Estudar o papel dos proteoglicanos de baixo peso molecular ricos em leucina em processos de remodelamento da matriz extracelular durante a reação estromal e cicatrização. 2.2 Objetivos Específicos 2.2.1 Produção de anticorpo monoclonal anti‐lumicam: 2.2.1.1 Para a utilização em ensaios de imunodetecção de lumicam; 2.2.1.2 Para a preparação de uma coluna de afinidade complexada com o anticorpo anti‐lumicam, a fim de purificá‐lo; 2.2.1.3 Para a purificação de lumicam a partir de membrana amniótica para posterior utilização em ensaios de proliferação, adesão e migração de células de câncer de próstata, para estudo do efeito antitumoral deste composto;
2.2.1 Estudo da interação fibroblasto‐célula tumoral:
2.2.2.1 Realização de ensaios de co‐cultura para o estudo do efeito de células tumorais de próstata (PC3 e DU145) sobre fibroblastos; 2.2.2.2 Análise dos efeitos distintos de fatores solúveis e contato direto célula‐célula sobre a síntese de componentes da MEC em co‐cultura de células de câncer coloretal (Caco‐2 e HCT 116) e fibroblastos. 2.2.2 Estudo comparativo da expressão e localização celular do lumicam e de outros SRLPs em tecidos comprometidos por adenocarcinoma de próstata e em tecido saudável da próstata do mesmo indivíduo;
2.2.3 Estudo comparativo da cicatrização de córnea após queimadura alcalina em camundongos knock‐out para o receptor TRPV‐1 (Transient Receptor Potential Vanilloid 1), receptor envolvido no processo de inflamação em animais normais.
Material e Métodos
37 3 Material e Métodos 3.1 Reagentes Tris, uréia e glicina foram obtidos da GibcoBRL (Grand Island, NY, EUA) e brometo de etídio da GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ, EUA). Agarose e EDTA foram obtidos da USB (Cleveland, OH, EUA). Os componentes para o meio de cultura para o crescimento das bactérias, tais como peptona, extrato de levedura e triptona foram adquiridos da BD (Sparks, MD, EUA). Ácido ‐ amino capróico, benzamidina, iodoacetamida e fenil‐metil‐sulfonil fluoreto (PMSF) foram obtidos da Sigma (St. Louis, MO, EUA). Os demais reagentes químicos, tais como sais, ácidos, bases e solventes orgânicos foram todos adquiridos da Merck (Darmstadt, Alemanha). Todos os primers utilizados foram sintetizados pela IDT (Coralville, IA, EUA), exceto o primer antisense para amplificação do gene da condroitinase AC a partir de DNA genômico de Flavobacterium heparinum (item 3.2), adquirido da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). 3.2 Produção de anticorpo monoclonal contra lumicam humano Anticorpos monoclonais contra o lumicam humano foram produzidos utilizando‐se como antígenos peptídeos desenhados baseados no esqueleto protéico do lumicam humano, considerando‐se os sítios de glicosilação. A produção do anticorpo contou com a participação da Profa . Dra. Célia R. W. Carneiro da disciplina de Imunologia da UNIFESP. Dois peptídeos contra a região N‐terminal da proteína foram sintetizados, dois contra a região C‐ terminal e um contra a região central da proteína. A síntese dos peptídeos foi realizada na disciplina de Biofísica da UNIFESP, sob supervisão da Profa . Dra. Maria Aparecida Juliano. A seqüência completa do lumicam foi obtida no GenBank, pubmed ID HSu18728. Os peptídeos sintetizados foram os seguintes; peptídeo A: SLSAFTLFLALIGGTSGQ; peptídeo B: YYDYDFPLSTYGQSS; peptídeo C: LIGGTSGQYYDYDFPLSI; peptídeos D: LSFNQIARLPSGLPVSL e peptídeo E: LDGNRISETSLPPDH.
Os peptídeos foram conjugados a KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin, Pierce, Rockford, IL, EUA) a fim de aumentar sua imunogenicidade. Para isso, cada peptídeo foi dissolvido em
38 tampão fosfato 0,1 M pH 7,5 na concentração de 1 mg/ml para um volume final de 4,6 ml, sendo em seguida adicionados 400 μl de KLH 5 mg/ml em tampão fosfato 0,1 M pH 7,5. Em seguida, na capela, adicionaram‐se 4 ml de solução de glutaraldeído 0,02% de forma lenta e sob agitação, sendo a solução então incubada a temperatura ambiente sob agitação lenta por uma hora. As reações foram aliquotadas e armazenadas a ‐20°C. Cada peptídeo foi utilizado para imunizar 6 camundongos BALB/c isogênicos, fêmeas, de 6 a 8 semanas. Foram administrados 50 µg de cada peptídeo por animal a cada 14 dias em quatro aplicações próximo a raiz dos membros, onde se encontram os linfonodos. Na primeira administração, a solução contendo o peptídeo foi emulsionada utilizando‐se o adjuvante completo de Freund (Sigma Chemical Co., St. Louis, MI, EUA), utilizando‐se duas seringas de vidro hipodérmicas unidas por uma conexão. Nas administrações subseqüentes, os peptídeos foram emulsionados utilizando‐se o adjuvante incompleto de Freund (Pierce). Antes da primeira imunização o sangue dos animais foi coletado para a obtenção de um soro pré‐imune. A coleta por capilaridade foi realizada utilizando‐se pipeta Pasteur de vidro introduzida na conjuntiva de um dos olhos. Foram coletados aproximadamente 700 μl de sangue por animal, incubados a 37°C por 30 minutos e em seguida a 4°C por 30 minutos, sendo então centrifugado a 3000 X g para obtenção do soro.
Após testes de especificidade dos anticorpos policlonais contidos nos soros dos animais, determinou‐se o melhor animal para a fusão. Um animal imunizado com o peptídeo A (desenhado na região N‐terminal da proteína) escolhido para a fusão. O baço deste animal foi removido e homogeneizado, sendo suas células em seguida fusionadas com células “imortais” de mieloma P3653. A fusão foi realizada pela adição de 1 ml de Polietilenoglicol (PEG 3000; Sigma‐Aldrich, St. Louis, MI, EUA) por 60 segundos sob agitação branda (Ed Harlow e Lane, 1988). Em seguida, 1 ml de meio RPMI (RPMI 1640; GibcoBRL, Life Technologies Inc., Grand Island, NY, EUA) sem soro foi adicionado à suspensão de células durante 30 segundos, seguidos de uma nova adição de 3 ml de meio RPMI sem soro por mais 30 segundos e, finalmente, de 16 ml de meio RPMI sem soro por 1 minuto. A suspensão permaneceu em repouso por 5 minutos sendo em seguida centrifugada a 800 X g
39 por 5 minutos. As células foram então ressuspendidas em 30 ml de meio RPMI e centrifugadas novamente (800 X g) para remoção do agente fusionante.
Previamente à realização da fusão, as células de mieloma foram cultivadas e expandidas em meio RPMI, Hepes 10 mM, Bicarbonato de Sódio 24 mM, Gentamicina 40 mg, beta‐ mercaptoetanol 5 x 10-5
M, suplementado com L‐Glutamina 200 mM contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) a 37°C em 5% de CO2, até a confluência. Para a fusão foram utilizadas 7,4 x 107 células que foram ressuspendidas em meio RPMI.
Finalmente, as células fusionadas foram ressuspendidas em meio RPMI contendo HAT (100 μM hipoxantina, 0,4 μM aminopterina, 16 μM timidina) em 20% de SFB e distribuídas por 8 placas de cultura de 96 poços previamente preparadas com uma cultura de macrófagos feeder layer (obtidos por lavagem peritoneal de camundongo Balb/c) para auxiliar a remoção de debris.
As placas foram mantidas por uma semana em estufa a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 e em seguida os meios de cultura foram testados por ensaio do tipo ELISA contra o peptídeo para a análise da presença de anticorpos.
3.3 ELISA (Enzymatic Like Immunosorbent Assay)
Para a realização dos testes dos soros dos animais imunizados e meios de cultura das células de hibridoma, os peptídeos foram adicionados a placas de 96 poços numa concentração de 0,5 µg/ml em tampão fosfato salina (NaCl 1,37 M, Na2HPO4 0,152 M, KH2PO4 0,015M, KCl 0,027 M) pH 8,6 (PBS), formando um coat de antígeno após incubação a 4°C por 12 horas. Em seguida, a placa foi lavada 3 vezes com tampão PBS e o bloqueio dos sítios inespecíficos foi realizado utilizando‐se uma solução de gelatina 0,5 % em PBS por 4 horas a temperatura ambiente sob agitação. Os soros obtidos foram então diluídos em PBS e estes ou os meios de cultura foram incubados nos poços por 2 horas a temperatura ambiente sob agitação ou a 4°C por 12 horas. A placa foi então lavada com tampão PBS sendo realizada em seguida uma incubação com anticorpo secundário anti‐IgG de
40 camundongo conjugado com biotina (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA), por 1 hora a temperatura ambiente na diluição 1:5000 em tampão PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA). Após nova lavagem, a placa foi incubada por 1 hora a temperatura ambiente com estreptavidina conjugada com peroxidase (GE Healthcare) na diluição 1:10000 em tampão PBS contendo 1% de BSA.
A placa foi então revelada com o reagente de O‐fenilenodiamina, OPD (Merck, Darmstadt, Alemanha) em tampão citrato pH 4,5 na concentração de 1 mg/ml, com incubação de no máximo 15 minutos ao abrigo da luz. A reação foi interrompida pela adição de H2SO4 3 N (Merck, Darmstadt, Alemanha). A leitura de intensidade relativa de cor foi realizada em leitor ELISA utilizando‐se o comprimento de onda de 494 nm.