MAURÍCIO E CASTRO CABRAL DA SILVA
“A GLIA DE MÜLLER COMO FONTE DE FATORES TRÓFICOS PARA NEURÔNIOS
CENTRAIS E PERIFÉRICOS”
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU
DE DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho RIO DE JANEIRO, 11 DE ABRIL DE 2007
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CABRAL-DA-SILVA, Maurício e Castro.
A Glia de Müller Como Fonte de Fatores Tróficos Para Neurônios Centrais e Periféricos
Orientador: Ricardo Augusto de Melo Reis Rio de Janeiro, UFRJ/IBCCF, 2007.
X, 159 52f. 2t.
Tese: Doutorado em Ciências Biológicas (Biofísica). Universidade do Brasil - UFRJ/IBCCF - Programa de Neurobiologia, Laboratório de neuroquímica.
1. Glia de Müller; 2. Fatores Tróficos; 3. Neurônios Simpáticos de embrião de pinto; 4. Células Ganglionares da Retina; 5. Sobrevivência Neuronal In vitro.
Esta dissertação foi elaborada durante a vigência de auxílio financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e do Wellcome Trust (Reino Unido).
DEDICATÓRIA
Ao Leandro,
Meu irmão, amigo e compadre.
Ì
6 de Abril de 1978 -
†18 de Janeiro de 2007
Você faz falta...
AGRADECIMENTOS
A todos que de alguma forma contribuíram com a conclusão desta dissertação...
A minha esposa que foi capaz de compreender que, durante o período em trabalhei nesta dissertação, ficou em segundo plano.
A minha esposa novamente por, mesmo em segundo plano, ter me ajudado a formatar a dissertação …
...Obrigado!
EPÍGRAFE
“É tão estranho, os bons morrem jovens.
Assim parece ser quando me lembro de você.
Que acabou indo embora, cedo demais...
... Eu continuo aqui, meu trabalho e meus amigos E me lembro de você em dias assim
dia de chuva, dia de sol
E o que sinto eu não sei dizer...
...Só que este ano o verão acabou Cedo demais...”
Renato Russo Love in the afternoon Álbum: O Descobrimento do Brasil, 1993
SUMÁRIO
Resumo ix
Abstract x
Lista de figuras e tabelas xi
Lista de abreviaturas xiii
1.Introdução 14
1.1 Fatores Neurotróficos 16
1.1.2 Receptores para fatores tróficos 22 1.2 Tipos de morte celular_________________________ ______________ 26 1.2.1 Regulação da apoptose 27 1.2.2 Apoptose em neurônios simpáticos_ 32 1.3 Estrutura da retina_______________________ ________________ 35
1.3.1 Células ganglionares da retina _______________________________ 39
1.3.2 Fatores tróficos retinianos_____ ______________________ _______ 40
2. Objetivos_______ __________________________________________________ 42 3. Materiais e métodos____ _____________________________ ______________ 45 3.1 Materiais e reagentes_____________________ _____________________ 46 3.2 Soluções______ _________________________________________________ 47 3.3 Preparação das placas de cultura_____________________ _________ 48 3.4 Obtenção e cultura dos neurônios periféricos____ _______________ 48 3.5 Contagem de células___________________________________ 52 3.6 Meio condicionado por explantes de retina____________ ________ 53 3.7 Meio condicionado por glia de Müller de camundongo neonato 54 3.8 Meio condicionado por glia de Müller de embriões de galinha___ 56 3.9 Meio condicionado radioativo______________________________ 57 3.10 Imunopurificação de CGR de camundongo___________________ 59 3.11 Fracionamento do meio condicionado por glia de Müller em
coluna de heparina 62
3.12 Ensaio de regeneração in vivo________________ 66
3.13 Imunocitoquímica________ 69
3.14 Imunodetecção de proteínas (western blot) 70
3.15 Análise estatística____________ 71
4. Resultados_______________________________________________ 72 4.1 RCM tem efeito trófico em neurônios simpáticos 73 4.1.2 A secreção do fator retiniano não é dependente do desenvolvimento nem de excitabilidade elétrica do tecido 75 4.1.3 O efeito trófico promovido por RCM não é devido à ação
individual de neurotrofinas 78
4.1.4 Atividade trófica do RCM é mantida após diálise, é retida em coluna de heparina e é sensível a temperatura
82 4.1.5 RCM induz sobrevivência sinalizando pelas vias da Pi3K e JAK2
mas não pela via das ERKs 84
4.1.6 A liberação de fator retiniano depende de eventos mediados
neurotrofinas 86
4.1.7 A atividade trófica promovida por RCM não é bloqueada com anticorpos bloqueadores anti-TGF-β, anti-GDNF nem anti-CNTF 86 4.2 Cultura de células de Müller purificadas de camundongos 88 4.2.1 MMG ativa as vias da pERK, pAKT e pSTAT3 simultaneamente em neurônios do gânglio superior cervical de ratos 90 4.2.2 MMG possui componente ativo que se liga a heparina, potente ação trófica em neurônios simpáticos de ave que não foi abolida por anticorpos bloqueadores anti-NT3, anti-GDNF ou anti-CNTF
92
4.2.3 Fatores tróficos da glia de Müller de camundongos induzem
neuritogênese e sobrevivência das CGRS 93
4.2.4 Monocamada de glia de Müller é um excelente substrato
para a sobrevida das CGRs__ ___ 99
4.2.5 Fatores tróficos secretados por células de Müller induzem proliferação de glia de Müller de camundongos 101 4.2.6 Meio condicionado radioativo 103 4.3 Culturas de células de Müller purificadas de pinto 105 4.3.1 AMG apresenta atividade trófica tanto na fração que se liga
à heparina quanto na fração livre______ 106
4.3.2 Fracionamento do AGM em coluna de heparina 108 4.3.3 AMG induz migração de células de Schwann a partir de explantes de nervo ciático de ratos adultos 113 4.3.4 AMG induz regeneração de neurônios periféricos e centrais 115
5. Discussão________________________ 120
6. Conclusões________________________________ 134 Referências bibliográficas______________________ 135
Anexo_________________________ 155
RESUMO
A sobrevivência de neurônios do Sistema Nervoso Periférico (SNP) e Central (SNC) depende de fatores tróficos sintetizados e secretados por alvos biológicos. Por outro lado, células de glia de Müller influenciam e são influenciadas por atividade neuronal na retina. Nós investigamos a atividade trófica de meios condicionados (MC) obtidos de culturas purificadas de glia de Müller de embrião pinto e camundongo pós-natal em culturas purificadas de neurônios simpáticos de pinto e rato, e em células ganglionares da retina (CGRs) de camundongos pós-natal. Também estudamos as propriedades regenerativas desses fatores num modelo de transecção do nervo ciático de rato. As culturas purificadas de glia de Müller de camundongo foram positivamente marcadas com anticorpos anti-vimentina, anti-GFAP e anti-S- 100, mas foram negativas para anticorpos contra marcadores neuronais.
Meio condicionado de retina (RCM, obtido de explantes de retinas de 11 dias mantido por 4 dias) manteve 90% de neurônios simpáticos (E10) em cultura por 48h, comparado com < 5% do controle (meio DMEM +10% soro fetal bovino). Meio condicionado de glia de Müller de aves (AMG) manteve 100% de neurônios simpáticos viáveis por 48 horas in vitro seu o efeito trófico não foi bloqueado por anticorpos anti-NGF e anti-NT3 ou com o uso de receptores TrkA, B ou C solúveis usados independentemente. Além disso, BDNF ou NT4 (0.1-50ng/ml) não apresentaram efeitos tróficos sobre neurônios simpáticos. O efeito trófico não foi bloqueado por anticorpos anti-GDNF, anti-TGFβ, e anti-CNTF e não foi mimetizado por FGFb (0.1-10nM). LY294002, um inibidor da Pi3Cinase (50μM), mas não PD098059 (inibidor das MAPCinases), bloqueou a sobrevida de neurônios simpáticos induzido por RCM ou AMG.
Meio condicionado de glia de Müller de camundongos (MMG) também manteve a viabilidade de 100% de neurônios simpáticos de pinto, e de rato após 48 horas em cultura. MMG estimulou as vias de AKT, ERK e STAT3 em neurônios simpáticos, efeito não bloqueado por anticorpos anti-NGF ou anti-CNTF. MMG promoveu crescimento neurítico em explantes de retinas P4 de camundongos, e foi tão efetivo quanto BDNF + CNTF + forscolina (BCF, 45% sobrevida em culturas após 72h, comparado com a condição controle + forscolina). As CGRs plaqueadas sobre a monocamada de células de Müller apresentaram uma sobrevida maior (>80%, 72h) que a observada quando estas eram plaqueadas sobre laminina e poli-L-lisina.
AMG induziu sobrevida e regeneração de células do gânglio da raiz dorsal (GRD) e motoneurônios no segmento L4/5 de ratos adultos cujos nervos ciáticos foram seccionados, porém não teve efeito nem na sobrevida nem na neuritogênese de CGRs de camundongo em cultura.
Em conclusão, nossos resultados mostram que a atividade trófica de moléculas solúveis produzidas por células de Müller em cultura é capaz de manter a viabilidade de diversas populações de neurônios periféricos e centrais in vitro e in vivo, além de promover neuritogênese.
ABSTRACT
Neuronal survival in the vertebrate peripheral or central nervous system depends on neurotrophic factors available from target tissues. Müller glia cells influence and are influenced by neuronal activity throughout the retina. We have examined the trophic effects of conditioned media obtained from purified chick or mice Müller glia cells on purified sympathetic chick embryos neurons and retinal ganglion cells (RGCs) from postnatal mice. We also studied regenerative properties of these factors on a sciatic nerve transection model on adult rats. Purified chick and mice Müller glia cultures were obtained from whole retina cultures. Mice Müller glia were positive for vimentin, GFAP or S100, but negative for neuronal markers. Retina conditioned media (RCM) from explants of embryonic day 11 retinas maintained for 4 days in vitro supported 90% of E10 chick sympathetic neurons after 48 hours. Conditioned medium from purified Avian Müller Glial (AMG) cells supported nearly 100% of E10 chick sympathetic neurons. Anti- NGF (1μg/ml) blocked the survival effect of NGF, but did not block the trophic effect of RCM or AMG. Neither BDNF nor NT4 (0.1-50ng/ml) supported E10 sympathetic neuron survival. Incubation of chimeric immunoglobulin- receptors TrkA, TrkB or TrkC had no effect on RCM or AMG induced sympathetic neuron survival. The survival effects were not blocked by anti- GDNF, anti-TGFβ, and anti-CNTF and were not mimicked by FGFb (0.1-10nM).
LY294002 at 50μM (a Pi3K pathway blocker), but not PD098059 at 50μM (a MAPKs pathway blocker) blocked sympathetic survival induced by RCM.
Mice Müller Glial conditioned medium (MMG) also supported 100% of the survival of chick or rat sympathetic neurons after 48h compared to < 5% in controls. MMG stimulated AKT, ERK and STAT3 in sympathetic neurons, and this effect was not blocked by anti-NGF or anti-CNTF blocking antibodies. MMG induced neurite outgrowth in P4 mice retina explants and was as effective as BDNF + CNTF + forskolin (45% survival, 72h compared to 8% control). RGCs plated on top of Müller glia cells had a much better survival rate (>80%, after 96h) compared to laminin + poly-L-lysine substrates. Avian Müller Glial conditioned medium (AMG) induced survival and regeneration of L4/5 DRG and motoneurons in vivo, but had no effect on mice RGCs survival or neuritogenesis in vitro.
In conclusion, we show that purified Müller glia culture secrete trophic molecules that support in vitro and in vivo peripheral and central neuronal survival and neuritogenesis.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figuras
Figura 1. ________________________________________________________________18 Figura 2. ________________________________________________________________24 Figura 3. ________________________________________________________________30 Figura 4. ________________________________________________________________31 Figura 5. ________________________________________________________________37 Figura 6. ________________________________________________________________49 Figura 7. ________________________________________________________________51 Figura 8. ________________________________________________________________53 Figura 9. ________________________________________________________________55 Figura 10. _______________________________________________________________58 Figura 11. _______________________________________________________________61 Figura 12. _______________________________________________________________62 Figura 13. _______________________________________________________________64 Figura 14. _______________________________________________________________65 Figura 15. _______________________________________________________________67 Figura 16. _______________________________________________________________68 Figura 17. _______________________________________________________________74 Figura 18. _______________________________________________________________76 Figura 19. _______________________________________________________________77 Figura 20. _______________________________________________________________78 Figura 21. _______________________________________________________________79 Figura 22. _______________________________________________________________80 Figura 23. _______________________________________________________________81 Figura 24. _______________________________________________________________82 Figura 25. _______________________________________________________________83 Figura 26. _______________________________________________________________85 Figura 27. _______________________________________________________________86 Figura 28. _______________________________________________________________88 Figura 29. _______________________________________________________________89 Figura 30. _______________________________________________________________91 Figura 31. _______________________________________________________________92 Figura 32. _______________________________________________________________94 Figura 33. _______________________________________________________________95 Figura 34. _______________________________________________________________97 Figura 35. _______________________________________________________________98 Figura 36. ______________________________________________________________100 Figura 37. ______________________________________________________________101 Figura 38. ______________________________________________________________102 Figura 39. ______________________________________________________________104 Figura 40. ______________________________________________________________105 Figura 41. ______________________________________________________________107 Figura 42. ______________________________________________________________107 Figura 43. ______________________________________________________________109
Figura 44. ______________________________________________________________110 Figura 45. ______________________________________________________________111 Figura 46. ______________________________________________________________112 Figura 47. ______________________________________________________________112 Figura 48. ______________________________________________________________114 Figura 49. ______________________________________________________________116 Figura 50. ______________________________________________________________118 Figura 51. ______________________________________________________________119 Figura 52. ______________________________________________________________133 Tabelas
Tabela 1.________________________________________________________________21 Tabela 2._______________________________________________________________100
LISTA DE ABREVIATURAS AA - Ácido ascórbico.
AKT/PKB -Proteína cinase B.
AMG - (do inglês, Avian Müller Glia) Meio condicionado por culturas de glia de Müller de embrião de pinto.
B27 - Suplemento de fatores para meio de cultura neurobasal.
BAD -Proteína BH3 pro-apoptótica.
BCF - BDNF + CNTF + Forscolina.
Bcl-2 -Proteína BH4 antiapoptótica.
BDNF -Fator neurotrófico derivado de cérebro.
BFC – Neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal BME -Meio basal de Eagle.
Caspase - Cisteína aspartato protease CGRs -Células ganglionares da retina.
Chat -Colina acetil transferase.
CMF -Solução de Hanks sem cálcio e magnésio.
CNQX - Inibidor competitivo do receptor não-NMDA.
CNTF - Fator neurotrófico do gânglio ciliar.
DFA - Diacetato de Fluoresceína
DMEM -Meio de Eagle modificado por Dulbecco.
e.p.m. - erro padrão da média
ERK -Cinase regulada por sinalização extracelular.
F - Forscolina
FGFb -Fator básico de crescimento derivado de fibroblastos.
FHKR -Fator de transcrição forkhead.
FPLC - Cromatografia rápida de proteínas.
GRD - Gânglio da raiz dorsal.
GCS - Gânglio Cervical Superior
GSK - Cinase da sintase do glucagon.
IRS - Substrato do Receptor da Insulina JAK –Cinase Ativada por Janus.
LIF -Fator de Inibição da Leucemia.
LY294002 - Inibidor da Pi3K.
MAPK -Cinase ativada por fatores mitogênicos.
MC - Meio condicionado.
MCP - Morte celular programada.
MK801 - Inibidor não competitivo do receptor NMDA.
MMG – (do inglês, Mice Müller Glia) Meio condicionado por culturas de glia de Müller de camundongo neonato (P1).
NB - Meio de cultura Neurobasal.
NGF -Fator de crescimento do nervo.
NT3 -Neurotrofina 3.
NT4/5 -Neurotrofina 4/5.
NT6 -Neurotrofina 6.
NT7 -Neurotrofina 7.
P75 -Subunidade de baixa afinidade para neurotrofinas.
PACAP -Polipeptídeo pituitário ativador da adenilato ciclase.
PBS - Solução salina tamponada de fosfato.
PCR -Reação da polimerase em cadeia.
PD098059 -Inibidor da MAPK.
Pi3C -Fosfoinositideo 3-OH Cinase.
PIP2 - Fosfatidilinositol-4,5-bifosfato PIP3 - Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato
RCM - (do inglês, Retina Conditioned Media) Meio condicionado por explantes de retina de embrião de aves.
SFB - Soro fetal bovino.
SNC -Sistema nervoso central.
SNP -Sistema Nervoso Periférico.
STAT -Transdutor de sinal e ativador de transcrição.
TNF -Fator de Necrose Tumoral.
Trk A -Receptor tirosina cinase de alta afinidade para neurotrofinas ativado por NGF.
Trk B - Receptor tirosina cinase de alta afinidade para neurotrofinas ativado por BDNF e/ou NT 4.
Trk C - Receptor tirosina cinase de alta afinidade para neurotrofinas ativado por NT 3.
TTBS – Solução tamponada de Tris + 0,1% Tween TTX -Tetrodotoxina.
VIP- Peptídeo vaso-ativo intestinal
1. INTRODUÇÃO
1.1 FATORES NEUROTRÓFICOS
A sobrevivência de neurônios no Sistema Nervoso Periférico (SNP) e Central (SNC) depende de quantidades limitadas de fatores neurotróficos secretados por tecidos alvos (DAVIES, 1994; GOLDBERG e BARRES, 2000).
Entretanto a capacidade de regeneração do SNP, mas não de neurônios centrais, é uma característica marcante dos vertebrados superiores (GOLDBERG e BARRES, 2000). Um dos maiores desafios da neurobiologia moderna encontra-se exatamente em se descobrir como funciona o mecanismo que define a vida ou a morte de diferentes tipos neuronais. Se pudermos identificar o porquê da irreversibilidade de lesões das vias nervosas centrais após um trauma talvez possamos reverter e recuperar a função dessas vias.
Trabalhos pioneiros referentes à manutenção de populações de neurônios sensoriais e simpáticos por quantidades mínimas de fatores solúveis foram realizados em meados do século passado por Rita Levi-Montalcini e Victor Hamburger (LEVI-MONTALCINI e HAMBURGER, 1951, 1953).
Como descrito por Cowan (2001), a colaboração entre Montalcini e Hamburger que deveria ser de apenas alguns meses, no máximo um ano, durou décadas e determinou o futuro da neurobiologia do desenvolvimento.
No final de 1951, a italiana Levi-Montalcini, em colaboração com a Doutora Hertha Meyer, veio ao Brasil e passou alguns meses em seu laboratório na Universidade do Brasil, na época situada na Praia Vermelha.
Desta colaboração resultou uma descoberta que muito acrescentou à
neurobiologia moderna, o papel de fatores neurotróficos solúveis na manutenção da viabilidade neuronal.
A descoberta do Fator de Crescimento do Nervo (NGF, do inglês Nerve Growth Factor) representou um marco numa área da pesquisa hoje muito bem estabelecida, que é a área das neurotrofinas e fatores neurotróficos.
Nas primeiras observações de Levi-Montalcini no Rio de Janeiro, a presença de um explante de sarcoma, um tecido tumoral, em culturas de explantes de gânglios sensoriais, provocava extensa neuritogênese no tecido nervoso logo nas primeiras 24 horas. O que foi observado foi um impressionante aumento do número e tamanho dos neuritos que projetavam do explante de gânglio da raiz dorsal (GRD) (figura1) (Purves e Lichman, 1985). Com base nestas observações Rita Levi-Montalcini concluiu que o agente de tal efeito era, possivelmente, uma molécula solúvel que se difundia no meio e provocava tais alterações nos explantes de tecido nervoso (LEVI-MONTALCINI e HAMBURGER, 1953). O fenômeno ilustrado por seus desenhos ganhou a capa de publicações importantes e livros textos em neurobiologia. Alguns anos mais tarde, com a chegada do bioquímico Stanley Cohen ao laboratório de Victor Hamburger (em Saint Louis, Missouri), deu-se o isolamento e a purificação de frações ativas do sarcoma e também de veneno de cobra e glândula submandibular de rato. A purificação do fator revelou uma estrutura pentamérica polipeptídica mais tarde denominada de NGF. Nesta molécula, o dímero das subunidades β é o responsável pela atividade trófica do NGF, a subunidade γ possui atividade serina proteinase capaz de processar a forma precursora do β-NGF
enquanto a subunidade α-NGF é uma serina proteinase inativa (McDONALD et al., 1995) portanto ainda desconhecidas quanto à função (PURVES e LICHMAN, 1985).
Figura 1. A descoberta do primeiro membro da família das neurotrofinas, o NGF, por Rita Levi-montalcini. Observando projeções neuríticas que emanavam de um explante de GRD na presença de um explante de sarcoma concluiu que este liberava fatores solúveis que induziam neuritogênese em explantes de gânglios periféricos (compare a diferença entre os explantes na presença do sarcoma e na ausência, em vermelho). Posteriormente, o bioquímico Stanley Cohen se juntou ao grupo e seqüenciou a estrutura primária das subunidades da proteína NGF.
Além do NGF, fazem parte da família das neurotrofinas o fator neurotrófico derivado de cérebro (BDNF, do inglês Brain Derived Neurotrophic Factor), que foi isolado inicialmente a partir de grande quantidade de cérebro de porcos (BARDE et al., 1982), e teve posteriormente seu gene clonado com a técnica de DNA recombinante (LEIBROCK et al., 1989). A clonagem e a expressão do gene do BDNF permitiu
novos avanços na área dos fatores neurotróficos. A comparação entre as estruturas do NGF e do BDNF revelou uma homologia de aproximadamente 50% na cadeia peptídica dos homodímeros básicos (Leibrock et al., 1989). O uso da técnica de reação da polimerase em cadeia (PCR, do inglês Polimerase Chain Reaction) com seqüências iniciadoras (primers) para regiões conservadas das neurotrofinas permitiu a identificação de membros adicionais desta família. Assim, a neurotrofina-3 (NT-3, HOHN et al., 1990;
MAISONPIERRE et al., 1990; JONES e REICHARDT, 1990; ROSENTHAL et al., 1990), a neurotrofina 4/5 (NT-4/5, BERKEMEIER et al., 1991; HALLBÖÖK et al., 1991; IP et al., 1992), mais recentemente a neurotrofina 6 (NT-6; GOTZ et al., 1996) e a neurotrofina 7 (NT-7; NILSSON et al., 1998) foram obtidas através de clonagem e seqüenciadas sem a purificação protéica prévia (JOHNSON, 1999). Estas moléculas tróficas caracterizam-se por manter populações distintas de neurônios no sistema nervoso periférico e central (Tabela 1). O NGF, por exemplo, tem efeito sobre a sobrevivência e diferenciação em neurônios simpáticos e sensoriais além de neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal. Estes últimos parecem ser afetados no mal de Alzheimer, doença neurodegenerativa que afeta a cognição geralmente de pessoas idosas.
Nos últimos anos, ficou evidente que muitos fatores de crescimento preenchem uma definição funcional de fator neurotrófico podendo regular a sobrevivência e a diferenciação de células nervosas. Assim, vários fatores tróficos que não são estruturalmente relacionados com as neurotrofinas também mantêm neurônios em cultura. Entre estes fatores temos, o fator
neurotrófico derivado do gânglio ciliar (CNTF, do inglês Ciliary Neurotrophic Factor; SENDTNER et al., 1994), o fator de crescimento de fibroblastos tipo 2 (FGF-2 , do inglês Fibroblast Growth Factor type 2; UNSICKER et al., 1987;
ECKENSTEIN, 1994), o fator inibidor de leucemia (LIF, do inglês Leukemia inhibitory Factor; MURPHY et al., 1993), o fator neurotrófico derivado de linhagem glial (GDNF, do inglês Glial Derived Neurotrophic Factor; UNSICKER, 1999), e os fatores análogos à insulina 1 e 2 (IGF, do inglês Insulin-like Growth Factor; ISHII et al., 1993). A interação da insulina, ou de IGFs com seus respectivos receptores leva ao recrutamento e a fosforilação do substrato do receptor da insulina (IRS, do inglês Insulin Receptor Substrate), e ao subseqüente recrutamento da enzima Pi3Cinase (Pi3C). Pi3C se liga a IRS convertendo fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) na membrana celular a fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3). O acúmulo de PIP3 é antagonizado pela fosfatase homóloga da tensina (PTEN, do inglês Phosphatase and Tensin Homolog). PIP3 ainda participa da interação com proteína cinase dependente de fosfoinositídeo (PDK1, do inglês Phosphoinositide-dependent Protein Kinase 1) e proteína cinase B (PKB, do inglês Protein Kinase B; também chamada AKT) na membrana, resultando na fosforilação de PKB por PDK1.
Hoje o cenário relacionado com os fatores tróficos encontra-se pautado nas famílias gênicas como as do CNTF (VERGARA e RAMIREZ, 2004) e outros membros da mesma família protéica como por exemplo LIF, Interleucina-6 (IL-6 , do inglês Interleukin-6), IL-11, oncostatina M e cardiotrofina.
Adaptado de Tuszynski e Kordower, 1999 Tabela1: Diversos fatores com conhecida atividade trófica no sistema nervoso de mamíferos.
Neurônios sensoriais, do tronco cerebral.
Fatores Neurotróficos e Alguns de seus Alvos no Sistema Nervoso de Mamíferos
Nome do Fator de Crescimento Alvo
Fator de Crescimento do Nervo (NGF) Neurônios do estriato, nociceptivos, sensoriais, simpáticos e BFC.
Fator Trófico Derivado do Cérebro (BDNF) Neurônios corticais, mecanoreceptores, sensoriais, motores (α), vestibulares, auditivos, CGRs, BFC, HPC.
Fator de Crescimento de Fibroblastos-1 ( FGFα)
Fator de Crescimento Transformante β(TGF β1-3)
Activina Neurônios motores (α).
Fator Neurotrófico Derivado de Linhagem Glial (GDNF) Neurturina
Artemina
Fator Neurotrófico Ciliar (CNTF) Fator inibidor de Leucemia (LIF) ou Fator de diferenciação Colinérgica (CDF) Cardiotrofina-1
Interleucina-6
Neurotrofina 4/5 (NT 4/5)
Neurotrofina 3 (NT-3) Neurônios corticais, proprioceptores, sensoriais, do fuso muscular, auditivos, BFC, HPC, oligodendrócitos.
Neurotrofina 6 e 7 (NT-6 e NT-7) Não descritas em mamíferos.
Neurônios motores (α), CGRs.
Fator de Crescimento de Fibroblastos-2 ( FGFβ) Fator de Crescimento de Fibroblastos 3-17
Vários tipos neuronais da medula e tronco cerebral, neurônios corticais.
Neurônios dopaminérgicos, neurônios corticais, CGRs, BFC, células tronco.
Diversos tipos neuronais.
Neurônios motores (α), sensoriais.
Neurônios dopaminérgicos, motores (α e corticais), sensoriais, simpáticos.
Persefina
Neurônios motores (αe corticais), corticais, simpáticos, glias.
Fatores Morfogenéticos Ósseos (BMPs)
Neuregulinas Maturação glial e de sinapses.
Fator de Crescimento do Hepatócito (HGF) Imunofilinas
Midcina
Eritropoetina BFC.
Fator de Crescimento do tipo Insulina-I (IGF-1) Fator de Crescimento do tipo Insulina-2 (IGF-2) Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)
CNS, formador de padrão durante o desenvolvimento do SNP.
Neurônios motores (α).
Neurônios sensoriais, simpáticos.
Fator de Crescimento Transformante α(TGF α) Neurônios dopaminérgicos, HPC, corticais (in vitro).
Neurônios motores (α), sensoriais, HPC, células de Schwann.
Fotoreceptores.
Neurônios dopaminérgicos, motores (α e corticais), sensoriais.
Neurônios dopaminérgicos, motores (αe corticais).
Neurônios dopaminérgicos, corticais, HPC, células tronco.
Neurônios motores (α), sensoriais, diversos tipos neuronais do cérebro, oligodendrócitos .
Neurônios motores (α e corticais), do estriato, parassimpáticos, sensoriais, simpáticos, BFC, HPC.
Neurônios simpáticos.
Neurônios diversos centrais e periféricos (inclui simpático.
Neurônios sensoriais, do tronco cerebral.
Fatores Neurotróficos e Alguns de seus Alvos no Sistema Nervoso de Mamíferos
Nome do Fator de Crescimento Alvo
Fator de Crescimento do Nervo (NGF) Neurônios do estriato, nociceptivos, sensoriais, simpáticos e BFC.
Fator Trófico Derivado do Cérebro (BDNF) Neurônios corticais, mecanoreceptores, sensoriais, motores (α), vestibulares, auditivos, CGRs, BFC, HPC.
Fator de Crescimento de Fibroblastos-1 ( FGFα)
Fator de Crescimento Transformante β(TGF β1-3)
Activina Neurônios motores (α).
Fator Neurotrófico Derivado de Linhagem Glial (GDNF) Neurturina
Artemina
Fator Neurotrófico Ciliar (CNTF) Fator inibidor de Leucemia (LIF) ou Fator de diferenciação Colinérgica (CDF) Cardiotrofina-1
Interleucina-6
Neurotrofina 4/5 (NT 4/5)
Neurotrofina 3 (NT-3) Neurônios corticais, proprioceptores, sensoriais, do fuso muscular, auditivos, BFC, HPC, oligodendrócitos.
Neurotrofina 6 e 7 (NT-6 e NT-7) Não descritas em mamíferos.
Neurônios motores (α), CGRs.
Fator de Crescimento de Fibroblastos-2 ( FGFβ) Fator de Crescimento de Fibroblastos 3-17
Vários tipos neuronais da medula e tronco cerebral, neurônios corticais.
Neurônios dopaminérgicos, neurônios corticais, CGRs, BFC, células tronco.
Diversos tipos neuronais.
Neurônios motores (α), sensoriais.
Neurônios dopaminérgicos, motores (α e corticais), sensoriais, simpáticos.
Persefina
Neurônios motores (αe corticais), corticais, simpáticos, glias.
Fatores Morfogenéticos Ósseos (BMPs)
Neuregulinas Maturação glial e de sinapses.
Fator de Crescimento do Hepatócito (HGF) Imunofilinas
Midcina
Eritropoetina BFC.
Fator de Crescimento do tipo Insulina-I (IGF-1) Fator de Crescimento do tipo Insulina-2 (IGF-2) Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)
CNS, formador de padrão durante o desenvolvimento do SNP.
Neurônios motores (α).
Neurônios sensoriais, simpáticos.
Fator de Crescimento Transformante α(TGF α) Neurônios dopaminérgicos, HPC, corticais (in vitro).
Neurônios motores (α), sensoriais, HPC, células de Schwann.
Fotoreceptores.
Neurônios dopaminérgicos, motores (α e corticais), sensoriais.
Neurônios dopaminérgicos, motores (αe corticais).
Neurônios dopaminérgicos, corticais, HPC, células tronco.
Neurônios motores (α), sensoriais, diversos tipos neuronais do cérebro, oligodendrócitos .
Neurônios motores (α e corticais), do estriato, parassimpáticos, sensoriais, simpáticos, BFC, HPC.
Neurônios simpáticos.
Neurônios diversos centrais e periféricos (inclui simpático.
A proteína FGFb é um outro fator trófico identificado inicialmente em neurônios por imunocitoquímica (PETTMAN et al., 1986) e que mantém a sobrevida de neurônios do gânglio ciliar, mas em contraste com o CNTF, não induz a sobrevida de neurônios do GRD nem de neurônios simpáticos (UNSICKER et al., 1987). Até o momento já foram descritos e isolados cerca de 23 membros da família do FGF, com enfoque particular ao FGFb (FGF básico), que tem função neurotrófica (ABE e SAITO, 2001); para a família do fator transformante do crescimento beta (TGFβ, do inglês Transforming Growth Factor) que no SNC tem uma subfamília liderada pelo GDNF que hoje apresenta 3 novos membros, persefina, artemina e neurturina (BALOH et al., 2000).
1.1.2 RECEPTORES PARA FATORES TRÓFICOS
É fato que a maioria, se não todos os fatores neurotróficos, ativam seus respectivos neurônios através de receptores compostos por conjuntos protéicos multiméricos (complexos de subunidades protéicas) como os exemplificados na figura 2. Nesta figura podemos observar a ilustração esquemática de quatro receptores multiméricos de famílias protéicas diferentes. O primeiro receptor da esquerda para a direita é um modelo de receptor para ligantes da família das neurotrofinas. Este receptor possui dois conjuntos de subunidades, uma de alta afinidade chamada receptor de cinases relacionados à tropomiosina (Trk, do inglês Tropomyosin-related Kinase; KLEIN et al., 1991; BARBACID, 1991) que tem descritas três isoformas
TrkA, TrkB e TrkC com especificidade para diferentes neurotrofinas e outra subunidade de menor afinidade chamada p75 (CHAO, 1994). Existe pelo menos uma subunidade de alta afinidade para cada neurotrofina, onde TrkA tem maior afinidade e eficiência para NGF, TrkB para BDNF e NT4/5, enquanto TrkC tem grande especificidade para NT-3. Todas as subunidades Trks contém 3 domínios ricos em leucina, dois concentrados em cisteína, dois domínios do tipo imunoglobulina na região extracelular do receptor além do domínio tirosina cinase no lado citoplasmático (JOHNSON, 1999), entretanto é importante ressaltar o grande número de isoformas existentes para esses receptores, truncadas ou não, que desempenham variados efeitos fisiológicos durante o desenvolvimento (NINKINA et al., 1996). Da mesma maneira as neurotrofinas também são encontradas em diferentes isoformas.
A subunidade p75, por sua vez, membro da família do Fator de Necrose Tumoral (TNF, do inglês Tumor Necrosis Factor), apresenta características estruturais com domínios envolvidos em morte celular, (Domínios de morte, Death Domains, DR1-DR4; KHURSIGARA et. al., 2001). Esta subunidade apresenta várias funções, desde a potencialização da resposta ao NGF durante o desenvolvimento (HORTON et al., 1997), até o envolvimento na resposta de morte celular programada, dependendo do tecido envolvido e da fase do desenvolvimento. Isto foi demonstrado em particular na retina de aves por Frade e colaboradores, (1996).
Figura 2. Variedade de receptores multiméricos para fatores neurotróficos. Da esquerda para a direita temos: o receptor de alta afinidade para neurotrofinas TrkA, TrkB e TrkC; o receptor de baixa afinidade para neurotrofinas, p75; o receptor para FGF com a porção heparan-sulfato que compõe o complexo ativo do receptor; o receptor para GDNF com a sua subunidade α e a proteína acessória (ret) visto que este receptor não possui domínio catalítico e o receptor trimérico para CNTF com sua subunidade gp130 que compõe a tríade do receptor para todos os membros descritos da família do CNTF.
O segundo receptor ilustrado na figura 2 recebe ligantes da família do FGF. Este receptor tem duas subunidades, uma de alta afinidade com domínio intracelular tirosina cinase, e uma subunidade essencial contendo proteoglicanos com caudas de heparan sulfato importantes na resposta funcional dos fatores tróficos desta família (SIMON, 2000). O terceiro receptor da figura 2 representa um receptor que tem especificidade por ligantes da família do GDNF. Estes receptores que começaram a ser identificados em meados da década de 90 por técnicas de biologia molecular (JING et al., 1996, TREANNOR et al., 1996) são compostos por pelo menos uma
subunidade de grande afinidade para cada membro até então identificado (GRFα1-4). Onde GRFα1 responde preferencialmente para GDNF, GRFα2 para neurturina, GRFα3 para artemina e GRFα4 para persefina (BALOH et al., 2000; SAARMA, 2000). Estes estudos foram confirmados por expressão destas subunidades associadas a fosforilação de proteínas sinalizadoras e sobrevida de neurônios centrais e periféricos em cultura e in vivo. É válido mencionar que GFRα4 só foi identificado em aves (ENOKIDO et al., 1998). Os receptores GRFα1-4 se ligam à membrana plasmática com caudas de glicofosfatidilinositol e se associam a uma proteína chamada ret, que possui um domínio tirosina cinase, responsável pela fosforilação de proteínas alvo.
A proteína ret já era conhecida pelo seu papel em diversos tumores do SNC e dos rins tendo seu gene clonado desde o final da década de 80 (TAKAHASHI et al., 1988), mas até então permanecera como um receptor órfão.
O CNTF foi o terceiro fator neurotrófico a ser purificado. Diferente do NGF e demais neurotrofinas, o CNTF é membro de uma ampla família de protéica denominada de família das citocinas neuropoiéticas (PATTERSON, 1991; JOHNSON, 1999). Os receptores da família do CNTF (figura 2) são compostos por 3 proteínas que formam o complexo funcional. A composição do trímero varia de acordo com o do membro que ativa o seu respectivo receptor (STAHL e YANCOPOULOS, 1996; IP e YANCOPOULOS, 1996). Quando CNTF é o ligante, os receptores são formados por uma proteína receptora do CNTF (CNTFRα, solúvel ou não), por uma proteína receptora do LIF (LIFR) e por uma proteína chamada gp130. A subunidade
CNTFR também se associa à membrana por cauda de glicofosfatidilinositol. É válido notar, que diferente das outras três famílias de fatores tróficos, estas subunidades não apresentam domínios intracelulares tirosina cinase necessitando, desta forma, recrutar e se associar à proteínas adaptadoras que possuem função de fosforilar demais proteínas em resíduos tirosina (TOUW et al., 2000). Estas proteínas adaptadoras são da família das Janus cinases (JAK, do inglês, Janus Activated Kinase) e geram respostas fosforilando fatores de transcrição chamados Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição (STAT, do inglês, Signal Transduction Activated transcription) que irão regular a transcrição de diversos genes.
1.2 TIPOS DE MORTE CELULAR
A morte neuronal é parte de um processo na biologia do sistema nervoso presente tanto no desenvolvimento quanto em desordens degenerativas. Vários tipos de morte celular têm sido descritos de acordo com características morfológicas e bioquímicas. Entre os diferentes tipos de morte celular, o processo apoptótico tem sido o mais estudado. Na apoptose, a transcrição de genes é ativa, há síntese de proteínas, a atividade de cisteína aspartato protease (caspases) é aumentada, ocorre diminuição do volume celular, picnose nuclear, fragmentação do DNA nuclear e a manutenção da membrana plasmática (SUBRAMANIAM e UNSICKER, 2006). Em contraste, na necrose não ocorre síntese protéica nem atividade de caspases, e o núcleo assim como a estrutura do DNA são
pouco afetados. No entanto, existe um aumento no volume celular e a membrana plasmática sofre danos. Autofagia é um outro processo de morte celular que vem ganhando maior atenção nos últimos anos, e refere-se à autodestruição da célula caracterizada pelo seqüestro do conteúdo citoplasmático por vacúolos chamados de autofagosomas, sendo transportado aos lisossomas para degradação (BROKER et al., 2005). No processo autofágico, a participação de genes e proteínas foi inicialmente observada em leveduras e alguns ortólogos de mamíferos. As células que morrem por autofagia sofrem o processo de forma independente de caspases (GOZUACIK e KIMCHI, 2004).
1.2.1 REGULAÇÃO DA APOPTOSE
Nos últimos dez anos, a grande quantidade de publicações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na apoptose levou a um grande avanço no entendimento deste fenômeno. O conceito de apoptose surgiu na década de 70, quando Kerr e colaboradores (1972) mostraram que este tipo de fenômeno de Morte Celular Programada (MCP) é conservado na evolução e tem implicações abrangentes na biologia celular ocorrendo durante o desenvolvimento e processos patológicos nos mais diversos sistemas de invertebrados e vertebrados. Neste processo, observa-se a redução citoplasmática, condensação da cromatina, fragmentação do DNA genômico e formação de circunvoluções na superfície celular, as quais dão origem aos corpos apoptóticos. Acredita-se que a ativação
descontrolada da MCP no sistema nervoso esteja envolvida com a evolução de doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson (DESHMUKH e JOHNSON, 1997). Já foram descritas vias bioquímicas distintas que levam a MCP envolvendo ou não a mitocôndria além de vias de sinalização ativadas por receptores com domínio de morte, ambas culminando com a ativação de caspases (DANIAL e KORSMEYER, 2004). A morte apoptótica requer a síntese de proteínas e a transcrição de genes apropriados para o fenômeno apoptótico (MARTIN et al., 1988; ESTUS et al., 1994; FREEMAN et al., 1994) e se opõe a necrótica, visto que esta última está envolvida com extravasamento citoplasmático, ruptura de organelas e inflamação tecidual.
As primeiras observações genéticas a respeito dos mecanismos envolvidos na apoptose foram realizados no nematódeo Caenorhabditis elegans (C. elegans) durante a década de 80 pelo grupo de Robert Horvitz, em Boston, EUA (ELLIS e HORVITZ, 1986). Este nematódeo tem um número fixo de 1090 células no seu organismo. Destas, 131 sofrem apoptose durante o desenvolvimento. Utilizando mutantes e técnicas bioquímicas, genéticas e moleculares, três genes críticos nesse processo foram identificados: ced-3 (que codifica uma caspase), ced-4 que em humanos tem seu homólogo, Fator Ativador de Proteases Apoptóticas 1 (APAF1, do inglês Apoptosis Protease Activating Factor-1) que ativa caspases induzindo apoptose e ced- 9 que é homólogo ao proto-oncogene humano Bcl-2 (do inglês B-cell Lymphoma/Leukemia-2), que impede a apoptose quando expressa em altas quantidades em diversos tipos celulares.
Assim como no C. elegans, as células dos vertebrados também apresentam na sua estrutura proteínas pró-apoptóticas (homólogas às proteínas sintetizadas pelos genes ced-3 e ced-4) e anti-apoptóticas (homólogas a ced-9). A principal família de proteínas envolvida neste processo é a da bcl-2 que é amplamente estudada quanto a sua estrutura e função. Os membros da família bcl-2 foram sendo elucidados na década de 90, em grande parte pelos trabalhos de Stanley Korsmeyer (Harvard Medical School, Boston, EUA). O gene da proteína bcl-2 foi descrito em 1984 em células do sistema imune induzindo um linfoma folicular a uma proliferação desenfreada quando tal proteína era expressa em altos níveis. A família possui até 4 domínios de homologia a bcl-2 (BH), correspondendo a regiões de hélice e que podem ser classificadas em 3 categorias. As proteínas bcl-2, bcl-xl, bcl-w, bfl-1, Mcl-1 e A1 e alguns outros membros são anti-apoptóticos e compartilham 4 domínios BH semelhantes. O segundo grupo consiste de proteínas pro-apoptóticas (Bax, Bak e Bok) que compartilham os domínios BH1-3 (DONOVAN e COTTER, 2004), dos quais Bax e Bak são essenciais para inúmeros estímulos de morte (WEI et al., 2001). O terceiro grupo, a subfamília BH3, que contém apenas esse domínio, consiste de Bim, Bid, Bad, Puma, Noxa, Hrk/DP5, Bik e Bmf que agem como sentinelas dos sinais de morte celular e heterodimerizam com membros anti-apoptóticos do grupo Bcl-2 levando a ativação de Bax/Bak e liberação de fatores mitocondriais (WILLIS e ADAMS, 2005). No entanto, este grupo não pode iniciar a permeabilidade mitocondrial diretamente sem Bax ou Bak (ZONG et al., 2001).
A mitocôndria emergiu como o local essencial na efetivação da MCP devido a múltiplos sinais bioquímicos, convergindo na liberação de citocromo C que interagindo com APAF-1 e caspase-9 formam uma estrutura chamada de apoptosoma. Assim, membros pró-apoptóticos da família bcl-2 podem induzir um aumento na permeabilidade mitocondrial levando a liberação de citocromo C do espaço mitocondrial para o citoplasma, induzindo morte por apoptose (ZORNIG et al., 2001). Membros anti- apoptóticos preservam a integridade mitocondrial e portanto bloqueiam a liberação de proteínas solúveis inter-membranares (figura 3).
Adaptado de Chao, 1994.
Figura 3. Esquema ilustrativo da complexa regulação do processo apoptótico.
Fatores tróficos atuam extracelularmente ativando receptores que vão ativar vias de sinalização intracelulares impedindo a liberação de citocromo C pela mitocôndria. Proteínas pró- e anti-apoptóticas controlam a permeabilidade da membrana mitocondrial. Durante a apoptose, citocromo C liberado interage com APAF-1 e caspase 9, levando a formação do complexo apoptosoma. A apoptose se caracteriza por fragmentação de DNA, fragmentação do DNA e de organelas intracelulares entre outras características.
Dois mecanismos são atualmente propostos para isso. No primeiro, proteínas pró-apoptóticas formariam poros na membrana permitindo a liberação de citocromo C (idéia defendida por Jean Claude Martinou e colaboradores, Geneva, Suíça e Richard Youle e colaboradores, Boston, EUA) e/ou proteínas pró-apoptóticas interagiriam com as anti-apoptóticas numa estequiometria que impediria que as proteínas pró-apoptóticas fiquem livres no citoplasma e ativem cascatas de caspases (defendido por KORSMEYER et al., 1999). Outras proteínas como a 14-3-3, que se situa no citoplasma, também teriam um papel de tamponamento funcional, por exemplo se ligando a proteína bad fosforilada, impedindo de exercer seu efeito apoptótico (figura 4) (DATTA et al., 2000). A fosforilação da proteína bad e de outras moléculas pela ativação de receptores por fatores tróficos causa uma mudança nas vias de sinalização intracelulares que impede os elementos das vias apoptóticas de iniciar a apoptose por mecanismos diversos.
Figura 4. Esquema ilustrando a inativação de Bad fosforilada pela proteína 14-3-3. Bad fosforilada se desloca da membrana para o citosol onde se liga a 14-3-3 tornando-se inativa.
Adaptado de Datta et al., 2000
Como mencionado anteriormente, alguns processos apoptóticos não envolvem diretamente a mitocôndria, como por exemplo, a apoptose disparada pela ativação da caspase 12, uma protease localizada no retículo endoplasmático (NAKAGAWA et al., 2000), e caspase 8, associada com receptores que possuem domínios de morte, como Fas (van EIJK et al., 2001).
1.2.2 APOPTOSE EM NEURÔNIOS SIMPÁTICOS
Neurônios simpáticos dependentes de NGF são amplamente usados como modelo no estudo da MCP neuronal. A maioria das populações neuronais sofre MCP durante o período em que é estabelecida a inervação de seus alvos. Esta morte se dá porque a sobrevivência destes neurônios durante o desenvolvimento é dependente de fatores tróficos secretados por tecidos alvo e/ou células vizinhas em quantidades limitadas. Esta é a chamada “hipótese neurotrófica” (PURVES e LITCHMAN., 1985). Em ratos os neurônios simpáticos dependem de NGF de forma aguda para a sua sobrevivência a partir da idade embrionária de 16 dias (E16) até a primeira semana pós-natal (HENDRY e CAMPBELL, 1976) e em aves a partir de E8 até o nascimento. Evidências para essas observações vêm de experimentos com a administração de NGF exógeno aumentando a sobrevivência dos neurônios simpáticos (HENDRY e CAMPBELL, 1976), ou pela neutralização do NGF com o uso de anticorpos específicos (LEVI-MONTALCINI e BOOKER, 1960) e conseqüentemente diminuindo a população dos neurônios simpáticos. Mais recentemente, a deleção do gene do NGF (CROWLEY et al., 1994) ou do
receptor TrkA (SMEYNE et al., 1994) em camundongos por recombinação homóloga resultou em vasta morte de neurônios simpáticos. De acordo com os trabalhos de Davies et al. (1988) o estágio E10 é o mais apropriado para a maioria dos ensaios envolvendo apoptose e fatores neurotróficos em embriões de galinha e será o estágio embrionário usado neste trabalho para culturas de neurônios do gânglio simpático e GRD.
Neurônios simpáticos do gânglio cervical superior (GSC) de camundongos ou ratos P1 (1 dia pós-natal) e do gânglio tóraco-lombar de embriões de pinto E10, purificados e mantidos em cultura, dependem de NGF para manutenção da viabilidade celular e projeção neurítica. A remoção do NGF, ou a ausência desse fator inicia a MCP e promove a morte apoptótica destes neurônios em cultura em sua totalidade em aproximadamente 48 horas após a privação do fator.
Uma das grandes vantagens desse modelo é a relativa homogeneidade da população dos neurônios simpáticos que sofrem apoptose, de forma sincrônica e reprodutível (DESHMUKH e JOHNSON, 1997).
Durante as primeiras 8 horas de privação de NGF, os neurônios simpáticos não exibem qualquer alteração morfológica. Após esse período os neuritos começam a degenerar, a membrana plasmática perde a sua aparência lisa, e o corpo celular fica irregular (DESHMUKH e JOHNSON, 1997). Mais de 95% dos neurônios estão mortos por apoptose após 48 horas em cultura privados de NGF.
Além do NGF, outras moléculas são capazes de inibir a MCP em neurônios simpáticos. Entre estas moléculas estão análogos de adenosina
mono-fosfato cíclico (AMPc) ou ativação direta da proteína cinase A (PKA) (RYDEL e GREENE, 1988; EDWARDS et al., 1991), despolarização com KCl em gânglio da raiz dorsal (SCOTT e FISHER, 1970, EDWARDS et al., 1991) e peptídeos ativos, como o polipeptídeo pituitário que ativador da adenilato ciclase (PACAP, do inglês Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide; PRZYWARA et al., 1998) além da aplicação de ciclohexemida na cultura visto que esta morte é dependente de síntese protéica (MARTIN, 1988; SCOTT e DAVIES, 1990). Entretanto, ocorrem algumas diferenças de resposta de sobrevivência em neurônios simpáticos entre as diferentes espécies. O AMPc está envolvido na manutenção da sobrevivência de neurônios simpáticos de roedores o que não acontece em neurônios simpáticos embrionários de pinto (WAKADE et al., 1990). Se NGF, AMPc/PKA e KCl impedem a morte apoptótica através de vias convergentes ou pelos mesmos mediadores é algo ainda sem resposta, porém os níveis de Ca2+
intracelulares parecem ser importantes (KOIKE et al., 1989). Quando uma célula é exposta a um fator trófico, a interação vai levar à fosforilação do domínio tirosina cinase intracelular desse receptor ou ao recrutamento de proteínas acessórias que ativam vias enzimáticas fundamentais na manutenção da sobrevivência e neuritogênese. Assim, o NGF induz tanto crescimento neurítico quanto sobrevivência em neurônios simpáticos, eventos disparados pela interação do ligante com seu receptor específico (TrkA) e sua conseqüente auto-fosforilação. A ativação de TrkA resulta na ativação de várias vias de sinalização, incluindo a da Ras, das cinases ativadas por fatores mitogênicos (MAPKs, do inglês, Mitogen Activated
Protein Kinases) e Pi3C (KAPLAN e MILLER, 2000). A via Pi3C ativa a PKB, que por sua vez fosforila diversos alvos responsáveis por manter a integridade, a diferenciação, a neuritogênese e a proliferação celular (DATTA et al. 1999).
Subseqüentemente à ativação da MAPK por NGF, há a fosforilação das cinases reguladas por fatores extracelulares (ERKs, do inglês Extracellular Regulated Kinases) ERK1 (p42) e ERK2 (p44), que também fosforilam alvos intracelulares (figura 3). Entretanto, essa via, diferentemente da AKT, não parece ser essencial para a sobrevivência neuronal (VIRDEE e TOLKOVSKY, 1996; CROWDER e FREEMAN, 1998).
1.3 ESTRUTURA DA RETINA
A retina, devido às suas características anatômicas e histológicas, tem sido amplamente utilizada nos estudos sobre o desenvolvimento e funcionamento do SNC. Anatomicamente a retina é um tecido de fácil acesso enquanto, histologicamente a retina é um tecido composto por tipos celulares organizados de forma complexa constituindo micro-ambientes caracterizados pela sinalização por diferentes neurotransmissores, ademais, a retina é constituída por tipos celulares sobre os quais existe amplo conhecimento morfológico e funcional, em todas as espécies. Essas propriedades da retina fazem deste tecido um modelo rico para o estudo de várias propriedades do SNC. Especialmente em embriões de pinto, a retina é uma estrutura de fácil dissecação durante todo o desenvolvimento embrionário.
A retina é formada durante o desenvolvimento a partir da invaginação do prosencéfalo, que forma a vesícula óptica, posteriormente dando origem ao cálice óptico. O cálice óptico apresenta em sua camada mais externa o epitélio pigmentado e na parte mais interna o tecido neural.
O tecido retiniano é formado pela proliferação e diferenciação de uma população de células denominadas neuroblastos. Estas células sofrem várias divisões mitóticas até a diferenciação, dando origem aos diferentes tipos celulares existentes na retina.
Em retina de pinto as primeiras células a se diferenciarem são as ganglionares entre o 3o e o 7o dia embrionário. Ocorre em seguida a diferenciação de células amácrinas, horizontais e fotorreceptores, sendo a glia de Müller e as células bipolares as últimas a se diferenciarem (KANH, 1974; MISHIMA e FUJITA, 1978; PRADA et al., 1991; SNOW e ROBSON, 1994).
Após a etapa de saída do ciclo mitótico ocorre a migração radial formando uma estrutura em camadas que é observada no tecido adulto. A retina é organizada anatomicamente em cinco camadas (figura 5), dentre as quais três são formadas por corpos celulares: nuclear externa (ONL, do inglês Outer Nuclear Layer), nuclear interna (INL, do inglês Inner Nuclear Layer) e camada de células ganglionares (GCL, do inglês Ganglion Cells Layer) e duas camadas de plexos: plexiforme externa (OPL, do inglês Outer Plexiform Layer) e plexiforme interna (IPL, do inglês Inner Plexiform Layer), formadas pelos prolongamentos celulares, onde ocorrem contatos sinápticos.
Figura 5. Estrutura da Retina. Esquema ilustrando os variados tipos neuronais da retina.
De cima para baixo, fotorreceptores (cones e bastonetes) formando a camada nuclear externa (ONL), células bipolares, horizontais e amácrinas formando a camada nuclear interna (INL) e a camada ganglionar formada por células ganglionares e amácrinas deslocadas. Observe que a glia de Müller se estende ao longo de todas as camadas fazendo contato basicamente com todos os tipos neuronais.
Nos destaques é possível observar micrografias de uma cultura de glia de Müller (marcada por anticorpo anti-S100, FITC; e com os núcleos evidenciados por DAPI) e uma célula ganglionar da retina in situ micro injetada com o indicador fluorescente lucifer yellow para evidenciar sua morfologia.
A camada nuclear externa é formada por células fotorreceptoras que transduzem estímulos luminosos em sinais elétricos, iniciando um fluxo vertical de informação para as células bipolares, na camada nuclear interna e posteriormente para a camada de células ganglionares. Os axônios das células ganglionares formam o nervo óptico que transmite as informações visuais a centros superiores (tálamo e córtex). Este fluxo vertical de
informação sofre processamento lateral, nas camadas plexiformes externa e interna, por interneurônios que são respectivamente as células horizontais e amácrinas. A glia de Müller se estende verticalmente na retina estabelecendo contato com todas as camadas da retina.
A partir do 13o dia embrionário são estabelecidos os primeiros contatos sinápticos na camada plexiforme interna e no 15o dia na camada plexiforme externa (COULOMBRE, 1955). Estudos sobre o comprometimento fenotípico dos precursores celulares retinianos têm tentado esclarecer os princípios fundamentais que definem o “destino” final dessas células, estabelecendo um modelo que combina componentes extrínsecos e intrínsecos no controle da determinação fenotípica. No centro dessa proposta, encontram-se progenitores capazes de dar origem um subconjunto limitado de tipos celulares a partir de sinais extrínsecos (LIVESEY e CEPKO, 2001). Durante o desenvolvimento da retina, seis tipos de neurônios e um tipo de célula glial são gerados numa ordem geralmente conservada através de diversas espécies de vertebrados estudadas – inicialmente são geradas as células ganglionares da retina, seguidas pelos bastonestes e bipolares, enquanto a glia de Müller esta entre os últimos tipos celulares a surgir na retina (CEPKO et al., 1996). Uma série de estudos clássicos levou ao estabelecimento de propriedades chave desse processo, como a multipotencialidade dos progenitores e ao fato de que a determinação dos progenitores não é restrita a um ou dois tipos celulares (TURNER et al., 1990; TURNER e CEPKO et al., 1987).
1.3.1 CÉLULAS GANGLIONARES DA RETINA
A axotomia do nervo óptico tem sido usado na última década para investigar os mecanismos da apoptose em CGRs (QUIGLEY et al., 1995). O curso temporal da morte das CGRs é bem estabelecido in vivo em ratos adultos (BERKELAAR et al., 1994; CORDEIRO et al., 2004). Trabalhos recentes têm mostrado um curso apoptótico semelhante para culturas de explantes de retina de camundongo adulto (McKERNAN et al., 2006)
As CGRs surgem na retina de camundongos entre os dias embrionários E10 e E18, com uma taxa máxima de proliferação em E15 (ROHRER et al., 2001). A morte das CGRs, por outro lado, ocorre em duas fases distintas. Uma primeira ainda em fase embrionária, com um pico em E15.5 (FRADE e BARDE, 1999). Esse processo apoptótico é mediado por NGF que interagindo com receptores p75 de baixa afinidade, expresso em altas quantidades na camada de CGRs em desenvolvimento, leva a uma extensa degeneração dessas células. Uma segunda onda de apoptose atinge as CGRs no período neonatal, com um pico em P2 (YOUNG et al., 1984). Esse fenômeno se correlaciona temporalmente com as projeções das CGRs para as áreas alvo localizadas no colículo superior, com a elaboração dos contatos sinápticos e a inervação apropriada. Acredita-se que quantidades limitantes de fatores tróficos secretados por essas células alvo no colículo controlem essa fase apoptótica. Quando BDNF ou NT4 é injetado no colículo superior de ratos ou hamster observa-se uma redução na taxa de apoptose de CGRs durante essa fase (CUI e HARVEY, 1995; MA et al., 1998). CGRs de animais adultos
também são reguladas por neurotrofinas, pois a apoptose induzida por axotomia é retardada em ratos ou camundongos adultos tratados com BDNF (MEY e THANOS, 1993; MANSOUR-ROBAEY et al., 1994). BDNF é também um fator trófico para CGRs mantidas in vitro (MEYER-FRANKE et al., 1995), é expresso nas camadas retino-recipientes do colículo superior (MA et al., 1998) e é transportado retrógradamente (von BARTHELD et al., 1996).
1.3.2 FATORES TRÓFICOS RETINIANOS
Tem sido relatado que a retina secreta vários fatores tróficos que influenciam a sobrevivência e a proliferação de células do sistema visual. A retina de aves e mamíferos em desenvolvimento expressa neurotrofinas e seus receptores em camadas e células específicas (LLAMOSAS et al., 1997;
BENNETT et al., 1999). Um trabalho pioneiro realizado por Araújo e Linden (1993) mostrou que o meio condicionado (MC) por tecido retiniano de rato apresentava atividade trófica que mantinha a viabilidade de CGRs de ratos em cultura. Mais tarde, Ary-Pires e colaboradores (1997) mostraram que MC de explantes e agregados retinianos de embriões de aves promovem também a sobrevivência de CGRs de ratos dissociadas em cultura.
Trabalhos prévios haviam relatado que retinas de embriões de pinto secretavam um fator capaz de manter neurônios colinérgicos em cultura.
Esse fator era capaz de induzir a atividade da enzima colina acetiltransferase (ChAT), além de aumentar a expressão de receptores muscarínicos (De MELLO et al., 1990). Este mesmo fator estava relacionado com a transcrição
de um receptor muscarínico (SKOURUPA e KLEIN, 1993) por células maduras em cultura, mas não por culturas imaturas. Esse fator seria sensível à protease, possui cerca de 30-50KDa, é regulado por desenvolvimento e induz a transcrição seletiva do RNA para o receptor M2 muscarínico colinérgico além do aumento da respectiva proteína (McKINNON et al., 1998). Além de neurotrofinas, vários outros fatores com ação trófica no sistema nervoso têm sido relatados na retina, tais como FGF, TGFβ, GPA, GDNF, IGF e neurocinas, entre outras moléculas. Como cada um destes fatores tem diversos efeitos no SNC e SNP, nosso objetivo a princípio foi caracterizar componentes do MC de explantes de retina com atividade trófica em populações neuronais.
Com base nos dados acima introduzidos buscamos caracterizar o efeito trófico do meio condicionado por tecido retiniano, identificar as células responsáveis pela produção dos fatores responsáveis pela ação trófica do MC, fracionar e, se possível, identificar fatores retinianos com atividade trófica em populações neuronais diversas centrais e periféricas.
2. OBJETIVOS
1. Desenvolver culturas de explantes (simpático e GRD) ou purificadas de neurônios periféricos (simpático) como biosensores da atividade trófica dos meios condicionados (MCs) retinianos.
2. Caracterizar o efeito trófico de MCs sobre neurônios simpáticos de pinto isolados em cultura identificando algumas das vias de sinalização ativadas pelo conjunto de moléculas secretadas pelo tecido retiniano.
3. Purificar glia de Müller a partir de culturas de retina total (neurônios + glia) de embriões de pinto e camundongo e investigar o efeito trófico dos MCs por culturas purificadas de glia de Müller em neurônios periféricos (simpático e GRD) e centrais (CGRs).
4. Purificar uma população de neurônios centrais, as CGRs, de camundongo pelo método denominado de imunopurificação (immunopanning - Barres et al., 1988) e investigar o efeito trófico do MC por glia de Müller sobre a sobrevivência e a neuritogênese destas células isoladas em cultura em diferentes substratos de adesão.
5. Fracionar e concentrar o MC por glia de Müller no intuito de isolar frações que induzem sobrevida e/ou neuritogênese em neurônios periféricos e centrais.
6. Estudar as propriedades regenerativas do MC por glia de Müller de embrião de pinto em neurônios periféricas (GRD) e centrais (motoneurônios) de ratos adultos num modelo de transecção do nervo ciático (in vivo).
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS E REAGENTES
Ácido ascórbico, fatores tróficos, anticorpos, Hoesch 33328, merosina, poli-L-lisina, Dnase tipo I e II, Albumina bovina sérica (BSA, do inglês, Bovine Serum Albumin; Sigma), laminina (Invitrogen, SP), tripsina, papaína e solução de ovomucóide (Wortington Biochemical Corporation), Soro Fetal Bovino (SFB) GIBCO ou do Biocampo. Fator de crescimento do nervo (NGF 2.5S;
Invitrogen, SP). Meio de cultura celular, meio basal de Eagle (BME do inglês, Basal Medium Eagle) e Meio basal de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM do inglês, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Invitrogen, SP), Cloridrato de Xilazina (Rumpom, Bayer), Cloridrato de Quetamina (Vetaset, Fort Dodge Laboratories), bis-acrilamida, SDS, Tris, metanol. Placas de cultura (24 poços, 4 poços, 35mm, 60mm ou 90mm Nunc ou Corning preferencialmente). Filtros Centricon ® (Millipore Corporation). Solução de Matrigel ® (Collaborative Biomedical Products). Para os experimentos de imunopurificação utilizamos placas sem tratamento, seguindo a orientação do protocolo descrito pelo Dr. Ben Barres (Universidade de Stanford, EUA). Os demais sais utilizados na parte experimental desta tese, seja no Laboratório de Neuroquímica, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF), Instituto de Bioquímica Medica (BioqMed) ou no Departamento de Anatomia Humana e Genética, em Oxford, foram de pureza Analítica.
