, pois há uma maior facilidade de controlar as condições de cultivo a fim de se obter uma maior produção; além disso, em culturas mistas, algumas espécies podem consumir o H e outros produtos desejáveis que são
produzidos por outras espécies, ou mesmo consumir o substrato sem gerar nenhum produto economicamente atraente (MASSET et al., 2012).
A hemicelulose compõe grande parte do material lignocelulósico, portanto, para se obter uma ótima produtividade de biohidrogênio é necessária a completa utilização dos diferentes açúcares nela presentes. Nas bactérias a repressão catabólica do carbono (RCC) é um mecanismo regulador que garante a utilização sequencial dos carboidratos, e acontece quando o substrato é composto por varias fontes de carbono, como por exemplo no hidrolisado, a bactéria consome os diferentes açúcares em determinada ordem (BRÜCKNER; TITGEMEYER, 2002). A célula prioriza a fonte de carbono que sustente o seu crescimento máximo, para isto ela reprime a síntese de enzimas que metabolizem o substrato menos favorável enquanto houver quantidades suficientes do substrato preferido geralmente os açúcares de seis carbonos, geralmente as pentoses ou outros açúcares são utilizados quando toda a glicose for consumida; neste processo estão envolvidos diversos sistemas da célula que são responsáveis pelo transporte do substrato e pelo seu metabolismo (Figura 6) (KREMLING et al., 2014).
O consumo sequencial de carboidratos reduz a produtividade da fermentação, pois torna a fermentação das pentoses mais lenta devido á presença de produtos finais do metabolismo da glicose que são inibitórios, como o ácido lático e o etanol. Quanto maior a quantidade de substrato contendo açúcares é adicionado ao meio de fermentação, menor o consumo das pentoses por parte da célula, esta alternância no consumo dos açúcares torna difícil o controle da fermentação (KIM; BLOCK; MILLS, 2010).
Figura 6. Fermentação de duas fontes de carbono (glicose e xilose). No momento da exaustão de glicose no meio (ponto de troca), a RCC na célula diminui. Uma vez que a repressão é aliviada, a célula pode mudar para consumir a xilose. Fonte: Adaptado de SOLOPOVA et al., (2014).
Kremling e colaboradores (2014) utilizando diferentes modelos matemáticos e experimentais explicaram esses mecanismos regulatórios. Os modelos tentam desvendar a complexa relação entre metabolismo, sinalização celular e a regulação da expressão de genes em Escherichia coli. Cada modelo tem foco em um determinado aspecto do crescimento celular baseado na repressão catabólica. Todos estes modelos conseguem explicar a condição de crescimento, mas possuem restrições, já que nenhum modelo mostra a interação entre os diferentes mecanismos regulatórios e o restante do metabolismo celular. Portanto ainda existe a necessidade de modelos que exponham uma perspectiva geral do metabolismo celular, ao invés de focar em um mecanismo regulatório isoladamente (KREMLING et al., 2014).
Enquanto a maioria dos estudos foca nas espécies de bactérias que preferem fermentar primeiramente o açúcar que lhes conferem um maior crescimento, há outros micro-organismos que preferem consumir primeiro o açúcar que lhe proporcione uma menor taxa de crescimento. Essas espécies poderiam ser uma solução para o problema da restrição de carboidratos se fossem cultivadas juntamente com as espécies que utilizam preferencialmente a glicose, assim, a glicose e as pentoses seriam fermentadas ao mesmo tempo (KREMLING et al., 2014). Poucas espécies possuem naturalmente a capacidade de fermentar mais de um
tipo de açúcar, como Lactobacillus buchneri (glicose e xilose), Streptococcus thermophilus (lactose e sacarose), L. reuteri (glicose e glicerol) e Clostridium thermohydrosulfuricum (glicose e xilose; celobiose, xilose e xilobiose) (KIM; BLOCK; MILLS, 2010). A bactéria ácido-lática L. brevis mostrou ser capaz de fermentar glicose e xilose simultaneamente quando alimentada com hidrolisado de palha de arroz (KIM; BLOCK; MILLS, 2010). Além dessas, bactérias do rúmen são conhecidas por degradar celulose e hemicelulose e ainda fermentar a mistura de açúcares, como por exemplo, Ruminococcus albus que metaboliza glicose e xilose ao mesmo tempo (THURSTON; DAWSON; STROBEL, 1994).
A modificação genética de algumas espécies é uma boa alternativa para conseguir que os micro-organismos consumam glicose e xilose ou arabinose simultaneamente. Por exemplo, cepas de E. coli, Zymomonas mobilis, Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus pentosus foram modificadas através da introdução de uma via metabólica do metabolismo de xilose ou arabinose. Entretanto, como essas espécies não possuem transportadores específicos para xilose ou arabinose, o consumo desses substratos continuou muito lento. Para se alcançar uma maior produtividade, os níveis de glicose tiveram que ser mantidos a uma baixa concentração, pois assim a afinidade do transportador com a pentose é maior (LEE et al., 2003).
Aparentemente, diferentes micro-organismos têm preferências por diferentes substratos, por isso é necessário testar diferentes de fontes de carbono com cada micro-organismo até o que o maior rendimento em H2 seja alcançado (CAI et al., 2011). Além disso,
para que a produção biológica de H2 seja economicamente viável, é preciso encontrar
micro-organismos que degradem a biomassa eficientemente; com alta produtividade volumétrica em hidrogênio, sejam tolerantes ao hidrolisado que possui alguns inibidores como furfural e substâncias fenólicas (GHIMIRE et al., 2015; SOUZA, 2013)
Um estudo utilizando culturas mistas presentes no estrume de elefante, demonstrou que as bactérias foram capazes de fermentar hidrolisados lignocelulósicos e produzir hidrogênio. O fato comprovou a hipótese dos autores de que as bactérias degradam os materiais lignocelulósicos, já que a dieta do elefante é composta de plantas (FANGKUM; REUNGSANG, 2011a).
Há um enorme interesse global em transformar a biomassa que é desperdiçada, em bioenergia, assim dois problemas globais estariam sendo reduzidos: tanto a ampla acumulação de resíduos no ambiente que acabam contaminando solos e rios, quanto a alta dependência de combustíveis fósseis (SARATALE et al., 2008). Para isso, novas pesquisas devem ser feitas a fim de se descobrir e isolar do ambiente bactérias produtoras de hidrogênio, pois poucas das muitas espécies com este potencial são atualmente cultivadas em laboratório. Além disso, para ser aplicada comercialmente, vários fatores químicos e físicos que influenciam na fermentação e diferem entre espécies (como pH, temperatura e agitação) devem ser identificados e controlados a fim de se obter a produtividade volumétrica máxima de H2 nos processos (RITTMANN; HERWIG, 2012).
1.5. Fermentação bacteriana
A fermentação é um tipo específico de metabolismo heterotrófico que ocorre sob condições anaeróbias e usa carbono orgânico (açúcares simples ou dissacarídeos) como receptor final de elétrons ao invés de oxigênio ou ânions inorgânicos que são usados durante o metabolismo respiratório. Isto significa que durante a fermentação não é utilizada a cadeia de transporte de elétrons para oxidar o NADH a NAD+ (BOUMBA, ZIAVROU, VOUGIOUKLAKIS., 2008). Quando não há aceptores de elétrons uma parte da fonte de carbono é oxidada e outra é reduzida, formando produtos que podem ser mais ou menos oxidados que o substrato original; os elétrons derivados desse processo são usados na redução de prótons para a formação de hidrogênio molecular (WESTERMANN et al., 2007).
O metabolismo tem como propósito principal gerar energia e construir novo material celular para sustentar o crescimento, inicia com o consumo de substratos biodegradáveis, o substrato mais comum na natureza é a glicose; nesse processo as vias metabólicas desempenham um papel vital na conversão dos substratos, a glicólise (via de Embden– Meyerhof–Parnas) é uma via metabólica universal que ocorre tanto em organismos aeróbicos como anaeróbicos, nessa via são gerados energia na forma de ATP e equivalentes redutores, na forma de NADH. O NADH resultante deve ser reconvertido em NAD+ para permitir que
a glicólise continue (SÁNCHEZ-PASCUALA; DE LORENZO; NIKEL, 2017). Em anaerobiose, os organismos são capazes de oxidar NADH a NAD+ em várias formas, a síntese de produtos reduzidos como H2, lactato, succinato, butirato e etanol são usados para
manter o balanço redox durante a fermentação, porém a produção de produtos mais oxidados como o acetato são associados com produção de ATP (Figura 7) (BASTIDAS-OYANEDEL et al., 2015).
No caso das pentoses, depois que a xilose penetra na célula, a xilose isomerase e a xilulocinase convertem a xilose em xilulose-5-fosfato. Em seguida, a xilulose-5-fosfato é metabolizada pelas enzimas da via das pentoses fosfato antes de entrar na via da glicólise como frutose-6-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato para o metabolismo do carbono. A arabinose é transportada através da célula por uma permeasse, depois dentro da célula, a arabinose pode ser metabolizada pelas arabinose isomerase, ribulocinase, e por L-ribulose-fosfato 4-epimerase, convertendo a L-arabinose em L-ribulose, L-ribulose 5-fosfato e D-xilulose 5-5-fosfato, respectivamente. Sendo metabolizada de maneira semelhante à xilose (LUO; ZHANG; WU, 2014).
Teoricamente, o máximo rendimento de H2 durante a fermentação da glicose é de 12
mols de H2 por mol de substrato para uma completa conversão da glicose a H2 e CO2. No
entanto, este rendimento ainda não foi obtido pelos micro-organismos usados na produção de hidrogênio (WESTERMANN et al., 2007). Como já foi discutido a fermentação bacteriana produz hidrogênio em combinação com outros produtos, tais como ácidos orgânicos. O rendimento de H2 é dependente da rota metabólica empregada durante a
Figura 7. Resumo das vias metabólicas da fermentação anaeróbia da glicose, xilose e arabinose em Enterobacter sp. Fonte: Adaptado de WANG et al., (2013).
Um estudo feito por Jo e colaboradores (2009), estes pesquisadores demostraram que quando a concentração de glicose foi aumentada em quase 10 vezes na cultura de Clostridium tyrobutyricum a concentração de H2, butirato e acetato produzidos também aumentou;
havendo uma diminuição na produção de lactato. O pH também é um fator que influencia no metabolismo microbiano, visto que mudanças neste afetam as atividades enzimáticas da célula. Além disso, a pressão parcial do hidrogênio pode afetar o rendimento e a taxa de produção de H2. Uma redução da pressão de 760 mm Hg a 380 mm Hg pode aumentar
substancialmente a produção de H2 de 1,9 mol a 3,9 mol de H2/mol de glicose em
Enterobacter cloacae (MANDAL; NATH; DAS, 2006).
Fermentações conduzidas com diferentes espécies de Escherichia em cultura pura e usando glicose ou hidrolisado de amido como substrato apresentaram rendimentos na faixa de 0,2–1,8 mols H2/mols de hexose. No entanto, o uso de espécies de Enterobacter tem
rendimentos maiores na ordem de 1,1-3,0 mols H2/mol de hexose. A Tabela 2 mostra valores
dos rendimentos obtidos em diferentes pesquisas usando diferentes micro-organismos e substratos (LEE; SHOW; SU, 2011).
Quando o micro-organismo usa açúcares de cinco carbonos como, por exemplo, xilose ou arabinose o rendimento em hidrogênio é menor comparado com glicose. O valor teórico máximo corresponde a 3,33 mols H2/mol de pentose onde o ácido acético é o produto
final da fermentação. Se o ácido butírico for o produto final, o rendimento é mais baixo de 1,67 mols H2/mol de xilose/ou arabinose (Tabela 3) (ABDESHAHIAN et al., 2014;
FANGKUM; REUNGSANG, 2011b).
A análise dos produtos reduzidos formados na fermentação indica a rota metabólica utilizada pelo organismo e se a produção de hidrogênioé possível.A produção do hidrogênio pode ser afetada pela concentração do NADH, se o NADH gerado a partir da glicólise for consumido em outras rotas metabólicas como, por exemplo, na produção do ácido lático e de álcool, a produção de hidrogênio será diminuída. A produção destes compostos além de diminuir a produção de hidrogênio, seja pelo abaixamento do pH em sistemas não tamponados ou pela produção de álcool, causando inibição do crescimento bacteriano (MA et al., 2012).
Tabela 2. Produção de hidrogênio por diferentes espécies e diferentes fontes de carbono.
Micro-organismo Fonte de carbono T pH HRendimento mmol
2/mmol substrato
Taxa de produção (LH2/L/H)
Referência
E. coli NCIMB 11943 Hidrolisado de amido 37 _ 1.8 0.33 Perego et al. (1998)
E. aerogenes NCIMB 10102 Hidrolisado de amido 40 _ 1.1 0.24 Kumar and Das (2000)
E. cloacae IIT-BT08 Glicose Sacarose Celobiose L-Arabinose Frutose Amido de batata Celulose Glicose 36 _ _ _ _ _ _ _ _ 2.2 3.0 2.7 1.5 1.6 1.4 _ _ 0.45 0.66 0.36 0.44 0.18 0.20 0.09 _
Kumar and Das (2000)
E. aerogenes HU-101 AY2 Glicose 37 _ 1.2 _ Rachman et al. (1997)
E. aerogens DM11 Glicose 36 _ 3.80 2.18 Kumar et al (2001)
R. palustris P4 Glicose 37 _ 2.76 _ Oh et al (2002)
Citrobacter sp. Y19 Glicose 36 _ 2.49 _ Oh et al (2003)
F.p 01 Maltose 36 _ 2.52 _ Zhao et al (2010)
Enterobacter sp. CN1 Xilose 35 6.0 2.0 mol 1.149 Long et al. (2010)
Enterobacter sp. CN2 Glicose 35 6.0 0.64 mol 1.102 Long et al. (2010)
C. beijerinckii DSM 1820 Glucose - 6.7 1.88 0.55 Masset et al., (2012)
C. butyricum CWBI 1009 Glucose - 5.1 2.10 0.42 Masset et al., (2012)
C. pasteurianum DSM 525 Glucose - 5.4 1.19 0.90 Masset et al., (2012)
Cultura mista Xilose 37 5.5 0.8 1928.5
mmolH 2/g V.h
Tabela 3. Equações estequiométricas na produção de hidrogênio a partir da hexoses e pentoses.
Produto orgânico da
fermentação Equação
Ácido acético C6H12O6 +2H2O ®2CH3COOH + 2CO2 +4H2
C5H10O5 + 1.67H2O®1.67 CH3COOH + 3.33 H2 +1.67 CO2
Ácido Butírico C6H12O6 ®2CH3CH2CH2COOH + 2CO2 +2H2
C5H10O5 ®0.83CH3CH2CH2COOH + 1.67CO2 +1.67H2
Ácido propiônico C6H12O6 + 2H2 → 2CH3CH2COOH + 2H2O
Etanol C6H12O6 → CH3CH2OH + CO2
Com base na proporção dos principais produtos gerados na fermentação, as vias metabólicas são classificadas como: tipo acetato-etanol, tipo propionato, tipo butirato, ácido mista e via metabólica do tipo lactato.
1.5.1. Via metabólica do tipo acetato-etanol
Esta rota fermentativa é caracterizada pela produção do etanol e acetato (> 80%) e com alta eficiência na geração de hidrogênio (TANG et al., 2012). A ausência de oxigênio desencadeia uma regulação negativa do ciclo do ácido cítrico, o que leva a uma oxidação incompleta dos açúcares, gerando acetato como produto principal. A produção de acetato depende de vários fatores como o tipo de substrato, inóculo, pH, temperatura, a pressão de H2 no headspace; o pH é um fator importante que muda a via metabólica, por exemplo a
mudança do pH de 4.0 para 7.0 pode aumentar a geração de acetato e diminuir a produção de butirato, enquanto uma faixa de pH de 6.5-7.0 gera acetato e butirato na mesma proporção. A produção de etanol por enterobactérias é realizada em três etapas com a conversão do piruvato em etanol e com acetil-CoA e acetaldeído como intermediários, e só dois passos em outras bactérias, o acúmulo de etanol no reator pode ser tóxico para os micro-organismos (ZHOU et al., 2017).
1.5.2. Via metabólica tipo butirato
Os principais produtos dessa via são butirato e acetato, com geração de hidrogênio. O butirato é sintetizado pela redução e descarboxilação do piruvato com consumo de acetato, nesse processo são consumidos 2 NADH2. Além dos fatores críticos comuns, como pH e
temperatura, a redução do equivalente também é um fator crucial que determina a eficiência da produção do butirato. Comparado ao processo de produção de acetato, mais dois NADH2
são consumidos para reduzir os intermediários para a formação de butirato, o que significa que mais NADH2 pode facilitar a produção de butirato. Foi relatado que a produção de
butirato aumentou com o aumento do acetato no sistema. Pode ser devido ao fato de que a alta concentração de ácido acético não só tem um feedback reverso para a geração de acetato, mas também leva a um grande excedente de NADH2 (ZHOU et al., 2017).
1.5.3. Via metabólica tipo propionato
Nessa via metabólica, teoricamente dois mols de propionato são geradas a partir de um mol de glicose. No entanto, muitos micro-organismos anaeróbios fermentam glicose a propionato com produção de acetato. O propionato pode ser produzido por meio da redução do piruvato, com lactato como intermediário, ou pode ser gerado por outra via que é especifica de bactérias como Corynebacteria, Propionibacterium e Bifidobacterium. Existem vários fatores que afetam a produção de propionato, como pH, inóculo e inibição do produto, temperatura, concentração de nitrogênio (AHMADI; KHOSRAVI-DARANI; MORTAZAVIAN, 2017).
A produção de propionato é favorecida pelo pH, em pH 4.0 o propionato é aproximadamente 10% do total dos produtos gerados. Baixos rendimentos do propionato durante a fermentação anaeróbica de materiais orgânicos, são atribuídos ao fato que as bactérias são fortemente inibidas pelo propionato não dissociado, especialmente quando o pH é menor de 6.0 (ZHOU et al., 2017).
1.5.4. Via metabólica de ácido mista
A fermentação ácido mista é realizada pelas enterobactérias anaeróbias facultativas, os membros dos gêneros Salmonella, Escherichia, Citrobacter, Shigella e Proteus fermentam a glicose e geram uma mistura de ácidos (ácido acético, láctico e fórmico), dióxido de carbono e etanol. Tipicamente, em fermentações ácido mista, a proporção de produtos ácidos para produtos neutros é de 4:1, o hidrogênio e o dióxido de carbono são produzidos na proporção de 1:1 (MÜLLER, 2001).
A abundância de compostos individuais pode ser afetada por vários fatores, como concentração do substrato, pH, potencial redox, entre outros. Por exemplo, o pH menor que 4,5 leva à produção de acetato, butirato e etanol como produtos primários, enquanto um pH maior que 6,5 induziria o aumento da produção de etanol e a diminuição da formação de ácido (ZHOU et al., 2017). Além disso, a distribuição desses produtos metabólicos depende do tipo de bactéria e da expressão de enzimas funcionais nos micro-organismos.
1.5.5. Via metabólica do tipo lactato
O lactato pode ser gerado por duas vias, fermentação homolática e fermentação heterolática. A fermentação homolática é realizada por micro-organismos homofermentativos obrigatórios como Lactobacillus acidophilus, L. amylophilus, L. bulgaricus, L. helveticus e L. salivarius; essa via metabólica converte glicose ou outros materiais orgânicos em lactato pela enzima lactato desidrogenase com conversão de NADH em NAD+ e um mol de glicose é convertido em dois mols de ácido láctico. A fermentação heterolática é caracterizada pela formação de coprodutos como CO2, etanol e ácido acético,
além do ácido láctico como produto final da fermentação (CASTILLO MARTINEZ et al., 2013).
1.6. Produção fermentativa de hidrogênio 1.6.1. Gás hidrogênio
O gás hidrogênio pode ser produzido através de processos físico-químicos ou biológicos. Os processos físico-químicos são oxidação de hidrocarbonetos pesados, pirólise, reforma de vapor de metano e gaseificação do carvão ou de biomassa. Entretanto, esses processos requerem temperaturas elevadas (geralmente maiores que 85°C) o que gera altos custos para a geração de energia, a qual muitas vezes é obtida por meio da queima de combustíveis fósseis (SARATALE et al., 2008). A eletrólise da água é um processo eletroquímico que tem a desvantagem de necessitar da adição de energia elétrica. Os processos biológicos para produção de H2 incluem a biofotólise da água realizada por algas
(Chlamydomonas reinhardtii) e cianobactérias, fotodecomposição de compostos orgânicos através de bactérias fotossintetizantes, fermentação escura e fotofermentação (BARROS et al., 2012). O biohidrogênio produzido pela fermentação escura, também denominada simplesmente de fermentação, é gerado biologicamente por micro-organismos anaeróbios restritos (Clostridium) e anaeróbios facultativos (Enterobacter), bactérias do rúmen e bactérias termofílicas (Thermoanaerobacterium) (Figura 8) (VARDAR-SCHARA; MAEDA; WOOD, 2008).
Figura 8. Diferentes processos de produção biológica de hidrogênio. Fonte: Adaptado de VENKATA MOHAN; PANDEY, (2011).
A fermentação tem atraído mais interesse para a produção de H2 em relação aos outros
processos, pois é mais vantajosa e viável porque não requer muita energia, não precisa da energia solar, ocorre à temperatura e pressão ambiente e apresenta altas taxas de produção de H2. Quando comparada à biofotólise ou à fotofermentação mostra-se mais econômica, pois
não apresenta a necessidade de iluminação constante para o desenvolvimento das reações e diversos compostos orgânicos, inclusive resíduos agroindústrias, podem ser usados como substrato (HALLENBECK; GHOSH, 2009).
1.6.2. Micro-organismos produtores de gás hidrogênio
Existe uma grande variedade de micro-organismos que produzem gás hidrogênio, como as arquéias, bactérias anaeróbias facultativas, bactérias anaeróbias restritas e algas. Os micro-organismos mais usados são as bactérias anaeróbias restritas e facultativas, porque elas não precisam da energia do sol para seu crescimento. Baseado na temperatura de crescimento, estes micro-organismos podem ser classificados como: mesófilos ou termófilos. Os rendimentos e as taxas de produção de hidrogênio de bactérias termófilas e termófilas extremas (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, T. neapolitana e Caldicellulosiruptor saccharolyticus) que crescem em temperaturas acima de 60°C, são muitas vezes superiores aos de bactérias mesófilas que crescem à temperatura ambiente. Porém, o cultivo de bactérias termófilas requer de muita energia (PATEL; KALIA, 2013; URBANIEC; BAKKER, 2015). A conversão de H2 dos termófilos é mais próxima do
rendimento teórico quando comparada com as bactérias mesófilas, porém, o cultivo e manutenção de micro-organismos anaeróbios facultativos é mais fácil do que para anaeróbios estritos (CHANDRASEKHAR; LEE; LEE, 2015).
Na fermentação, o inóculo empregado pode ser constituído de comunidades mistas de bactérias anaeróbias ou culturas puras de espécies produtoras de hidrogênio. No entanto, o uso de inóculos baseados em culturas puras permite a determinação das condições que resultem no maior rendimento e produção de hidrogênio e as mudanças metabólicas que ocorrem durante o processo fermentativo (ELSHARNOUBY et al., 2013). Experimentos baseados em inóculos de culturas mistas apresentam a vantagem de não requerer a operação
em condições estéreis, o que diminui o custo de produção aumentando a viabilidade econômica do processo. Por outro lado, pode ocorrer o crescimento de bactérias do ácido láctico, arquéias metanogênicas e homoacetogênicas que podem predominar no processo levando a uma diminuição do rendimento em hidrogênio e a viabilidade econômica do processo (NTAIKOU; ANTONOPOULOU; LYBERATOS, 2010).
Para minimizar a ocorrência de bactérias consumidoras de hidrogênio na cultura mista, pode ser feito um pré-tratamento inicial da amostra com o intuito de eliminar os micro-organismos indesejáveis e favorecer a predominância das espécies produtoras de hidrogênio. O pré-tratamento térmico da amostra é a prática mais comum, o inóculo é submetido a altas temperaturas, em que apenas os micro-organismos ácidogênicos formadores de esporos são capazes de sobreviver ao choque térmico. Outra alternativa é o tratamento ácido-base da amostra, o qual por pressão seletiva segura a predominância de bactérias esporulantes produtoras de hidrogênio. A manutenção de condições muito ácidas ou muito básicas por tempo prolongado causa a remoção dos micro-organismos metanogênicos que não sobrevivem a valores de pH extremos (NTAIKOU; ANTONOPOULOU; LYBERATOS, 2010).
Um grande número de organismos procedentes de culturas mistas ou puras tem a capacidade de fermentar diversas fontes de carbono. Apesar do rendimento de H2 ser maior
em organismos anaeróbios restritos, bactérias anaeróbias facultativas são muito estudadas devido à maior facilidade de cultivá-las, afinal essas são menos sensíveis ao oxigênio do que anaeróbios restritos. Além disso, as taxas de crescimento e de produção de hidrogênio são mais altas (SHIN et al., 2007). Micro-organismos aeróbios como Bacillus sp, Aeromonas sp, Pseudomonas sp e Vibrio sp. também foram testados na produção de hidrogênio, mas os rendimentos são geralmente baixos, menores que 1,2 mols H2/mol glicose (LEE; SHOW;
SU, 2011).
Dentro do grupo de micro-organismos anaeróbios estritos e facultativos, como Clostridium sp, E. coli e Enterobacter sp, respetivamente, a bactéria melhor caraterizada é E. coli, muitos estudos tem sido realizados utilizando engenharia genética para melhorar o rendimento do hidrogênio desse micro-organismo; estas estratégias podem servir como modelo para a manipulação genética de outras espécies que ainda não estão completamente
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