1. Desenvolver culturas de explantes (simpático e GRD) ou purificadas de neurônios periféricos (simpático) como biosensores da atividade trófica dos meios condicionados (MCs) retinianos.
2. Caracterizar o efeito trófico de MCs sobre neurônios simpáticos de pinto isolados em cultura identificando algumas das vias de sinalização ativadas pelo conjunto de moléculas secretadas pelo tecido retiniano.
3. Purificar glia de Müller a partir de culturas de retina total (neurônios + glia) de embriões de pinto e camundongo e investigar o efeito trófico dos MCs por culturas purificadas de glia de Müller em neurônios periféricos (simpático e GRD) e centrais (CGRs).
4. Purificar uma população de neurônios centrais, as CGRs, de camundongo pelo método denominado de imunopurificação (immunopanning - Barres et al., 1988) e investigar o efeito trófico do MC por glia de Müller sobre a sobrevivência e a neuritogênese destas células isoladas em cultura em diferentes substratos de adesão.
5. Fracionar e concentrar o MC por glia de Müller no intuito de isolar frações que induzem sobrevida e/ou neuritogênese em neurônios periféricos e centrais.
6. Estudar as propriedades regenerativas do MC por glia de Müller de embrião de pinto em neurônios periféricas (GRD) e centrais (motoneurônios) de ratos adultos num modelo de transecção do nervo ciático (in vivo).
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS E REAGENTES
Ácido ascórbico, fatores tróficos, anticorpos, Hoesch 33328, merosina, poli-L-lisina, Dnase tipo I e II, Albumina bovina sérica (BSA, do inglês, Bovine Serum Albumin; Sigma), laminina (Invitrogen, SP), tripsina, papaína e solução de ovomucóide (Wortington Biochemical Corporation), Soro Fetal Bovino (SFB) GIBCO ou do Biocampo. Fator de crescimento do nervo (NGF 2.5S;
Invitrogen, SP). Meio de cultura celular, meio basal de Eagle (BME do inglês, Basal Medium Eagle) e Meio basal de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM do inglês, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Invitrogen, SP), Cloridrato de Xilazina (Rumpom, Bayer), Cloridrato de Quetamina (Vetaset, Fort Dodge Laboratories), bis-acrilamida, SDS, Tris, metanol. Placas de cultura (24 poços, 4 poços, 35mm, 60mm ou 90mm Nunc ou Corning preferencialmente). Filtros Centricon ® (Millipore Corporation). Solução de Matrigel ® (Collaborative Biomedical Products). Para os experimentos de imunopurificação utilizamos placas sem tratamento, seguindo a orientação do protocolo descrito pelo Dr. Ben Barres (Universidade de Stanford, EUA). Os demais sais utilizados na parte experimental desta tese, seja no Laboratório de Neuroquímica, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF), Instituto de Bioquímica Medica (BioqMed) ou no Departamento de Anatomia Humana e Genética, em Oxford, foram de pureza Analítica.
3.2 SOLUÇÕES
PBS completo (136 mM de cloreto de sódio, 2.7 mM de cloreto de potássio, 8 mM de fosfato dibásico de sódio, 1.47 mM de fosfato monobásico de potássio, 0.68 mM de Cloreto de Cálcio e 0.49 mM de Sulfato de Magnésio, pH 7.4).
Solução de Ponceau S (0.1% ponceau, 5% ácido acético).
Solução salina livre de Ca2+ e Mg2+, CMF (131mM de cloreto de sódio, 4.09 mM de cloreto de potássio, 0.92 mM de fosfato dibásico de sódio, 0.45 mM de fosfato monobásico de potássio, 9.4 mM de bicarbonato de sódio e 12.2 mM de glicose).
TBS (Para 1L: 6,1g Tris, 9g NaCl, pH 7.6).
TTBS (TBS adicionado de 0,1% Tween-20).
Tampão de carregamento SDS 4x (0.25M Tris-HCl pH 6.8, 8% SDS, 30%
glicerol, 0.02% azul de bromofenol, 10% B-ME ou 0.3M DTT).
Tampão de corrida SDS (Para 1L: 3,03g de Tris base, 14,4g de glicina, 1g de SDS).
Tampão de lise (50mM Tris-HCl Ph 7,4, 1mM EDTA, 60mM pirofosfato de Na+).
Tampão de transferência (Para 1L: 25mM Tris pH8.5, 0,2M glicina, 20%
metanol. Aferir volume com água destilada).
3.3 PREPARAÇÃO DAS PLACAS DE CULTURA
Para melhor adesão dos neurônios ao plástico das placas de cultura, a superfície das placas foi incubada com solução de poli-L-lisina 10µg/ml por aproximadamente 12 horas (overnight). Após o período de incubação, as placas foram lavadas por três vezes com água Milli-Q estéril e completamente secas dentro da capela do fluxo laminar por 30 minutos . As placas então receberam solução de laminina (20 µg/mL) em meio DMEM por pelo menos 2 horas em estufa úmida com 5% CO2. A partir deste ponto as placas estavam prontas para receber as células. O excesso de solução de laminina foi aspirado pouco antes do plaqueamento das células.
3.4 OBTENÇÃO E CULTURA DOS NEURÔNIOS PERIFÉRICOS
Ovos embrionados de galinha White Leghorn estagiados segundo Hamburger e Hamilton (1951) foram obtidos de uma granja local (Tolomei) e mantidos em estufa à 38ºC em atmosfera úmida. Embriões de 10 dias (E10) foram sacrificados por decapitação para dissecação do GRD, ou da porção lombar para-vertebral da cadeia ganglionar do simpático. Para evidenciar a cadeia ganglionar do simpático o embrião foi aberto ventralmente e eviscerado tomando-se cuidado para não danificar as estruturas mais profundas onde se encontram os gânglios (figura 6). A dissecação dos gânglios foi feita com agulhas de tungstênio afinadas por eletrólise (Davies, 1989). A dissecação foi inteiramente realizada sob lupa em placa de Petri
com o embrião imerso em solução salina livre de Ca2+ e Mg2+ (CMF). Os gânglios isolados e livres de tecidos contaminantes foram postos em CMF adicionado de tripsina para uma concentração final de 0,05% e incubados à 37ºC por 12 minutos para posterior dissociação das células. Após tripsinização, os gânglios foram lavados uma vez com DMEM + 10% SFB e três vezes com CMF, centrifugados e dissociados mecanicamente em aproximadamente 1,5mL de CMF com pipeta Pasteur de ponta fina.
Figura 6. Esquema ilustrativo da localização anatômica da cadeia ganglionar do simpático (em vermelho) e do gânglio da raiz dorsal (bulbos para-vertebrais) em embrião de pinto.
A suspensão de células foi cuidadosamente aplicada em uma coluna de sedimentação (figura 7) preenchida com 60ml de DMEM + 10% SFB previamente preparada e mantida à 4ºC por pelo menos 12 horas. As células
permaneceram na coluna por 1 hora. O propósito desta coluna é separar por sedimentação diferencial, baseado na gravidade e complexidade dos corpos celulares, neurônios íntegros de células não neuronais e restos celulares gerados no processo de dissociação mecânica (pedaços de membrana), além de pedaços de tecido mal dissociados. A viscosidade do DMEM + 10% SFB mantido em baixa temperatura permite que os neurônios, mais pesados que as células satélites e restos celulares, atravessem um caminho mais longo na coluna e sejam encontrados em frações mais baixas que as células menores após uma hora. Da coluna foram coletadas 12 frações de aproximadamente 5mL, que foram analisadas sob microscopia ótica para confirmação da eficiência da separação das células e identificação das alíquotas enriquecidas em neurônios (figura 7). As alíquotas selecionadas foram misturadas e, se necessário, diluídas para uma concentração de 600 a 1000 células/mL. As células foram imediatamente plaqueadas nas placas previamente preparadas para cada condição experimental. Os MCs foram utilizados na proporção de 1:2 em relação ao DMEM (meio controle). A adição de NGF 2.5S na concentração de 10-20 ng/mL à cultura manteve a viabilidade de aproximadamente 90-95% dos neurônios viáveis após 48 horas e foi usado como controle positivo neste tipo de cultura. Culturas de neurônios mantidas apenas com DMEM + 10% SFB apresentaram menos que 5% de sobrevivência neuronal após 48 horas sendo esta condição utilizada como nosso controle negativo. Pelo menos quatro experimentos independentes em duplicata foram feitos para cada condição experimental.
Figura 7. Ilustração da coluna de sedimentação e exemplo fotográfico das frações obtidas após 1 hora de sedimentação da suspensão de células. As micrografias ilustram, no alto, restos celulares e pequenas partículas; no meio frações de interesse onde os neurônios estão contidos (observar a existência de prolongamento em alguns corpos celulares) e em baixo, pedaços de tecido mal dissociado.
Os gânglios utilizados no desenvolvimento desta tese ou foram utilizados na forma dissociada em células ou na forma de explantes, que foram que foram cultivados sobre os mesmo substratos de adesão utilizados para células isoladas (poli-L-lisina e laminina) para os ensaios de neuritogênese apresentados neste trabalho.
Retinas de camundongo também foram utilizadas na forma de explantes para ensaios de neuritogênese. Para tanto camundongos P1-P8 foram mortos por decapitação, tiveram os olhos removidos e enucleados para remoção da retina. A retina destes animais foi cortada em explantes de aproximadamente 1mm2 e cultivadas sobre o mesmo substrato de adesão utilizado para células isoladas.
3.5 CONTAGEM DE CÉLULAS
A quantificação da sobrevivência neuronal foi feita por contagem visual de neurônios aderidos numa placa quadriculada, com soma íntegro e liso e neuritos projetados (pelo menos 2 vezes maior que o soma) e aderidos em uma cultura de neurônios de baixa densidade celular (600-1000 células/placa de 35mm dispersos numa área de 12x12 mm2). Foram feitas duas contagens por placa, a primeira feita cerca de 4h após plaqueamento, quando os neurônios já estavam aderidos (é importante mencionar que na primeira contagem ainda não era possível observar projeção neurítica devido à ação da tripsina na dissociação do tecido). Esta primeira contagem foi a nossa referência do total de neurônios aderidos (100%). A segunda contagem foi feita 48 horas após o plaqueamento e revelou a percentagem de sobrevivência dos neurônios plaqueados. Os resultados foram expressos em percentagem do total de células plaqueado.
3.6 MEIO CONDICIONADO POR EXPLANTES DE RETINA
Embriões de pinto de 9 dias (E9) foram decapitados, seus globos oculares foram removidos, e imediatamente transferidos para uma placa de Petri com CMF. O cristalino e o humor vítreo foram removidos e descartados e a retina foi dissecada livre de epitélio pigmentar. A retina foi cortada em explantes de aproximadamente 1mm2 que eram mantidos em frasco Erlenmeyer em meio de cultura Meio Basal de Eagle (BME) + 10% de SFB por 4 dias em agitador orbital (70 r.p.m.) à 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2 (figura 8). Após quatro dias de condicionamento o meio foi coletado, filtrado estéril em filtro Millipore ® 0,22µm, adicionado com SFB (5%), e armazenado em freezer à -70ºC para posterior utilização.
Figura 8. Esquema do preparo do RCM. A retina é dissecada e cortada em explantes. Os explantes permanecem condicionando o meio por 4 dias em agitador orbital.
Após condicionamento o meio é filtrado e armazenado a -70oC para posterior análise.
3.7 MEIO CONDICIONADO POR GLIA DE MÜLLER DE CAMUNDONGO NEONATO
Camundongos SV129 do biotério do Departamento de Anatomia Humana e Genética (Oxford, UK) eram acasalados (1 macho jovem com pelo menos 8 fêmeas) que forneciam ninhadas semanalmente de 3-12 animais, que eram usados nos estágios determinados.
Camundongos P0-P2 foram sacrificados com dose letal de pentobarbital injetado intraperitonealmente. Após a morte os animais foram decapitados e tiveram os olhos removidos e enucleados sob lupa tendo a retina removida livre de epitélio pigmentado e humor vítreo. Inicialmente, foram feitas culturas diluídas (baixa densidade celular) de retina total que permaneceram em estufa úmida a 37oC, até que a glia atingisse confluência. Após confluência, estas culturas foram submetidas a um tratamento com 4mM de ácido ascórbico (concentração final) por aproximadamente 3 horas sendo observadas em intervalos de 30 minutos para monitoração da morte neuronal. Após lesão dos neurônios, a cultura foi lavada uma vez com CMF e meio de cultura neurobasal (NB) foi adicionado com suplemento B27 (Gibco) à cultura. No dia seguinte a cultura foi lavada mais uma vez com CMF e teve NB + B27 restabelecido. A partir deste ponto o que temos é uma monocamada de glia de Müller isenta de neurônios (figura 9). O sobrenadante desta cultura passou a ser coletado a cada 48 horas resultando em no máximo 3 coletas. O meio condicionado por estas culturas foi coletado, filtrado estéril e armazenado em alíquotas de 50mL em freezer
-70oC para posterior utilização. O MC obtido de culturas de glia de Müller de camundongo foi denominado MMG (do inglês, Mice Müller Glia).
Figura 9. Esquema de preparo do AMG ou MMG. As retinas são dissecadas, tripsinizadas, dissociadas e plaqueadas. Quando a cultura de retina total atinge confluência (A, C7) é tratada com solução de ácido ascórbico 4mM por 3 horas(B, C8). Após lesão dos neurônios e lavagens da cultura temos uma monocada de glia de Müller purificada (C).
Eventualmente algumas culturas apresentavam contaminação por microglia o que veio a ser evidenciado por marcação com isolectina B4 (um marcador isolado da planta Griffonia simplicifolia que se liga a glicoconjugados, que possuem terminal alfa-D-galactose, presentes na superfície da microglia e macrófagos) conjugada a fluoresceína. A contaminação veio a ser contornada através de várias lavagens consecutivas ou replaqueamento isto é, tripsinização e dissociação de uma
cultura de monocamada de glia de Müller contaminada com microglia e plaqueá-las novamente em nova placa.
3.8 MEIO CONDICIONADO POR GLIA DE MÜLLER DE EMBRIÕES DE GALINHA
Inicialmente, foram desenvolvidas culturas primárias de retina total (neurônios e glia). Para tanto, retinas de embrião de galinha E9 foram dissecadas livre de epitélio pigmentar em CMF, transferidas para tubo de ensaio e tripsinizadas por 12 minutos a 37oC, dissociadas mecanicamente e plaqueadas na proporção de 8 retinas E9 para 20 placas de 100mm (cerca de 20 milhões de células/placa de 100mm). A cultura foi mantida em estufa úmida em 5% CO2 em 8ml de DMEM + 10% SFB. A primeira troca de meio foi feita no dia seguinte ao plaqueamento (E9C1, idade embrionária de 9 dias, um dia de cultura) para remover as células não aderidas ou mortas, além de restos celulares oriundos da dissociação mecânica do tecido. A partir deste ponto foi feita uma troca de meio a cada 48 horas, até a obtenção de confluência pelas culturas (uma semana em média). Após a confluência, os neurônios foram eliminados com a adição de 4mM de ácido ascórbico (concentração final). Após aplicação do ácido, as culturas foram observadas em intervalos de aproximadamente uma hora para acompanhamento da morte neuronal. O tratamento foi de 3 horas, tempo suficiente para lesar os neurônios em sua totalidade. As culturas foram lavadas uma vez com DMEM, eliminando os resíduos de ácido ascórbico e os restos de membrana dos neurônios lesados, e incubada com DMEM + 10%
SFB por pelo menos 12 horas (overnight) à 37oC em estufa úmida de CO2. No dia seguinte, a monocamada de glia de Müller foi lavada por duas vezes com DMEM sem SFB e com a cultura livre de neurônios e soro, restituiu-se 8ml de DMEM sem SFB à cultura que foi mantida em estufa (figura 9). O MC pela glia foi coletado a cada intervalo de 48 horas. Este meio foi denominado
“meio condicionado sem soro” (MC-SFB). Foram feitas pelo menos duas coletas de MC por cultura. O meio foi filtrado estéril, aliquotado e armazenado em freezer a -70ºC para posterior utilização. Meio condicionado com soro (MC+SFB) também foi obtido da mesma forma, porém restitui-se meio com soro à cultura após eliminação dos neurônios com ácido ascórbico.
3.9 MEIO CONDICIONADO RADIOATIVO
O MC radioativo a partir de culturas purificadas de glia de Müller obtidas como descrito acima. A cultura sem soro foi incubada com DMEM livre de metionina (Gibco) adicionado de metionina radioativa (Met-S35). A cultura foi mantida em estufa a 37oC e o MC radioativo coletado após 48 horas de incubação.
Culturas de neurônios isolados do GSC de rato tratadas com MC radioativo interagem e internalizam moléculas radioativas que podem nos auxiliar na identificação das moléculas tróficas produzidas pela glia de Müller, já que grande parte dos receptores contendo tirosina cinase é internalizada com seus ligantes (Hendry et al., 1975). Com base nesta
característica, culturas de neurônios foram incubadas com o MC radioativo (previamente filtrado em tubos de microcentrífuga Centricon ® com filtro limitante para 10Kda e portanto depletado de MetS35 livre) por 24 horas na presença de inibidor de síntese protéica (ciclohexemida), e então lisadas com 70µl de tampão de lise, adicionado de inibidores de proteases.
Figura 10. Esquema do preparo do meio condicionado radioativo. DMEM com metionina marcada radioativamente é posto para ser condicionado pela monocamada de glia de Müller. O meio condicionado radioativo é posto em contato com uma cultura purificada de neurônios que vai internalizar algumas proteínas do meio que são possíveis candidatas a fatores neurotróficos. O extrato da cultura de neurônios é então aplicada separada por gel de poliacrilamida e relado por autoradiografia.
O extrato celular foi aplicado em mini-gel SDS-PAGE de 10% de acrilamida. As proteínas do extrato foram separadas por eletroforese e as
bandas radioativas evidenciadas por auto-radiografia do gel. Como não havia Met-S35 livre no MC apresentado à cultura de neurônios e como estes se encontravam na presença de um inibidor de síntese protéica, as bandas radioativas presentes no lisado da cultura de neurônios são provenientes da glia que incorporou Met-S35 e produziu proteínas marcadas tanto constitutivas quanto secretadas no MC (figura 10).
3.10 IMUNOPURIFICAÇÃO DE CGR DE CAMUNDONGO
O método de purificação de CGRs foi elaborado originalmente para imunopurificação de CGRs de rato utilizando-se do anticorpo Thy1.1 por Barres e colaboradores (1988). Nesse trabalho, adaptamos o método utilizando o anticorpo Thy1.2 (BD Biosciences Pharmingen, Cat# 553008) que permite a purificação de CGRs de camundongo. Placas de petri de plástico foram incubadas com solução do anticorpo primário purificado (anti-IgG de rato, 10µg/ml) em Tris 50mM pH9.5 por pelo menos 12h (overnight) à 4oC e então lavadas três vezes com solução salina tamponada de fosfato (PBS) em pH 7.2. De forma a evitar a interação inespecífica de células ao plástico, as placas foram incubadas à 37oC em solução de bloqueio (PBS + 0,2%
albumina sérica bovina, BSA) por 30 minutos antes de receber o anticorpo primário. Após bloqueio, as placas foram novamente lavadas três vezes com PBS e incubadas com solução de anticorpo monoclonal Thy 1.2 (ou anti-CD90.2, denominação alternativa) sem azida e baixo nível de endotoxina (NA/LE do inglês, No Azide and Low Endotoxin; clone 30-H12, isotipo de rato,
IgG2b, kappa) por 3 horas a 37oC. Após incubação, a placa foi novamente lavada três vezes com PBS. Para cada experimento, cerca de 10 retinas de camundongos P1 (1 dia pós-natal) foram dissecadas, lavadas com CMF e então incubadas em tubo de microcentrífuga (1,5 mL, eppendorf) com solução de papaína (20 unidades/mL) por 15 minutos a 37oC. Após incubação, a solução de papaína foi aspirada e as retinas lavadas em 500µl de solução de ovomucóide (inibidor da papaína). Após a lavagem, o sobrenadante foi removido e 250µl de ovomucóide + 0,4% dnase (tipos I e II) foram adicionados às retinas, que foram imediatamente dissociadas mecanicamente com micropipeta. A suspensão de células foi centrifugada a 2000 r.p.m. em microcentrífuga por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram novamente suspensas em 100µl de ovomucóide. Adicionou-se 1400µl de meio de cultura aos 100µl de suspensão de células em ovomucóide. O PBS da placa de petri previamente tratada com anticorpos foi removido e transferiu-se a suspensão de células (1500µl) para a placa. A placa foi mantida por 20-30 minutos a 37oC em estufa úmida de CO2. Durante o período de incubação das células, a placa foi levemente agitada a cada 5-6 minutos e observada em microscópio ótico para visualização das células aderidas (figura 11). A placa com as células foi lavada de 6 a 8 vezes com meio de cultura até que somente as células aderidas aos anticorpos, as CGRs, permanecessem na placa (figura 12). As CGRs foram removidas da placa com tratamento brando de tripsina 0,01%
por 5-8 minutos a 37oC e lavagem vigorosa com meio de cultura. Todo o meio foi coletado em tubo de 15 mL e centrifugado para recuperar as CGRs
isoladas. A partir deste ponto as CGRs (cerca de 5000) foram plaqueadas no substrato de adesão apropriado (laminina, merosina, lamina basal ou monocamada de glia de Müller).
A sobrevida das CGRs foi quantificada através de contagem visual de culturas de baixa densidade após 48, 72 ou 96 horas (dependendo do experimento) observadas sob microscópio de contraste de fase ou por imagens de fluorescência. Utilizamos a molécula Hoesch 33328, que tem afinidade por DNA e evidencia o aspecto nuclear mostrando se a célula está viável ou apoptótica com base na visualização da fragmentação do núcleo, assim como a molécula Diacetato de Fluoresceína (DFA), que é um éster e marca células viáveis, além de anticorpos específicos para marcadores gliais ou neuronais.
Figura 11. Ilustração esquemática do processo de imuno-seleção de células ganglionares da retina (CGRs). Esta técnica permite isolar um único tipo celular a partir da
suspensão de células de um tecido com base no reconhecimento, por meio de anticorpos, de epitopos específicos de superfície de determinados tipos celulares.
Neurobasal (NB) suplementado com B27 foi utilizado como controle negativo e NB + B27 adicionado dos fatores BDNF (50ng/mL) + CNTF (50ng/mL)+ forscolina (F - 5µM) (BCF) foi o controle positivo que manteve até 60 % das CGRs viáveis após 48 horas.
As micrografias de contraste de fase e fluorescência foram obtidas com o sistema Axiophoto da Zeiss.
Figura 12. Imuno-seleção de células ganglionares da retina (CGRs). As micrografias ilustram uma suspensão de células total da retina (A) e CGRs purificadas aderidas à placa após várias lavagens (B).
3.11 FRACIONAMENTO DO MEIO CONDICIONADO POR GLIA DE MÜLLER EM COLUNA DE HEPARINA
No fracionamento utilizamos lotes de MC sem soro devido à grande quantidade de proteínas presentes no soro. Cinqüenta mililitros de MC injetados manualmente com seringa em uma coluna de heparina (Hi-Trap Amersham-Biosciences, 5mL). O MC que passa através da coluna,
denominado fração livre (FF, free fraction), foi coletado para posterior análise. Antes de começar a eluição da fração ligada à coluna (BF, bound fraction) foi necessário primeiro remover as moléculas de eluição lenta, além do indicador vermelho de fenol presente no MC contido na coluna, para que a leitura à 214nm volte à linha de base equivalente a leitura do tampão fosfato utilizado como padrão. Para tanto a coluna foi conectada a um sistema Cromatografia Rápida de Proteínas (FPLC do inglês, Fast Protein Liquid Chromatography) e lavada por 1 hora com tampão fosfato 50mM, pH 7,2 com fluxo de 2mL/ minuto. O sistema FPLC é um sistema de bombas que permite gerar gradientes de acordo com a programação desejada e com a concentração dos tampões ou solventes carregados em cada uma das bombas. Após lavagem, uma alíquota do tampão que sai da coluna foi comparada com uma alíquota do mesmo tampão estoque quanto à absorbância à 214nm. A leitura de ambas as alíquotas após lavagem de 1 hora deve ser a mesma confirmando que a coluna está livre de moléculas de eluição lenta e somente moléculas aderidas a matriz de heparina permaneceram na coluna para posterior eluição com gradiente de NaCl.
Com a coluna lavada, foi aplicado um gradiente de NaCl à coluna visando eluir a BF. Utilizamos tampão fosfato 50mM, pH 7.2 na bomba A e o mesmo tampão adicionado de 2M de NaCl na bomba B. O sistema foi programado para estabelecer um gradiente linear de 0 a 1,5 M de NaCl em 40 minutos com fluxo de 2mL/minuto. Ao atingir 1,5mM, o programa alternou para bomba B (tampão fosfato + 2M NaCl) e lavou a coluna por 15 minutos. Para fim de manutenção da coluna após fracionamento do MC a coluna foi
lavada com 30 mL de tampão fosfato 50mM, 30 mL de água Milli-Q e 30 mL de solução de etanol 20% seqüencialmente. A coluna foi mantida em solução de etanol 20% para uso posterior.
O coletor automático do sistema foi programado para coletar frações de 2mL. A absorvância de cada alíquota foi medida a 214nm tendo o tampão fosfato como parâmetro (branco). As alíquotas de interesse foram dessalinizadas e concentradas em filtro Centricon ® de membrana de 10kDa e testadas quanto a sua atividade biológica em culturas de neurônios isolados da cadeia ganglionar do simpático (figura 13). Amostras das alíquotas com atividade em cultura foram submetidas à eletroforese em mini gel SDS-PAGE de concentração de 10% de poliacrilamida.
Figura 13. Esquema de fracionamento do AMG. Após lavagem a coluna é eluida com um gradiente de NaCl e as amostras coletadas a cada 1,5mL, dessalinizadas e testadas em culturas purificadas de neurônios para identificar as alíquotas com atividade trófica.
O pico obtido após eluição da coluna de heparina foi dividido em três partes (1, subida; 2, centro do pico; 3, descida; figura 14) e as alíquotas com atividade biológica da parte “1” do pico foram submetidas à eletroforese em mini gel a 10% de poliacrilamida 0,5 mm e corados por coomasie coloidal. As bandas mais evidentes foram cortadas, eluídas do gel e clivadas por tripsina própria para análise em espectrômetro de massas e submetidas ao sistema MALDI-TOF-TOF no núcleo de proteômica do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho para identificação de tais bandas protéicas (ver figura 45 na seção de resultados).
Figura 14. Esquema ilustrativo da setorização do pico. Na figura é mostrada a divisão das alíquotas com atividade trófica em três setores: (1) subida, (2) pico e (3) descida. A porção 1 do pico foi concentrada e submetida à análise em espectrômetro de massas.
3.12 ENSAIO DE REGENERAÇÃO in vivo
Ratos machos adultos (idade em torno de 3 meses) foram utilizados nos experimentos de transecção e reconexão do nervo ciático. Os animais foram anestesiados com éter, seguida de profunda anestesia intraperitoneal com cloridrato de xilazina 0,5% e cloridrato de quetamina 5%, utilizando-se 100μL de cada um dos anestésicos para cada 100g de peso do animal. O tempo de anestesia variou entre 20 a 30 minutos, não havendo necessidade de reaplicação.
O nervo ciático foi exposto através de incisão realizada na coxa direita. O acesso ao nervo foi feito através do afastamento da musculatura da coxa, atingindo-se então a fossa poplítea, por onde o nervo foi projetado em direção aos músculos da perna (solear, gastrocnêmio lateral e tibial anterior). Foi feita a completa transecção deste nervo à 1cm de sua região de bifurcação. Antes do início do procedimento cirúrgico, um segmento de tubo de polietileno com 7mm foi preparado de forma que através desse cilindro tínhamos o cruzamento de dois segmentos de linha de algodão comum. Antes da transecção, as linhas foram levemente amarradas ao nervo. Um espaço de aproximadamente 4mm foi deixado entre as amarras e a transecção foi feita neste espaço com auxílio de um bisturi. Imediatamente após a transecção, o nervo foi conectado ao tubo de tal maneira que aproximadamente 2mm do coto proximal e 1mm do coto distal foram inseridos no tubo. Ao final do procedimento, tínhamos um espaço de aproximadamente 4mm entre os cotos distal e proximal. Para cada
experimento, dois grupos experimentais foram utilizados e cada grupo foi composto por 3-4 animais.
No grupo controle, o espaço entre os cotos proximal e distal no interior do tubo de polietileno foi preenchido com solução de Matrigel ® em DMEM.
O volume total injetado por animal foi cerca de 15μL. No segundo grupo de animais foi injetada solução de Matrigel ® contendo MC total sem soro (AMG) na proporção de 1:3. As diferentes condições foram injetadas no interior dos tubos utilizando-se uma microseringa Hamilton com agulha sem bisel (figura 15). Estabelecidas as condições, os nervos conectados através do tubo foram acondicionados no interior da fossa poplítea e a incisão costurada com fio de sutura não absorvível (Clone I Nylon 5-0, Shalon Suturas).
Figura 15. Esquema ilustrativo da secção do ciático. Após o corte as extremidades do ciático são conectadas a um tubo de polietileno. Dentro do tubo são injetadas, cuidadosamente, as condições experimentais. No nosso caso, AMG, meio controle negativo ou positivo.
Logo após o procedimento cirúrgico foi possível observar severo comprometimento dos movimentos da pata cujo nervo foi seccionado.
Figura 16. Localização do cristal DiI. O cristal de DiI é posto a 4mm do coto distal.
Somente os axônios que regenerarem vão transportar partículas de DiI para o soma marcando a célula que regenerou.
Quarenta dias após o procedimento de secção do nervo ciático os animais foram novamente abertos para receber um cristal de DiI a 2mm do coto distal (figura 16). Os terminais provenientes da medula espinhal ou do GRD, cruzaram os 4mm entre os cotos distal e proximal e adentraram no coto distal atingindo o cristal de DiI, que foi transportado retrogradamente na forma de partículas para os corpos celulares, marcando as células que regeneraram após o corte. Após inserção do cristal, os animais foram novamente suturados e devolvidos ao biotério. Dois dias após inserção do DiI, os animais foram sacrificados para remoção do ciático, GRDs (na altura de L4 e L5) e cortes de medula espinhal para análise dos motoneurônios que foram mantidos em solução de 4% paraformaldeído por pelo menos 24
horas. Os tecidos foram incluídos em blocos de parafina para corte em micrótomo. No micrótomo foram feitos cortes de 12μm que foram montados em lamínulas pré-tratadas com poli-L-lisina e observados sob microscópio de fluorescência para identificação e contagem das células positivas para DiI.
3.13 IMUNOCITOQUÍMICA
As culturas submetidas à marcação imunocitoquímica foram reproduzidas em escala reduzida em placas de quatro poços (10mm cada poço, volume de 0,5mL).
Foram feitas três lavagens de 5 minutos em cada placa com PBS completo (todas as lavagens foram de 5 minutos). As culturas foram fixadas em metanol absoluto por 5 minutos. Para remoção do excesso de metanol as placas foram novamente lavadas três vezes com PBS. Em cada poço foi adicionado 200-300 µL de soluções de anticorpos primários preparados com 3% de BSA adicionado de 0,01% Tween 20 em PBS. As placas foram incubadas na geladeira sob constante agitação por 12 horas. Antes de incubar as culturas com os anticorpos secundários apropriados produzidos em camundongo (Ms) ou coelho (Rb) (IgG -FITC ou IgG-TRITC), as culturas foram lavadas três vezes com PBS e em seguida incubadas com soluções de anticorpos secundários, preparadas em PBS, por um período de 2 horas em uma estufa úmida a 37°C, 5% de CO2.
Passado o período de incubação as culturas foram novamente lavadas três vezes com PBS e mantidas em 500µL de PBS para observação em microscópio de fluorescência.
3.14 IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS (WESTERN BLOT)
Neurônios do GSC de ratos Wistar cultivados sob diferentes condições experimentais (CNTF, 50ng/mL; NGF 20ng/mL ou MMG diluído 1:2) em placas pré-tratadas com substrato de adesão apropriado (poli-L-lisina + laminina), ou mantidos em suspensão em tubos eppendorf, foram lisados com tampão de lise adicionado de inibidores de proteases e fosfatases (NP-40 1%;
Deoxicolato de sódio 0,25%; NaCl 15mM; ; PMSF 1 mM; aprotinina 5µg/mL;
pepstatina 5µg/mL; leupeptina 5µg/mL; NaF 1mM; Na3VO4 1mM) e coletados. As concentrações de proteína de cada amostra foram determinadas pelo método de Lowry (BioRad), utilizando albumina sérica bovina para construção da curva padrão. As amostras de cada condição foram diluídas em tampão de carregamento para uma concentração final de 2µg/µL de proteína, fervidas por 3 minutos e submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) numa concentração de 10% (p/v) recebendo 15µL em cada poço. As proteínas do gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose eletroforeticamente em cuba de transferência de imersão (BioRad) por 12 horas a 20V em câmara fria (4oC). A membrana de nitrocelulose foi incubada em solução de vermelho de Ponceau para verificar a eficiência da transferência e logo após lavada
com água deionizada. A membrana foi então incubada por 12 horas a 4oC com anticorpos primários monoclonais anti-rato produzidos em camundongo e cabra específicos contra fosfo-STAT3 (p-STAT3), fosfo-AKT (p-AKT), fosfo-ERKs (p-ERKs) e contra STAT3 total (controle de carregamento do gel) e bloqueada por 5 minutos com PBS 1% caseína. A incubação com os anticorpos secundários foi de uma hora a temperatura ambiente após lavagem com solução tamponada de Tris adicionada de 0,1% Tween (TTBS do inglês, Tween-Tris Buffered Saline). Os anticorpos secundários eram conjugados a fluoróforos (FITC ou TRITC) e o resultado foi analisado sob detector de quimioluminescência (Sistema Odyssey – Li-Cor Biosciences) de acordo com instruções do fabricante.
3.15 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Desde que não especificado, a maioria dos resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m.) de pelo menos três experimentos independentes realizados em triplicata. A análise estatística foi feita através do teste t de Student para dois grupos ou análise de variância (ANOVA) seguido do teste de comparação múltipla de Bonferroni para mais de três grupos com uma significância estatística de p<0,05.
4. RESULTADOS
4.1 RCM TEM EFEITO TRÓFICO EM NEURÔNIOS SIMPÁTICOS
É fato que a retina produz fatores diversos com atividade neurotrófica.
Em um estudo pioneiro realizado por Araújo e Linden (1993) foi mostrado que RCM de rato fornecia suporte trófico à células ganglionares da retina de ratos. Com base na diversidade de fatores produzida pela retina já descrita na literatura, investigamos, inicialmente a possibilidade de RCM de embriões de pinto E9 exercer efeito trófico em neurônios isolados do gânglio simpático de embriões de pinto E10, neurônios do SNP. Nesta idade embrionária estes neurônios ainda são neurotrofina dependentes sendo, portanto, um ótimo modelo para detecção do efeito trófico promovido por RCM. A sobrevivência induzida por RCM em culturas de neurônios isolados se mostrou bastante potente sendo equivalente ao controle positivo para este tipo celular. Cerca de 95% dos neurônios simpáticos entram em apoptose nas primeiras 48 horas se cultivados na ausência de NGF (figura 17A). Em contraste, NGF 10ng/mL mantém a viabilidade celular em torno de 80% na mesma escala de temporal (figura 17B). RCM condicionado na ausência de soro fetal bovino manteve a sobrevivência de neurônios simpáticos em torno de 50% (n=5) (figura 17C) enquanto quando condicionado na presença de 5% de SFB e utilizado numa diluição de 1:2 com DMEM (1 parte MC para 2 volume final) manteve a viabilidade celular próxima de 90% (n=30) (figura 17D).
Desta forma, nesta primeira parte do trabalho, todos os experimentos foram realizados com meio condicionado por retina de embrião de pinto na
presença de soro. O período de 48 horas foi o padronizado como tempo de duração dos experimentos com neurônios simpáticos visto que, em média, menos de 5% das células plaqueadas do grupo controle permaneceram viáveis após este período.
A proporção de SFB no RCM foi mantida fixa em todos os experimentos para eliminar qualquer variabilidade que possa estar sendo introduzida no sistema por qualquer um de seus componentes. Culturas mantidas por RCM nas diluições de 1:4 e 1:8 mantiveram 70 e 40% das células após 48 horas respectivamente. Após 96 horas, apesar de baixa, ainda é possível observar alguma atividade trófica em culturas tratadas com RCM na diluição 1:1, enquanto aproximadamente 95% das culturas controle (DMEM + SFB) sofrem apoptose ainda nas primeiras 48 horas (dado não mostrado).
Figura 17. Neurônios simpáticos na ausência de suporte trófico sofrem apoptose nas primeiras 48 horas, (A); na presença de NGF, neurônios simpáticos emitem neuritos extensos e grossos além de permanecerem, em sua grande maioria, viáveis após 48 horas, (B);
neurônios simpáticos também são mantidos por RCM com e sem SFB (C e D respectivamente), emitindo extensos neuritos, porém finos. Escala: 50μm.
Neurônios mantidos por NGF apresentam como característica, um corpo celular grande além neuritos calibrosos e longos. Já neurônios simpáticos tratados com RCM apresentam um corpo celular menor, com neuritos também longos, porém mais finos (figura 17A-D).
A ação combinada de NGF e RCM não apresentou acréscimo significativo na sobrevivência induzida por NGF sozinho (viabilidade em torno de 80%).
4.1.2 A SECREÇÃO DO FATOR RETINIANO NÃO É DEPENDENTE DO DESENVOLVIMENTO NEM DE EXCITABILIDADE ELÉTRICA DO TECIDO.
Sabendo que o perfil proteômico da retina se modifica ao longo do desenvolvimento questionamos a possibilidade de que RCMs de diferentes idades (desde embrião a um dia pós-natal) pudessem apresentar diferentes resultados quanto ao efeito trófico promovido em neurônios simpáticos. Para responder se o efeito trófico em questão é influenciado pelo desenvolvimento, RCM de diferentes estágios (E5 a P1) foram coletados e testados quanto à sua atividade trófica em neurônios simpáticos em cultura.
Não foi observada diferença significativa entre a atividade trófica dos diferentes RCMs, não sendo portanto regulada por desenvolvimento (figura 18). O efeito neuritogênico, visualmente, também se mostrou equivalente entre os neurônios tratados com os meio condicionados por diferentes estágios (dado não mostrado).
Figura 18. A liberação dos fatores tróficos retinianos que mantém neurônios simpáticos em cultura não é regulada durante o desenvolvimento. RCM preparado a partir de explantes retinianos de embriões (E5 a E16) e pós-natal 1 (P1) exibem semelhante atividade trófica.
Para avaliar o tempo mínimo necessário de condicionamento do meio, RCMs foram coletados em intervalos de tempo entre 30 minutos e 96 horas. Com este experimento observamos que 30 minutos de condicionamento do meio por explantes de retina é suficiente para manter cerca a viabilidade de cerca de 30% de neurônios simpáticos em cultura. O efeito observado é aumentado para cerca de 60% com 6 horas de condicionamento e é máximo após 12 horas de condicionamento (figura 19).
A excitabilidade elétrica do tecido nervoso, neste caso a retina, é outro fator que pode influenciar atenuando ou potencializando os efeitos
sobre a sobrevivência neuronal (GOLDBERG e BARRES, 2000). Para avaliar a influência da excitabilidade elétrica do tecido retiniano no efeito trófico promovido pelo meio condicionado, coletamos o sobrenadante de culturas de monocamada de glia de Müller na presença de 1µM de tetrodotoxina (TTX, um bloqueador de canais de sódio voltagem-dependente), 100µM de CNQX (6-ciano-7-nitroquinoxalina-2, 3 diona, um potente antagonista competitivo de receptores AMPA/Kainato) e 2µM de MK801 (um potente antagonista não-competitivo do receptor NMDA voltagem dependente, bloqueia canal aberto). Como se pode observar no gráfico (figura 19) a adição de TTX, CNQX e MK801 não interferiu com a ação trófica de RCM sobre neurônios simpáticos.
Figura 19. A liberação dos fatores tróficos retinianos independe de atividade elétrica do tecido retiniano e de ativação glutamatérgica. RCM foi secretado de forma rápida e mesmo na presença de bloqueadores de canais de Na+ dependente de voltagem e de inibidores de receptores glutamatérgicos ionotrópicos. Como se pode observar do gráfico, 12 horas de condicionamento são suficientes para atividade trófica máxima de RCM.