Serão descritas a seguir as seguintes análises: determinação da atividade ureática, determinação de solubilidade em KOH (proteína solúvel em KOH), determinação da acidez titulável, determinação de peróxido e análise pelo sistema infra-vermelho próximo (NIR´s).
4.3.1 Determinação da atividade ureática
A soja possui fatores antinutricionais que são termolábeis e que podem causar problemas nos animais não-ruminantes como inibição do crescimento, queda na digestibilidade da proteína, aumento nos requisitos de aminoácidos sulfurados, hipertrofia e hipersecreção do pâncreas.
Esta análise tem como objetivo, determinar a redução na atividade da enzima urease, presente no grão de soja, e que é destruída pelo calor. Existe uma correlação direta entre os fatores antinutricionais e a urease, ambos são termolábeis, destruídos pelo calor. Portanto, com a inativação da enzima urease teoricamente os fatores antinutricionais estariam destruídos. De uma maneira geral essa análise determina se o farelo de soja recebeu processamento térmico suficiente para inativar os fatores antinutricionais presentes no grão de soja.
A análise de atividade ureática é um bom indicativo de processamento térmico adequado ou inadequado do farelo de soja (Tabela2), como resultado dessa análise podemos observar que atividade ureática com valor de pH variando de 0,01 até no máximo de 0,20, indicam que o farelo passou por um adequado processamento térmico, objetivando a destruição dos fatores antinutricionais.
Existem, no entanto, algumas limitações para os resultados encontrados na análise. Em alguns casos, mesmo com a análise de atividade ureática ao redor de zero, ainda assim poderemos encontrar inibidores de tripsina no farelo. A estatística mostra que em algumas análises de atividade ureática com valor próximo de zero, foi determinado ainda a presença de 4 a 8% dos fatores antinutricionais no farelo de soja (RUNHO, 2001)
CLASSIFICAÇÃO ATIVIDADE UREÁTICA Excelente 0,01 -0,05
Boa 0,06 – 0,20 Regular 0,21 – 0,31 Deficientes >0,30
TABELA 2 – PADRÃO DE ATIVIDADE UREÁTICA
Esta análise é aplicada em todos os produtos desengordurados de grãos de soja, determina a atividade ureática pela medida de variação do pH nas específicas condições da prova.
Marcha Analítica:
• Pesar 0,4 gramas da amostra em duplicata, transportar integralmente para um tubo de ensaio e adicionar 10 ml de solução tampão de fosfato pH 7,0. Agitar sem inverter o tubo. Colocar em banho-maria a 30ºC durante 30 minutos. Da mesma forma, repetir a operação com o outro tubo de ensaio, porém adicionar 10 ml da solução tamponada de uréia pH 7,0;
• Para facilidade operacional, ao colocarmos os tubos no banho-maria devemos observar entre os mesmos, um intervalo de 5 minutos. Os tubos devem ser agitados sem inverter a cada 5 minutos. Retirá-los após decorrer exatamente 30 minutos da colocação de cada um deles no banho. Transferir o líquido sobrenadante de cada tubo para um béquer de 10ml individualmente, e exatamente 5 minutos após a retirada do banho-maria medir o pH de cada um deles.
Cálculo:
Atividade Ureática = (pH da análise – pH em branco)
Se na determinação do pH da análise o aparelho demorar para se estabelecer uma marcação firme, convém examinar o eletrodo, pois este é freqüentemente obstruído por uma película precipitada constituída pela fração solúvel de proteína de soja.
Segue a figura 18 está relacionada com a determinação da atividade ureática.
FIGURA 18 – ATIVIDADE UREÁTICA
4.3.2 Solubilidade em KOH – proteína solúvel em KOH
Solubilidade pode ser conceituada como a capacidade de uma substância dissolver em outra. Esta capacidade, no que diz respeito à dissolução de um sólido em um líquido é limitada, ou seja, existe um máximo de soluto que podemos dissolver em certa quantidade de um solvente.
Esta análise consiste em uma metodologia para se avaliar a qualidade dos alimentos que contem soja. A proteína solúvel é aquela disponível para a absorção pelo animal, sendo assim, quanto maior a quantidade de proteína solúvel, melhor a disponibilidade da proteína e dos aminoácidos para o animal. . O grão de soja pode apresentar até 100% de sua proteína bruta, solúvel em KOH. Contudo, observamos que à medida que submetemos o grão de soja ao processamento térmico, com o objetivo de destruirmos os fatores antinutricionais presentes, verificamos uma queda na solubilidade da proteína e consequentemente uma queda na disponibilidade da proteína e dos aminoácidos para os animais. Para a classificação do farelo de soja em relação a quantidade de proteína solúvel (Tabela 3) encontrada em análises, podemos considerar que o farelo que apresentar proteína solúvel acima de 80% passou por um adequado processamento térmico, tendo mantido quase inalterada a qualidade de sua proteína, ou seja, com um mínimo de desnaturação.
Proteína solúvel abaixo de 80%, indica a ocorrência de uma desnaturação significativa na proteína da soja, afetando diretamente a disponibilidade da proteína e dos aminoácidos presentes no farelo (RUNHO, 2001).
CLASSIFICAÇÃO SOLUBILIDADE EM KOH Excelente > 85%
Boa > 80% Razoável > 75% Deficiente <75 %
Resultados destas análises mostram que amostras de diferentes farelos de soja com solubilidade da proteína acima de 80%, ou seja, dentro do padrão mínimo para o ingrediente, apresentaram respostas diferentes no desempenho dos animais. Como conclusão podemos verificar que tanto a atividade ureática como a análise de proteína solúvel nos indicam sobre a qualidade de processamento recebido pelo farelo de soja, e, portanto sobre a qualidade nutricional deste ingrediente. Com isso, pode-se trabalhar com maior garantia de estarmos fornecendo nutrientes em qualidade e quantidade bem próximas àquelas as quais estamos formulando.
Reagentes:
• Solução KOH 0,20%.
Vidrarias e equipamentos:
• Centrífuga, digestor Kjeldahl e conjunto de destilação, balões de Kjeldahl de 800 ml, erlenmayer, agitador.
Marcha analítica:
• Pesar 1g da amostra e transferir para um erlenmeyer;
• Adicional 50ml de solução KOH 0,20%;
• Agitar por 20 minutos;
• Passar o conteúdo para ser centrifugado por 10 minutos;
• Após centrifugar, transferir 25 ml do sobrenadante para o balão de Kjeldahl e colocar no digestor Kjeldahl;
4.3.3 Determinação da acidez titulável
A acidez de uma gordura é freqüentemente expressa em termos de ácidos graxos livres, a qual é medida como uma quantidade em mg de hidróxido de sódio requeridos para neutralizar os ácidos graxos livres de um grama de gordura. A pressuposição em geral é feita em relação ao acido oléico como padrão. Um aumento de ácidos graxos livres em gorduras pode indicar deterioração na qualidade devido ao aumento da hidrólise e ao desenvolvimento da rancidez. Contudo, um nível elevado de acidez nas gorduras nem sempre é indicativo de má qualidade. Por isso, é importante impedir o inicio da formação de radicais livres, que poderá ser feito pelo manejo adequado de produção e armazenamento.
Reagentes:
• Solução tampão pH 4,0, solução tampão pH 7,0, hidróxido de sódio (NaOH).
Vidrarias e equipamentos:
• Potenciômetro, bureta (25ml).
Marcha analítica:
1. Pesar 5,0g da amostra em um erlenmeyer;
2. Adicionar 60ml de água deionizada e deixar repousar por 30 minutos; 3. Agitar de cinco em cinco minutos;
4. Titular com solução de NaOH 0,1N, até pH 7,0 (viragem da cor), anotar o volume gasto;
4.3.4 Determinação do peróxido (Px)
As farinhas de origem animal são ricas em gorduras e tem maior facilidade em se autoxidarem, pelo inicio da formação de radicais livres. A revisão feita por Rutz e Lima (1994), enfatiza que a oxidação é um processo autocatalítico e desenvolve-se em aceleração crescente, uma vez iniciada.
Fatores como temperatura, enzimas, luz e íons metálicos podem influenciar a formação de radicais livres. O radical livre em contato com oxigênio molecular forma um peróxido que, em reação com outra molécula oxidável, induz a formação de hidroperóxidos e outro radical livre.
Os hidroperóxidos dão origem a dois radicais livres, capazes de atacar outras moléculas e formar mais radicais livres, dando assim uma progressão geométrica. As moléculas formadas, contendo o radical livre, ao se romperem formam produtos de peso molecular mais baixo (aldeídos, cetonas, álcoois e ésteres), os quais são voláteis e responsáveis pelos odores da rancificação (BELLAVER, 2005).
Reagentes:
• Ácido acético, ácido clorídrico, amido, butilhidroxitolueno (BHT), clorofórmio, dicromato de potássio, iodeto de potássio, tiossulfato de sódio, solução ácido acético + clorofórmio (3:2), solução indicadora de amido 1%.
Vidrarias e equipamentos:
• Aparelho para extração de lipídio tipo Soxhlet, balança analítica, balão volumétrico, papel de filtro, estufa de secagem, bureta, proveta de 100ml,
Marcha analítica:
• Pesar 3,0 gramas das amostras e transferir as amostras para o cartucho;
• Colocar os cartuchos com as amostras nos respectivos balões volumétricos já secos em estufa, resfriados em dessecador, pesados e registrar os pesos;
• Adicionar o éter + BHT nos balões até sifonar, acoplar os balões no extrator e ligar o extrator e a torneira de água, após 3 horas recuperar o éter + BHT até restar no balão apenas o extrato etéreo;
• Colocar os balões em estufa de secagem a 105ºC por duas horas e meia e esfriar os balões em dessecador e então pesar. Calcular o extrato etéreo através da diferença entre o peso do balão vazio e o balão retirado da estufa com o extrato etéreo;
• Adicionar 0,5ml de solução de iodeto de potássio saturada e 30ml da mistura ácido acético + clorofórmio, agitar até que ocorra a dissolução e permanecer em descanso por um minuto, adicionar 30ml de água destilada e agitar novamente, adicionar 1ml da solução de amido e então titular com a solução de tiossulfato de sódio 0,01N até desaparecer a cor azul;
• Foi feito um branco com a mistura clorofórmio + ácido acético e a solução de amido;
• O peróxido (Px), em meq/1000g de gordura, é determinado segundo a fórmula:
Px = ((V1-V2) x N x F x 1000)/ P
V1 = volume de tiossulfato de sódio gasto na titulação; V2 = volume de tiossulfato de sódio gasto na titulação do branco;
N = normalidade; F = fator de correção;
Segue a figura 19, que está relacionada com a determinação do peróxido.
FIGURA 19 – DETERMINAÇÃO DO PERÓXIDO
4.3.5 Análise pelo sistema infra-vermelho próximo (NIR´s)
As análises pelo NIR´s são realizadas apenas quando requeridas pelo cliente e quando a amostra consta no banco de dados do infra-vermelho. Os modelos disponíveis no banco de dados do NIR´s do laboratório são: silagem de milho, feno geral, aveia e azevém (plantas inteiras), cana, silagem de grão úmido e ração total misturada. Para análise por espectroscopia na região do infravermelho segue o seguinte procedimento:
• Anota o peso úmido;
• Seca a amostra a 65º C;
• Anota o peso seco;
• A amostra é moída e homogeinizada;
• Completa o disco com a amostra (o disco mede 4 cm de diâmetro por 1 de profundidade);
• O disco é então acoplado ao NIR´s e a gaveta é fechada, procedendo-se a leitura da amostra;
• Após poucos instantes, o computador apresenta o espectro da amostra e os teores nutricionais, sendo o laudo impresso em seguida.
A análise bromatológica de ingredientes que são utilizados na alimentação animal é de grande importância para se formular rações de qualidade. No entanto, é importante que os laboratórios busquem trabalhar dentro dos padrões nacionais e internacionais de qualidade para garantir a confiabilidade de seus resultados.