Vivien Jane Coulson-Thomas
Reação estromal e proteoglicanos de baixo
peso molecular ricos em leucina
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina, para obtenção
do Título de Doutor em Ciências.
São Paulo
Reação estromal e proteoglicanos de baixo
peso molecular ricos em leucina
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina, para obtenção
do Título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof
aDr
aLeny Toma
São Paulo
COULSON-THOMAS, Vivien Jane
Reação estromal e proteoglicanos de baixo peso molecular
ricos em leucina. --- São Paulo, 2010. 248 p.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina.
1. Reação estromal 2. SRLPs 3. Proteoglicanos 4. Cicatrização
Tese preparada no Departamento de Bioquímica durante o Curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular e apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Ao Tarsis, obrigada pelo amor e
amizade, e por ser tão
À Professora Maria Aparecida Pinhal, Cida, a sua amizade é muito especial para mim. Ao Professor Peter Reinach, thank you for all your support throughout this journey. You are an exceptional colleague and a wonderful friend.
À Professora Célia Whitaker Carneiro, que sempre se dispôs a ajudar, inclusive aos feriados e domingos à noite. Ainda precisamos tomar uns drinques para comemoração de nosso hibridoma.
Ao Professor Valdemar Ortiz, por acreditar em nosso projeto e fazer tudo ao seu alcance para torná-lo possível.
Aos Médicos e enfermeiras do departamento de Urologia da UNIFESP por serem sempre prestativos e simpáticos, em especial à enfermeira Sandra, que foram imprescindíveis ao desenvolvimento do trabalho.
Aos pacientes por aceitaram participar do trabalho, tornando-o possível em um momento tão difícil.
Ao Professor João Roberto, que ao longo destes anos sempre me ajudou, se tornando um grande amigo.
Ao Professor Ivarne, sempre disposto a ajudar, com competência e sempre interessado. Suas contribuições foram realmente importantes.
À Professora Adriana K. Carmona e à Nilana Meza Tenório de Barros, que abriram as portas de seu laboratório para mim.
Ao Professor Marcelo Franco, que abriu as portas da patologia realizando assim parte importante neste trabalho.
À Professora Marimélia Porcionatto, pela amizade ao longo destes anos. Trabalhar com você é sempre um prazer.
Aos demais professores da biologia molecular, Gisele Zenker, Luciana Vasquez, Hugo Pequeno Monteiro, Yara Michelacci, Lúcia Sampaio pela convivência.
pelos ensinamentos e confiança.
À Juliana Luporini Dreyfuss pelo companheirismo e amizade. A Carolzinha por todas as suas contribuições importantes.
À Patrícia por sua amizade e por sempre, sempre nos ajudar.
Agradeço os colegas do departamento, em especial Eduardo Henrique Cunha de Farias (Duda), Marcelo Andrade de Lima, Renan Peluzzi Cavalheiro, Rodrigo Hipolito Bouças, Thais Jarrouge, Caroline Meloni Vicente (Carolzinha), Daiana, Gioconda Moura, Jean Edgar Gamero, que me ajudaram ao longo de todos estes anos.
À Clélia por sempre me animar em momentos difíceis.
À dona Everaldina (Vera) por sua extrema eficiência, competência, e por ser uma pessoa
tão valiosa, e dona Juraci (Ju) in memorium.
A Elsa Yoko Kobayashi, o que seria de nós sem você; obrigada por tudo. À Aline Mendes e Isabel Anunciação Neves dos Santos, pelo apoio. À FAPESP, pelo apoio financeiro.
1 Introdução ... 1
1.1 Matriz extracelular ... 1
1.2 Glicosaminoglicanos ... 1
1.2.1 Ácido hialurônico ... 3
1.2.2 Dermatam sulfato e condroitim sulfato ... 4
1.2.3 Heparam sulfato ... 5
1.2.4 Queratam sulfato ... 6
1.3 Proteoglicanos ... 7
1.3.1 Proteoglicanos de matriz extracelular ... 7
1.3.2 Proteoglicanos de superfície celular ... 10
1.3.3 Proteoglicanos Intracelulares ... 11
1.3.4 Proteoglicanos pequenos ricos em leucina ... 11
1.3.4.1 Lumicam ... 18
1.3.4.2 Decorim ... 20
1.3.4.3 Biglicam ... 22
1.3.4.4 Fibromodulina ... 23
1.4 Colágeno ... 23
1.5 Metaloproteinases ... 24
1.6 Matriz extracelular e câncer ... 27
1.7 Câncer de Próstata ... 29
1.8 Cicatrização ... 33
1.9 TGF ... 35
2 Objetivos ... 36
2.1 Objetivos gerais ... 36
2.2 Objetivos Específicos ... 36
3. Métodos ... 37
3.1 Reagentes ... 37
3.2 Produção de anticorpo monoclonal contra lumicam humano ... 37
3.3 ELISA (Enzymatic Like Immunosorbent Assay)... 39
37
3.5 Purificação do anticorpo monoclonal anti‐lumican ... 40
3.6 Produção de coluna de afinidade anti‐lumicam ... 41
3.7 Purificação de Lumicam de membranas amnióticas humanas ... 41
3.8 Purificação de Lumicam de córneas humanas ... 42
3.9 Dessalificação da amostra por Zip Tip ... 43
3.10 Extração de colágeno tipo I ... 43
3.11 Dosagem de proteína ... 44
3.12 Eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato (SDS‐PAGE) ... 45
3.13 Coloração por Nitrato de Prata ... 45
3.14 Western blotting ... 46
3.15 Imunopreciptação ... 46
3.16 Cultura de células das linhagens Caco‐2, HCT‐116, PC3, DU‐145 e fibroblastos ... 47
3.17 Preparação de matriz extracelular ... 47
3.18 Sistema de co‐cultura em bicamada ... 48
3.19 Cultivo de células em sistema de O‐ring ... 48
3.20 Cultivo de células em sistema de transwell ... 49
3.21 Ensaio de adesão celular ... 49
3.22 Ensaio do MTT ... 51
3.23 Ensaio de proliferação celular por incorporação de BrdU (5‐bromo‐2‐deoxiuridina) ... 51
3.24 Ensaio de migração ... 52
3.25 Extração de RNA total de células ... 53
3.26 Extração de RNA total de tecidos ... 53
3.27 Reação de transcrição reversa (RT‐PCR) ... 54
3.28 PCR em tempo real ... 54
3.29 Seqüenciamento do DNA ... 56
3.3 Extração de proteína total de tecidos e células ... 57
3.31 Imunocitoquímica ... 58
3.32 Desepitelização da córnea ... 59
3.33 Coleta dos tecidos da Próstata ... 59
3.34 Imunohistoquímica ... 60
38
4 Resultados ... ..62
4.1 Purificação e estudo do papel biológico do lumicam de membrana amniótica humana sobre células tumorais de próstata ... 63
4.1.1 Produção e caracterização do anticorpo anti‐lumicam ... 63
4.1.2 Produção de uma coluna de afinidade anti‐lumicam ... 65
4.1.3 Purificação de lumicam de membrana amniótica humana ... 66
4.1.4 Efeito do lumicam exógeno sobre a proliferação de células de câncer de próstata ... 68
4.1.5 Efeito do lumicam exógeno sobre a adesão de células de câncer de próstata ... 74
4.1.6 Efeito do lumicam sobre a migração de linhagens celulares de câncer de próstata ... 77
4.2 Cross‐talk entre fibroblastos e células de câncer de próstata: diferenciação de fibroblastos, diminuição da expessão de TGFβ e de componentes da matriz extracelular ... 87
Resumo ... 88
Fibroblast and prostate tumor cell cross‐talk: fibroblast differentiation, TGFβ and extracellular matrix down‐regulation ... 89
4.3 Estudo da expressão dos proteoglicanos pequenos ricos em leucina em adenocarcinoma de próstata humana ... 110
4.4 Contato célula‐célula entre células de câncer coloretal e fibroblastos induz acúmulo de matriz extracelular afetando a invasão da célula tumoral ... 131
Resumo ... 132
Cell‐cell contact between colonrectal cancer cell lines and fibroblasts leads to extracellular matrix accumulation ... 133
4.5 Deleção do gene TRPV1 previne a formação de cicatriz tecidual durante a cicatrização estromal em camundongos ... 180
Resumo ... 181
Ablation of TRPV1 gene prevents scar tissue formation during corneal stromal wound healing in mice ... 182
5 Discussão ... 223
6 Conclusões ... 226
7 Referências Bibliográficas... 227
FIGURA 1: Unidades Estruturais dos Glicosaminoglicanos ... 2
FIGURA 2: Análise Filogenética e Organização Cromossômica das Classes de SRLPs. ... 12
FIGURA 3: Seqüencias Consenso de Colágeno para os Sítios de Ligação ao Decorim e Orientações Conformacionais de Ligação de Decorom. ... 14
FIGURA 4: Docking do Decorom na Superfície da Fibrila para a Disposição nos Domínios de Ligação D e E1. ... 15
FIGURA 5: Estrutura do Domínio Lrr de Decorim Bovino. ... 18
FIGURA 6: Ação do Decorim em Sinalização Celular ... 21
FIGURA 7: Esboço da Estrutura das Metalloproteinases. ... 27
FIGURA 8: Modelo Proposto para a Progressão do Câncer de Próstata ... 32
FIGURA 9: Esquema Proposto para Cicatrização da Pele ... 34
FIGURA 10: Esquema das Células Plaqueadas em Sistema de O‐Rings ... 49
FIGURA 11: Modelo do Pré‐Tratamento da Placa Multiwell para o Ensaio de Adesão Celular ... 50
FIGURA 12: Western Blotting de Extrato Bruto de Córnea Humana Imunoprecipitado com o Anticorpo Monoclonal anti‐Lumicam. ... 64
FIGURA 13: Gel de Poliacrilamida do Anticorpo anti‐Lumicam Purificado por Coluna Affigel e Proteina A em Série, Corado com Coomassie Blue R‐250. ... 65
FIGURA 14: Imagem Digitalizada do Gel de Poliacrilamida em Sistema de SDS‐Page do Lumicam Purificado de Membrana Amniótica. ... 67
FIGURA 15: Efeito do Lumicam Sobre a Proliferação de Células Tumorais de Próstata (PC3). ... 69
FIGURA 16: Efeito de Lumicam Sobre a Proliferação de Células Tumorais de Próstata (PC3). ... 70
FIGURA 17: Efeito do Lumicam Sobre a Proliferação de Células Tumorais de Próstata (DU145). ... 71
Figura 18: Efeito do Lumicam Sobre a Proliferação de Células Tumorais de Próstata (DU145). ... 72
Figura 19: Efeito do Lumicam Sobre a Proliferação de Células Tumorais de Próstata (PC3). ... 73
Figura 20: Efeito do Lumicam Sobre aProliferação de Células Tumorais de Próstata (DU145). ... 74
Figura 21: Efeito do Lumicam Exógeno Sobre a Adesão de Células Tumorais de Próstata (PC3 e DU145). ... 75
Figura 22: Efeito da Fração 0,5 M de Lumicam Sobre a Migração de Células da Linhagem de Câncer de Próstata PC3. ... 79
FIGURA 23: Efeito da Fração 0,5 M de Lumicam Sobre a Migração de Células da Linhagem de Câncer de Próstata PC3. ... 80
Câncer de Próstata DU145. ... 82 Figura 26: Efeito da Fração 0,7 M do Lumicam Sobre a Migração de Células da Linhagem de
Câncer de Próstata PC3. ... 83 Figura 27: Efeito da Fração 0,7 M de Lumicam Sobre a Migração de Células da Linhagem de
Câncer de Próstata PC3. ... 84 Figura 28: Efeito da Fração 0,7 M do Lumicam Sobre a Migração de Células da Linhagem de
Câncer de Próstata DU145. ... 85
Figura 29: Efeito da Fração 0,7 M de Lumicam Sobre a Migração de Células da Linhagem de
Câncer de Próstata DU145. ... 86
Figura 30: Hematoxilina‐Eosina de Cortes de Tecidos Comprometidos e Não Comprometidos
Por Câncer de Próstata. ... 111
Figura 31: Expressão Relativa de Lumicam Entre Tecidos Comprometidos e Não
Comprometidos Por Câncer de Próstata. ... 112
Figura 32: Disposição De Lumicam em Cortes de Tecidos Comprometidos e Não Comprometidos Por Câncer de Próstata. ... 114 Figura 33: Controle Secundário do Ensaio de Imunohistoquímica com o Anticorpo anti‐
Lumicam, Revelado com Solução de DAB e Contra Corado Por Hematoxilina. ... 115 Figura 34: Co‐Localização de Lumicam e Fibromodulina em Cortes de Tecidos Comprometidos
e Não Comprometidos por Câncer de Próstata. ... 119 Figura 35: Expressão Relativa de Fibromodulina Entre Tecidos Comprometidos e Não
Comprometidos por Câncer de Próstata. ... 121
Figura 36: Expressão Relativa de Decorim Entre Tecidos Comprometidos e Não
Comprometidos Por Câncer de Próstata. ... 122
Figura 37: Co‐Localização de Decorim e Mmp‐1 Em Cortes de Tecidos Comprometidos e Não
Comprometidos Por Câncer de Próstata. ... 124
Figura 38: Co‐Localização de Tgf‐β e Biglicam em Cortes de Tecidos Comprometidos e Não
Comprometidos Por Câncer de Próstata. ... 128
Tabela 1: Principais Tipos de Dissacarídeos Presentes em Glicosaminoglicanos ... 3
Tabela 2: Características Estruturais e Localização de Alguns PGs ... 8
TABELA 3: Funções Moduladas pelos SRLPs Decorim, Biglicam e Lumicam... 16
TABELA 4: Fenótipo de Animais Knockout para os Genes dos SRLPs ... 17
TABELA 5: Substratos, Ativadores Exógenos e a Capacidade de Ativação das Metaloproteinases. ... 25
Introdução
1
Introdução
1.1 Matriz extracelular
A matriz extracelular (MEC) oferece suporte e envolve as células em metazoários.
Apresenta uma estrutura supramolecular extremamente complexa, influenciando a
estrutura, viabilidade e funções de células e tecidos. Os componentes da MEC podem
influenciar múltiplas propriedades e funções das células diretamente ou através de seus
produtos de degradação, podendo assim modificar o microambiente celular e tissular
(Libby, 2007). As interações epitélio‐mesenquimais ou epitélio‐estromais são de função
essencial tanto em funções fisiológicas quanto processos patológicos como, por exemplo,
morfogênese embrionária (Adams and Watt, 1993; Grobstein, 1955), cicatrização (Grinnell,
1992) e tumorigênese (Chiquet‐Ehrismann, 1993), sendo acompanhadas por mudanças
dinâmicas, gerando novas interações célula‐matriz (Ekblom et al., 1990; Prieto et al., 1990).
1.2 Glicosaminoglicanos
Os glicosaminoglicanos (GAGs) são importantes constituintes da MEC. São
polissacarídeos lineares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas compostas por
uma hexosamina (D‐glucosamina ou D‐galactosamina) e um açúcar não‐nitrogenado (ácido
D‐glucurônico, ácido L‐idurônico ou D‐galactose), unidos entre si por ligações glicosídicas
(Figura 1). O tipo da hexosamina, o tipo do açúcar não‐nitrogenado e o tipo (α ou β) e
posição relativa (1→3 ou 1→4) da ligação glicosídica discriminam os diferentes tipos de
GAGs (Tabela 1). Existem 6 tipos: heparina, heparam sulfato (HS), dermatam sulfato (DS),
condroitim 4‐ e 6‐sulfato (C4S, C6S), queratam sulfato (KS) e ácido hialurônico (AH) (Dietrich
Figura 1: Unidades estruturais dos glicosaminoglicanos
HO3SO OH
NAc NAc OH
O O
COOH
OH O OH
O O
COOH
OH OH O OH
O O COOH OH OH O HEPARINA CH2OSO3H CH2OSO3H OSO3H OSO3H CH2OSO3H NSO3H NSO3H NSO3H O O OH O COOH OH OH O O O COOH OH OH O O OH
R2 = H, SO3H R1 = Ac, SO3 H O
CH2OR 2
CH2OR 2 HEPARAM SULFATO
N - R1 N - R1 O OH OH OH O NAc O O OH OH OH O O NAc O CH2OSO3H
CH2OSO3H CH2O-R CH2O-R
R = H, SO3H QU ERATAM SULFATO OH
NAc NAc OH
ACIDO HIALURÔNICO O OH OH O O O COOH OH O O O COOH CH2OH CH2OH OH O COOH OH O O O COOH OH O O O CH2OH HO3SO DERMATAM SULFATO O COOH OH OH O NAc O O COOH OH OH O O NAc O O COOH OH OH OH O NAc O O COOH OH OH OH O O NAc O CH2OS3OH CH2OH CH2OH HO3SO CH2OSO3H HO3SO CONDROITIM 4 - SULFATO CONDROITIM 6 - SULFATO
Tabela
*(Samp GlcA, ác
1.2.1 Ác
ácido D β(1‐3) negativ
sulfataç
MEC fo
papel d
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1: Principai
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cido hialurô
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t al., 1997;
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A síntese do AH é realizada por três ácido hialurônico sintases (HASs), codificadas
pelos genes HAS 1 a 3 (HAS 1, HAS 2, HAS 3) (Laurent and Fraser, 1992). O AH sintetizado
pela HAS 3 apresenta massa molecular que varia de <2 X 105 Da a 3 X 105 Da, enquanto que
pela ação de HAS 1 e HAS 2, o AH sintetizado apresenta maior massa molecular (maior do
que 2 x 106 Da) (Itano et al., 1999). A biosíntese do AH ocorre na membrana plasmática
através da ação das HASs em UDP‐GlcNAc e UDP‐GlcA. As cadeias intermediárias (200‐1000
kDa) e longas (1000 kDa) de AH são expelidas da célula e ancoradas na superfície externa da
membrana através de proteínas ligantes de AH. O AH ancorado na superfície é então
catabolizado em cadeias menores, bioativas, através da ação de hialuronidases GPI‐
ancoradas (Hyal2, Hyal4 e PH20), ou catabolizado dentro da célula pelas hialuronidases
Hyal1 e Hyal3 (Nairn et al., 2007). As propriedades físicas e biológicas do AH são
influenciadas pelo tamanho da cadeia. O AH de alta massa leva à formação de um gel
altamente viscoso promovendo um estado de turgescência na MEC, o que a torna
altamente resistente a forças compressivas. Já o AH de baixa massa molecular estimula o
crescimento de células endoteliais, induzindo a angiogênese (Philipson and Schwartz, 1984).
Com exceção do AH, todos os GAGs ocorrem nos tecidos na forma de PGs, onde as cadeias
de polissacarídeos estão covalentemente ligadas a um esqueleto protéico.
1.2.2 Dermatam sulfato e condroitim sulfato
Os GAGs CS e DS são compostos que apresentam unidades alternadas de ácido β‐D‐
glucurônico (GlcA) ou ácido α‐L‐idurônico (IdoA) e N‐acetil‐D‐galactosamina (GalNAc). A
biossíntese dos PGs de CS/DS é caracterizada pelas etapas: (1) síntese do esqueleto
protéico; (2) adição de uma xilose a um resíduo específico de serina na cadeia polipeptídica,
através da ação da xilosiltransferase; (3) adição de duas galactoses ao resíduo de xilose,
através da ação das galactosiltransferases I e II; (4) adição de um resíduo de GlcA para
completar a região de ligação da cadeia de GAG, através da ação da glucuroniltransferase I
(GlcUAβ1→3Gal β1→3Gal β1→4Xilβ1→3Ser); (5) adição de um resíduo de GalNAc, através
da ação da N‐acetil‐galactosaminiltransferase I, para iniciar a cadeia do
galactosaminoglicano; (6) adições repetidas de resíduos de GlcA alternados com resíduos de
GalNAc para formar o heteropolímero, através da ação da condroitim sintase com
atividades de glucuroniltransferase II e N‐acetil‐galactosaminiltransferase II; (7) modificação
sulfotransferases (C‐4 e/ou C‐6 da GalNAc e em C‐2 do GlcA); e (8) epimerização de resíduos
de β‐D‐GlcA a α‐L‐IdoA, através da ação da D‐glucuronil‐C‐5‐epimerase (Prydz and Dalen,
2000; Silbert and Sugumaran, 2002; Sugahara et al., 2003). A atividade da D‐glucuronil‐C5‐
epimerase é o principal fator para a formação de DS nos tecidos (Tiedemann et al., 2001).
Todos os passos de síntese dependem do tecido ou do estado em que a célula se encontra,
tornando essas moléculas mais complexas.
A análise de CS/DS é muito útil para a verificação de suas quantidades e suas
características estruturais são de importante relevância em varias condições patológicas
(Stylianou et al., 2006). Estruturas obtidas por ressonância nuclear magnética e difração de
raios‐X demonstraram que a conformação do β‐D‐GlcA nos galactosaminoglicanos assume
preferencialmente a conformação 4C1 dos anéis piranosídicos, já a conformação do α‐L‐IdoA
varia dependendo de sua localização na cadeia polissacarídica, padrão de sulfatação e
substituintes dos resíduos de galactosamina adjacentes. Resíduos de IdoA internos podem
assumir tanto a forma de cadeira 1C4 quanto a forma de barco 2S0. Já, na extremidade
redutora da cadeia, a forma de cadeira 4C1 também pode ser encontrada. Esta flexibilidade
estrutural do IdoA facilita a interação com aminoácidos básicos e outras proteínas (Casu et
al., 1986; Ferro et al., 1990; Mulloy et al., 1993).
O isolamento e caracterização da especificidade de varias liases, sulfatases e
glicuronidases produzidas por bactérias permitem estudar as características estruturais dos
galactosaminoglicanos, pela análise dos tipos de dissacarídeos produzidos pela ação de
condroitinases. A condroitinase AC age sobre β‐N‐acetil‐hexosamina (GlcN ou GalNAc)
ligada apenas a resíduos de ácido β‐D‐glucurônico, reconhecendo portanto ligações
glicosídicas do CS, enquanto a condroitinase ABC degrada a hexosamina ligada a ambos GlcA
e IdoA, reconhecendo as ligações glicosídicas do CS e DS (Michelacci and Dietrich, 1975;
Sampaio and Nader, 2006; Suzuki et al., 1968).
1.2.3 Heparam sulfato
O HS é constituído por unidades alternadas de D‐glucosamina (GlcNAc) e ácido
urônico (D‐GlcA e L‐IdoA) unidas por ligações glicosídicas do tipo α(1‐4). A glucosamina pode
estar N‐acetilada ou N‐sulfatada e/ou, ainda, O‐sulfatada na posição C‐6.
As cadeias de HS são covalentemente ligadas a um resíduo de serina/treonina do
CS/DS e HS (descrito no item 1.2.2). A síntese da cadeia do GAG de HS é iniciada após adição
do tetrassacarídeo: (1) uma N‐acetilglucosamina é adicionada pela ação das ‐N‐ acetilglucosaminiltransferases II e III (Extl 2 e 3); (2) a cadeia de HS é extendida pela ação
das ‐N‐acetilglucosaminil‐‐glucuronosil transferases I e II (Ext 1 e 2); e (3) polimerização dos dissacarídeos pela ação das enzimas Ext1, Ext2, Extl1 e Extl3 (Nairn et al., 2007).
Cadeias de HS podem ser degradadas por uma classe de endo‐hidrolases conhecida
como heparanase, uma endo‐β‐glucuronidases que cliva β‐D‐glucuronil (1→4) D‐
glucosamina N‐acetilada. As liases que clivam GAGs (heparitinase I, heparitinase II e
heparinase) agem sobre as cadeias polissacarídicas quebrando as ligações glicosídicas por β‐
eliminação, restando somente um ácido urônico livre na extremidade não‐redutora da
cadeia (Dietrich et al., 1983; Dietrich et al., 1998; Sampaio and Nader, 2006; Tersariol et al.,
1994). O HS, o CS e o DS participam de uma grande variedade de processos biológicos
incluindo interações célula‐MEC, crescimento celular, diferenciação celular, e transformação
maligna devido à capacidade de se ligarem e modularem importantes moléculas para o
desenvolvimento celular, tais como TGF‐β(transforming growth factor beta), FGF (fibroblast
growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), entre outros (Sampaio and
Nader, 2006).
1.2.4 Queratam sulfato
O KS é constituído por unidades alternadas de D‐glucosamina (GluNAc) e galactose
(Gal). Entre os GAGs, apenas o KS não se liga ao esqueleto protéico de modo convencional,
sua ligação pode ocorrer de duas formas, sendo estas responsáveis pela distinção entre eles.
O KS do tipo I se liga por ligação N‐glicosídica entre uma N‐acetilglucosamina e a amida da
cadeia lateral da asparagina. O KS do tipo II se liga por ligação O‐glicosídica entre N‐
acetilgalactosamina e o grupo hidroxila de serina/treonina.
O KS é um importante constituinte de diversos tecidos ricos em colágeno, e é o GAG
mais abundante na cornea, onde encontra‐se N‐ligado a residues de asparagina nos PGs
lumicam, keratocam e mimecam. Os PGs de KS são cruciais para a manutenção da estrutura
normal da cornea em várias espécies (Bettelheim and Plessy, 1975; Chakravarti et al., 1998;
Liu et al., 2003; Meij et al., 2007). A quantidade de KS aumenta na córnea durante seu
situações patológicas, como, por exemplo, cicatrização da córnea, um aumento excessivo na
quantidade de KS da córnea está associado a perda de transparência e opacidade da córnea.
1.3 Proteoglicanos
1.3.1 Proteoglicanos de matriz extracelular
Os PGs de MEC são classificados de acordo com a homologia, bem como com o tamanho
do esqueleto protéico. Assim, temos a família dos Hialectans (Tabela 2), na qual são
exemplos o agrecam e o versicam formados por PGs com esqueleto protéico de alta massa
molecular constituído por 3 domínios globulares na região N‐terminal (Iozzo and Murdoch,
1996), e apresentam a seguinte organização dos domínios peptídicos:
Domínio de ligação ao AH (HABR) ‐ hyaluronic acid binding domain;
Domínio de ligação aos GAGs;
Repetições semelhantes ao fator de crescimento epidermal EGF – epidermal growth factor‐like repeat;
Módulo semelhante à lectina (LEC) – type lectin like module;
Módulo semelhante à proteína regulatória do complemento (C) – complement
regulatory protein‐like module.
Outra classe de PGs de MEC é a família dos PGs pequenos com repetições ricas em
leucina (small leucine‐rich proteoglycans, SLRPs, Tabela 2), que possuem cadeia protéica de
baixa massa molecular (aproximadamente 40 kDa), constituída por grandes seqüências
consenso ricas em leucina. Entre os PGs pertencentes a esta família, pode‐se citar o
decorim, biglicam, fibromodulina, lumicam.
Dentre os PGs de membrana basal, estão as famílias do perlecam e do agrim (Tabela 2),
que possuem cadeia protéica de alta massa molecular com domínios semelhantes a
laminina (domínio III) e ao N‐CAM (neural cell adhesion molecule), entre outros.
Tabela 2: Características estruturais e localização de alguns Proteoglicanos
Nome Tamanho do
esqueleto protéico
(kD)
Tipo de GAG
N° de cadeias
Localização Ref.
Família Hialectans ou lecticans
Agrecam ~220 CS, KS 20‐30 Cartilagem, SNC e
vasos sangüíneos
MEC Esko, 1991; Iozzo,
1998
Brevicam ~100 CS 1‐3 SNC MEC Iozzo e Murdoch,
1996; Iozzo, 1998
GPI‐brevicam 64 CS 0‐5 SNC SC Seidenbecher e col.,
1998
Neurocam ~136 CS 3‐7 SNC e cartilagem MEC Iozzo e Murdoch,
1996; Iozzo, 1998
Versicam 5/26‐360 CS, DS 10‐30 SNC e tecidos
embrionários
MEC Landolt e col., 1995;
Iozzo, 1998
Família dos proteoglicanos pequenos ricos em leucina
Biglicam 38 CS, DS 1‐2 Tecido conjuntivo,
SNC
MEC Fisher e col., 1989;
Esko, 1991; Stichel e col., 1995; Iozzo,
1998, 1999
Decorim 36 CS, DS 1 Tecido conjuntivo,
SNC, ossos e
dentes
MEC Stichel e col., 1995
Epificam 35 CS, DS 2‐3 Cartilagem
epifisária
MEC Shinomura e
Kimata, 1992; Iozzo, 1998, 1999
Fibromodulina 42 KS 2‐3 Adesão celular e
fibrinogênese
MEC Oldberg e col.,
1989; Esko, 1991; Iozzo, 1998, 1999
Lumicam 38 KS 3‐4 Córnea, intestino,
fígado, músculo e
cartilagem
MEC Esko, 1991;
Blochberger e col., 1992; Iozzo e
Murdoch, 1996;
Iozzo, 1998, 1999
Mimecam ou
osteoglicina
35 KS 2‐3 Córnea e tecidos
conjuntivos
MEC Funderburgh e col.,
1997; Iozzo, 1998,
1999
Osteoaderina 42 KS 2‐3 Ossos MEC Sommarin e col.,
1998; Iozzo, 1998,
1999
PRELP 44 KS 2‐3 Tecido conjuntivo MEC Bengtsson e col.,
1999
Família do fosfacam/RPTP
Fosfacam 173 CS, KS 3‐4 SNC MEC Maurel e col., 1994;
Grumet e col.,
1996; Garwood e
col., 2003
RPTP 253 CS 3‐4 SNC SC Maurel e col., 1994;
Garwood e col.,
2003
Família dos
sindecans
22‐88 HS, CS 2‐3 Epitélio,
fibroblasto,
endotélio, sistema
nervoso e células
musculares lisas
SC Castillo e col., 1987;
Nader, 1991;
Bernfield e col., 1992, 1999
Família dos
glipicans
62 HS 2‐4 Epitélio,
fibroblasto e SNC
SC Esko, 1991,
Bernfield e col.,
1999
Proteoglicanos facultativos
Colágeno a2 (IX) 68 CS, DS 1 Cartilagem e
humor vítreo
MEC Esko, 1991
Apicam 75‐83 CS 1 SNC SC Shioi e col., 1995
Integrina 51 nd CS, HS nd Célula de
melanoma
humano (Mel‐85) e células CHO
SC Veiga e col., 1997;
Franco e col., 2009
Betaglicano 110 CS, HS 0‐4 Fibroblastos SC Ruoslahti e
Yamaguchi, 1991;
Wang e col., 1991
CD44 32‐38/49 CS, HS 0‐4 Linfócitos e
epitélio
SC Stamenkovic e col.,
1989; Iozzo e
Murdoch, 1996
Neuroglicam‐C 56 CS 3‐5 SNC SC Oohira e col., 2004
Receptor de
transferrina
2‐90 HS 4‐6 Fibroblastos SC Fransson e col.,
1984
Trombomodulina 58‐60 CS 0‐1 Endotélio SC Esko, 1991
Outros proteoglicanos
Testicam 44 CS, HS 1‐2 Testículos e
cérebro
MEC Alliel e col., 1993;
Iozzo e Murdoch,
1996
Agrim 250 HS 3 Junções
neuromusculares,
MB renal e de
MB Tsen e col., 1995;
pulmão Cotman e col., 1999
Bamacam ~138 CS 3 Praticamente
todas as MBs, exceto dos
glomérulos
MB Wu e Couchman,
1997; Iozzo, 1998
Leprecam ~220 CS nd MBs dos vasos
sangüíneos e
musculatura lisa
MB Wassenhove‐
Mccarthy e
Mccarthy,1999
Perlecam 400‐467 HS, CS 3 MB e cartilagem MB Hassel e col., 1980;
Iozzo, 1998
NG2 300 CS 2‐3 Células neurais e
mesenquimais
SC Esko, 1991,
Stallcup, 2002
GAG: glicosaminoglicano; CS: condroitim sulfato; DS: dermatam sulfato; HS: heparam sulfato, KS: queratam sulfato; MEC: matriz extracelular; SC: superfície celular; MB: membrana basal.
1.3.2 Proteoglicanos de superfície celular
Analisando a versatilidade funcional e estrutural destes PGs, particularmente
associados à superfície celular, verificou‐se que muitas das interações entre célula e agentes
externos ocorrem mediadas por estes tipos de PGs. A versatilidade destas estruturas
garante a diversidade de interações que podem variar desde respostas inespecíficas, até
respostas altamente especializadas como, por exemplo, o controle do ciclo celular.
Os PGs são encontrados na superfície celular de 3 maneiras. Quando o core é uma
proteína integral de membrana, define‐se a família dos sindecans (Tabela 2). A porção
hidrofóbica da cadeia protéica está inserida na membrana através de um domínio protéico
transmembrânico (David, 1992). Por outro lado, o PG pode estar ancorado à membrana
através de uma âncora de GPI, contituindo a família do glipicans (Tabela 2) (Esko and
Lindahl, 2001; Filmus and Selleck, 2001). Ainda, o PG pode estar inserido na membrana por
interações não covalentes com os outros componentes da membrana ou pela cadeia
protéica (Clement et al., 1989) ou por interação com a cadeia glicosídica (Kjellen et al.,
1980).
O betaglicano é o receptor para o fator de crescimento TGF‐β (Tabela 2). Esse é um
proteoglicano facultativo que não necessita da cadeia de GAG para funcionar como receptor
(Boyd et al., 1990; Cheifetz and Massague, 1989). Acredita‐se que seu papel seja o de ligar o
TGF‐β para ser posteriormente apresentado ao receptor que irá acionar a transdução de
na MEC e está associado ao colágeno tipo I (Yamaguchi et al., 1990), podendo servir como
um reservatório de TGF‐β.
1.3.3 Proteoglicanos Intracelulares
O serglicim é um proteoglicano intracelular, armazenado em grânulos (Angerth et
al., 1990; Avraham et al., 1989b; Kjellen et al., 1989), tendo como característica principal um
esqueleto protéico constituído por seqüências repetitivas (serina‐glicina)n, podendo
apresentar cadeias de heparina (Hep) e CS (DS em menor freqüência), dependendo do tipo
celular. O serglicim ocorre em grânulos de plaquetas (Alliel et al., 1988; Nader, 1991), em
mastócitos (Angerth et al., 1990; Avraham et al., 1989a; Kjellen et al., 1989; Nader et al.,
1989), em basófilos (Avraham et al., 1989a), em eosinófilos (Rothenberg et al., 1988) e em
células NK (Natural killer) (Giorda et al., 1990).
1.3.4 Proteoglicanos pequenos ricos em leucina
Os SLRPs são componentes biologicamente ativos da MEC (Tabela 2), sendo
caracterizados estruturalmente por um core protéico de aproximadamente 40 kDa
contendo de 6 a 10 unidades ricas em leucina repetitivas, flanqueadas por domínios C e N
terminais ricos em cisteína (clusters de cisteína), ligados por pontes dissulfeto (Blochberger
et al., 1992; Fisher et al., 1989; Krusius and Ruoslahti, 1986; Oldberg et al., 1989) e
substituídos por cadeias de GAGs ligados covalentemente (Huxley‐Jones et al., 2007; Iozzo,
1998; McEwan et al., 2006; Schaefer and Iozzo, 2008). Os esqueletos protéicos podem ser
sintetizados na forma livre, N‐ligados a oligossacarídeos ou como PGs contendo cadeias de
CS, DS ou KS ligados covalentemente às proteínas via resíduos de serina (Gandhi and
Mancera, 2008; Iozzo, 1998).
Os SRLPs podem ser divididos em cinco classes, de acordo com a similaridade do
esqueleto protéico, pela presença, localização e número de regiões ricas em cisteína
(McEwan et al., 2006), pelo tipo de glicosilação, pela organização cromossômica e
homologia nos níveis protéico e genômico (Figura 2).
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Figura 2 O dend SRLPs e também organiz das cai adaptad mantém decorin aument
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2: Análise fi ograma de e proteínas m é mostrad
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çúcar se
omplexo
olágenos
protegendo‐as contra a clivagem proteolítica por diversas colagenases (Geng et al., 2006),
regulando a fibrilogênese e contribuindo para a manutenção das propriedades mecânicas
de permeabilidade da MEC.
Figura orienta A) Pele filamen delinea decorom colágen (AOGDK e1; Ver
domínio estão in da supe vermelh acessíve monôm esquerd
3: Seqüen ções confo e ventral d ntos de PGs
mento do m são dem no tipo I; a
KGEAGPSG) rmelho= D~
os não ligan ndicados co
erfície da fi has aponta el das confo mero (direita da, sendo n
ncias conse rmacionais de coelho, s ortogonais
padrão a‐ onstrados c as direções ) e2; Ciano=
~3.87 (KNG ntes utilizad omo nbs1 e
ibra, sendo ndo para o ormações d a). Para a c a seção cen
enso de co s de ligação , corada p s às fibras ‐e. B) As s
como band s N→C do = D~2.74 (A GDRGEOGPA
das como c nbs2. A rep o as visualiz o exterior). de um deco conformaçã ntral do dím
olágeno pa de decorom por azul cu
e subequen sequencias
as colorida colágenos OGDRGEOG AG) domíni
ontrole neg presentação zações da e
C) Renderiz rom no dím o Dec N→C mero. Adapt
ara os sítio m.
upromerôn ntemente c consenso s numa rep
de baixo GPOG) e1; A
io d. As p gativo nos c o central é v esquerda e
zação eletro mero Dec N→
C, o N‐term tado de (Org
os de ligaç
ico para d com acetato para ligaão presentação
para cima: Azul= D~3.7 osições uti cálculos de visualizada
da direita ostática da →C e Dec C inal é quas gel et al., 20
ção ao dec
demonstraç o de uracila o ao colág o da microf
Amarelo= 74AKGDRGE ilizadas com
docking m
a partir do são da fibr área de su C→N (esque e um monô 009)
corim e
