Ovócitos

Os ovócitos vitelogênicos das quatro espécies estudadas apresentaram padrão morfológico e histoquímico semelhantes quanto aos glóbulos de vitelo, zona radiata interna e células foliculares, variando quanto à constituição dos alvéolos corticais e zona radiata externa que foram espécie-específicos como também detectado por outros autores (BAZZOLI & RIZZO, 1990; BAZZOLI, 1992; BAZZOLI & GODINHO, 1994; RIZZO et al., 1998; MOTTA et al., 2005).

Polissacarídeos ácidos são comumente encontrados na superfície de ovos adesivos, como na pirambeba Serrasalmus brandtii (RIZZO & BAZZOLI, 1991), em Romanichthys valsanicola (RIEHL & PATZNER, 1998), e em traíras (SCARPELLI, 2005). Apesar da presença de polissacarídeos neutros e ácidos na zona radiata externa, os ovos das espécies estudas não são adesivos (SATO et al., 2003a). Estas moléculas também estão presentes nos alvéolos corticais, sendo liberados no espaço perivitelínico durante a reação cortical, interagindo com a zona radiata, evitando a polispermia (TYLER & SUMPTER, 1996).

A zona radiata interna e glóbulos de vitelo não apresentaram reatividade para nenhuma das lectinas analisadas. De fato, a camada interna da zona radiata, que confere proteção mecânica ao embrião em desenvolvimento, é constituída predominantemente por proteínas, contendo poucos resíduos de carboidratos (BRIVIO et al., 1991;

BONSIGNORIO et al., 1996; GURAYA, 1996; MURATA et al., 1997), sendo homóloga à zona pelúcida de mamíferos (MURATA et al., 1997; SCAPIGLIATI et al., 1999).

A zona radiata externa mostrou reatividade para quase todas as lectinas utilizadas. Reação positiva para LTA e UEA-I, específica para α-L-fucose, foi detectada em L. obtusidens e P. argenteus. Há evidências que os carboidratos tem papel na ligação espécie-específica entre gametas de vertebrados (MENGERINK & VACQUIER, 2001). Estudos têm demonstrado que oligossacarídeos de fucose podem mediar a ligação inicial entre gametas e início da reação acrossômica em ouriço do mar (DELL et al., 1999). A interação carboidrato-carboidrato foi demonstrada em truta entre gametas de truta arco-íris, mais especificamente entre o gangliosoídeo (KDN)GM3 (KDNα2→3Galβ4Glcβ1), abundante na superfície do espermatozóide, e Gg3 (GalNAcβ4Galβ4Glcβ1), encontrado na região micropilar dos ovos dessa espécie (YU et al., 2002). Fator de iniciação de motilidade espermática reconhecido pela lectina ConA na região micropilar de ovos de arenque marinho já foi identificado e isolado (PILLAI et al., 1993).

Em L. obtusidens, os alvéolos corticais apresentaram polissacarídeos neutros, e em B. orthotaenia, P. argenteus e S. brasiliensis, polissacarídeos carboxilados, enquanto a histoquímica de lectinas evidenciou a presença de fucose para todas as espécies, galactose e GalNAc em L. obtusidens e S. brasiliensis, e Galβ1-3 GalNAc apenas para S. brasiliensis. Estudo recente utilizando lectinas com diferentes especificidades também demonstrou variação no conteúdo dos alvéolos corticais em várias espécies de teleósteos nototenioides (MOTTA et al., 2005). Além das variações espécie-específicas no conteúdo dos alvéolos corticais, também podem ocorrer variações na composição das vesículas corticais durante o desenvolvimento ovocitário (OHTA et al., 1990).

Lectinas com mesma especificidade podem apresentar diferenças na afinidade de ligação pelo resíduo de carboidrato reconhecido (HAYAT, 1993; LIS & SHARON, 1998), como observado no presente trabalho pela reação positiva de UEA-I e negativa de LTA, ambas com especificidade para α-L-fucose, em alvéolos corticais de B. orthotaenia, P. argenteus e S. brasiliensis.

No presente estudo, além das diferenças observadas na constituição dos alvéolos corticais e da zona radiata externa, observou-se também diferenças ultra-estrutuais na superfície dos ovócitos. A presença de rede fibrilar observada em P. argenteus foi relatada em Prochilodus affinis (RIZZO & BAZZOLI, 1993) e Prochilodus scrofa (RIZZO et al., 2002), e a diferença na densidade entre poros-canais observada no presente estudo também

foi constatada entre ovos de algumas espécies de peixes Perciformes (LI et al., 2000). Zona radiata com poros-canais ou rede fibrilar são geralmente encontradas em ovos não adesivos (RIZZO & BAZZOLI, 1993; RIZZO et al., 1998; RIZZO et al., 2002), ocorrendo também em ovos adesivos como na traíra, Hoplias malabaricus (SCARPELLI, 2005).

O aspecto ultraestrutural da micrópila é importante para identificação de ovos (RIEHL, 1993; LI et al., 2000). A micrópila das quatro espécies em estudo apresentou forma de funil, similar a salmonídeos e truta (GROOT & ALDERDICE, 1985), P. affinis (RIZZO & BAZZOLI, 1993), alguns anostomideos e Salminus hilarii (RICARDO et al., 1996) sendo também o tipo mais freqüente relatado na literatura (HART, 1990; GURAYA, 1996). A micrópila de B. orthotaenia e S. brasiliensis mostraram maior similaridade, apresentando pregas no vestíbulo micropilar, que podem ser uma estratégia para facilitar a fertilização nestas espécies. Presença de pregas proeminentes em espiral na parede do vestíbulo micropilar foi relatado em zebrafish (HART & DONOVAN, 1983). Outras estruturas como filamentos de ancoragem circundando a micrópila são observados em várias espécies de peixes como Gobiesocidae (BREINING & BRITZ, 2000) e piranhas Serrasalmus spilopleura (RIZZO et al. 2002; BARRETO, 2001) e Serrasalmus nattereri (WIRZ-HLAVACEK & HART, 1990), sendo responsável pela fixação do ovo ao substrato nessas espécies. Embora o significado funcional das variações ultra-estruturais e dos açucares presentes na superfície ovocitária não terem sido completamente esclarecidos, ambos podem ser importantes no processo de fertilização, na adesividade de ovos e proteção contra patógenos no meio ambiente.

2. Desenvolvimento embrionário

A embriogênese ocorreu de forma semelhante nas quatro espécies, como também relatado em outros teleósteos neotropicais (CARDOSO et al., 1995; ANDRADE-TALMELLI et al., 2001; LUZ et al., 2001; MORRISON et al., 2001; NAKATANI et al., 2001; REYNALTE-TATAJE et al., 2001; BORÇATO et al., 2004). No presente estudo, durante a clivagem, os blastômeros sofreram divisões mitóticas simétricas e simultâneas, similar a zebrafish (KIMMEL et al., 1995). Os blastômeros nessa fase mantêm-se unidos por junções do tipo gap e junções de adesão (LANGELAND & KIMMEL, 1997) e, enquanto as divisões mitóticas são simétricas e simultâneas, as funções celulares básicas do embrião como metabolismo e divisão celular dependem de produtos gênicos maternos

processados durante a ovogênese (PELEGRI, 2003). Nesse período, observaram-se embriões com diferenças no número de células, apesar de apresentaram o mesmo tempo de desenvolvimento. Essa assincronia durante a clivagem foi relatada em zebrafish (KIMMEL et al., 1995) e na tilápia, Oreochromis niloticus (MORRISON et al., 2001), mesmo para ovos fertilizados simultaneamente e mantidos sob ótimas condições. A partir de 32 blastômeros, as clivagens tornaram-se assimétricas nas quatro espécies em estudo. Essa heterogeneidade no tamanho das células foi constatada a partir da fase de 16 blastômeros para O. niloticus (MORISSON et al., 2001) e 32 blastômeros em zebrafish (KIMMEL et al., 1995; LANGELAND & KIMMEL, 1997).

A blástula alta das quatro espécies não apresentou cavitação do blastodisco. Em O. niloticus (MORRISON et al., 2001) e zebrafish (KIMMEL et al., 1995) foram observados apenas pequenos espaços extracelulares originados, provavelmente, pela perda de conexão entre as deep cells (FISHELSON, 1995). Assim como em zebrafish (KIMMEL et al., 1995; LANGELAND & KIMMEL, 1997), no presente estudo, ocorreu fusão dos blastômeros marginais do blatodisco na fase de blástula alta, originando a camada sincicial vitelínica (YSL) (KIMMEL & LAW, 1985; KIMMEL et al., 1995) e início da movimentação celular, caracterizando a epibolia (WARGA & KIMMEL, 1990).

Na gastrulação, ocorre o comprometimento do destino celular (KIMMEL et al., 1990), e o movimento de involução das deep cells que origina os folhetos germinativos (LANGELAND & KIMMEL, 1997). Estudos com zebrafish mutantes e com super-expressão gênica sugerem a participação de fatores da família Nodal na diferenciação do hipoblasto em endoderma e mesoderma (OBER et al., 2003). Durante epibolia, os microtúbulos contribuem para a migração YSL em direção ao pólo vegetativo, não havendo, entretanto, acoplamento da YSL e das células do blastoderma durante esse processo de migração. Mesmo inibindo a epibolia com taxol, estabilizador de microtúbulos, a gastrulação e a morfogênese parece prosseguir normalmente (SOLNICA-KREZEL & DRIEVER, 1994). No presente trabalho, observaram-se projeções citoplasmáticas das deep cells ao MEV, indicando migração ativa dessas células. Projeções de filopódios em deep cells durante migração celular também foram relatadas em Fundulus heteroclitus (TRINKAUS & ERICKSON, 1983) e zebrafish (WARGA & NÜSSLEIN-VOLHARD, 1999).

A YSL está envolvida na mobilização de vitelo durante a embriogênese (KRIEGER & FLEIG, 1999; SHAHSAVARANI, et al., 2002). No presente trabalho, observaram-se

através de histologia a emissão de projeções citoplasmáticas da YSL para o interior do compartimento vitelínico e a reabsorção de glóbulos de vitelo. Em Perca fluviatilis, o vitelo é degradado no compartimento vitelínico e a YSL participa apenas no transporte dos sub-produtos do vitelo para as demais células do embrião (KRIEGER & FLEIG, 1999).

Com o termino da epibolia, que culminou com o fechamento do blastóporo, ocorreu o início da somitogênese, como também observado na maioria dos teleósteos (CARDOSO et al., 1995; KIMMEL et al., 1995; PRIVILEGGI et al., 1997; MEIJIDE & GUERRERO, 2000; ANDRADE-TALMELLI et al., 2001; LUZ et al., 2001; NAKATANI et al., 2001; REYNALTE-TATAJE et al., 2001; PADILHA, 2003; BORÇATO et al., 2004; GOMES, 2005), exceto em O. niloticus cuja somitogênese inicia-se antes do término da epibolia (MORRISON et al., 2001). Isso pode ter ocorrido devido ao grande tamanho dos ovos dessa espécie quando comparados aos ovos das quatro espécies em estudo. Já foram identificados mais de 50 genes necessários para o desenvolvimento normal dos somitos, incluindo a via sinalizadora Notch que está envolvida na somitogênese de camundongo e galinha (STICKNEY et al., 2000). A notocorda também parece estar envolvida na somitogênese através da secreção de moléculas sinalizadoras (STICKNEY et al., 2000). Durante essa fase, as células dos somitos se diferenciam em esclerótomos e dermomiótomos (KIMMEL et al., 1995). Os dermomiótomos originarão as células musculares e os esclerótomos a cartilagem vertebral (KIMMEL et al. 1995; LANGELAND & KIMMEL, 1997). Nas quatro espécies em estudo, os desenvolvimentos do cálice óptico, vesícula ótica e tubo neural ocorram, durante a somitogênese, semelhante ao descrito para outras espécies de teleósteos (CARDOSO et al., 1995; KIMMEL et al., 1995; HILL & JOHNSTON, 1997; MORRISON et al., 2001; PADILHA, 2003; GOMES, 2005).

No presente estudo, a embriogênese das quatro espécies foi curta, ocorrendo entre 17h e 21h. Desenvolvimento embrionário rápido é característico de espécies migradoras, com estratégia reprodutiva sazonal, que apresentam alta fecundidade e ausência de cuidado parental (SATO et al., 2003a). A diferença no tempo de desenvolvimento nas quatro espécies relacionou-se com a temperatura da água. As larvas de L. obtusidens e P. argenteus, que foram mantidas a uma temperatura menor, eclodiram mais tardiamente, enquanto larvas de S. brasiliensis e B. orthotaenia eclodiram com um tempo menor e foram mantidas a temperaturas mais altas. Estudos mostram que animais ectotérmicos apresentam desenvolvimento mais acelerado em temperaturas mais elevadas, devido a

alterações que a temperatura induz nas atividades enzimáticas durante organogênese (OJANGUREN & BRAÑA, 2003).

3. Ontogênese larval

As larvas recém-eclodidas das quatro espécies em estudo apresentaram mandíbulas não formadas, olhos despigmentados e saco vitelínico grande, semelhante ao observado para a maioria das larvas de peixes neotropicais de água doce (NAKATANI et al., 2001). O grau de diferenciação da larva recém-eclodida varia entre as espécies, dependendo do tamanho do ovo (BLAXTER, 1969). Espécies que apresentam ovos pequenos e alta fecundidade têm o desenvolvimento embrionário mais rápido e larvas menos desenvolvidas, enquanto as que apresentam ovos grandes e baixa fecundidade têm desenvolvimento embrionário prolongado e maior grau de desenvolvimento das larvas (SATO et al., 2003a). Nesse sentido, peixe-lobo, Anarhichas lupus apresenta ovos grandes e larvas recém-eclodidas semelhantes aos juvenis, mantendo poucas características larvais como a presença do saco vitelínico (FALK-PETERSEN & HANSEN, 2001), enquanto espécies com larvas pouco desenvolvidas apresentam ovos pequenos, tais como Leporinus macrocephalus (REYNALTE-TATAJE et al., 2001); Leporinus piau (BORÇARTO et al., 2004), Leporinus taeniatus (PADILHA, 2003), Pimelodus maculatus (LUZ et al., 2001) e Prochilodus lineatus (SILVEIRA et al., 2004). De acordo com SANCHES et al. (1999), larvas de peixes com baixa fecundidade são geralmente mais desenvolvidas, apresentando, conseqüentemente, vantagens ecológicas, pois são capazes de explorar mais nichos e são menos susceptíveis a predação.

A reabsorção do saco vitelínico variou entre as quatro espécies em estudo, desde 2 dias para S. brasiliensis até 5 dias para L obtusidens, e a abertura da boca precedeu 1 dia a total reabsorção do saco vitelínico, semelhante ao observado em outros estudos (NOGUEIRA, 2000; GODINHO et al., 2003). Com a abertura da boca, observou-se o desenvolvimento de dentes nas larvas de B. orthotaenia e S. brasiliensis. Através de análises ao MEV, também foi possível visualizar delicadas estruturas de apreensão em larvas de P. argenteus. No presente estudo, observou-se canibalismo nas larvas de B. orthotaenia e S. brasiliensis como também relatado por outros autores (ANDRADE-TALMELLI, 2001; SANTOS & GODINHO, 2002; GODINHO et al., 2003; VEGA-ORELLANA et al., 2005). Devido ao alto índice de canibalismo, larvas de S. brasiliensis

são rotineiramente alimentadas com larvas de Prochilodus ssp, aumentando a sobrevivência das larvas cerca 85% (VEGA-ORELLANA et al., 2005). A mudança da alimentação endógena para exógena é uma fase crítica do desenvolvimento inicial, apresentando, freqüentemente, altos índices de mortalidade das larvas (GORDON & HECHT, 2002). Na maioria das larvas, durante a fase de primeira alimentação, o trato digestivo é curto, está relativamente indiferenciado e apresenta baixa atividade de enzimas digestivas (GORDON & HECHT, 2002). No presente estudo, o trato digestivo apresentou maior similaridade entre B. orthotaenia e S. brasiliensis, que apresentaram intestino com pregueamento da mucosa, e entre L. obtusidens e P. argenteus, que não apresentaram tais pregueamentos. Essa característica pode está relacionada com o tipo de alimentação das pós-larvas, já que as primeiras se alimentam de ictioplânctons, e as últimas de zooplânctons. No estudo do desenvolvimento de proteinases digestiva em larvas de dourado S. brasiliensis, ocorreu baixa atividade enzimática no início da alimentação exógena, sugerindo que a morfologia do trato digestivo não implica na sua funcionalidade (VEGA-ORELLANA et al., 2005). Ao contrário, larvas de arenque, que se desenvolvem mais tardiamente, eclodem com intestino funcional (HILL & JOHNSTON, 1997). Em larvas de tilápia, O. niloticus, detectaram-se atividade de seis enzimas digestivas antes do início da alimentação exógena, indicando que enterócitos podem produzir enzimas digestivas nesta fase, particularmente peptidase e fosfatase alcalina (TENGJAROENKUL, 2002).

A diferenciação e morfogênese do fígado ocorreram logo após eclosão em B. orthotaenia e S. brasiliensis e com 1 dia após eclosão em L. obtusidens e P. argenteus. De acordo com OBER et al. (2003), a diferenciação das células endodérmicas da porção ventral do intestino em hepatócitos requer a interação dessas células com tecidos adjacentes, como o mesoderma cardíaco, através da sinalização de proteínas da família das BMP (Bone Morphogenic Proteins) e membros da família das FGF (Fibroblast Growth Factor). No presente estudo, antes da reabsorção total do saco vitelínico, as larvas já apresentavam o pâncreas com porção exócrina e endócrina diferenciadas e apenas uma ilhota pancreática, assim como observado em zebrafish (OBER et al., 2003). O pâncreas também necessita da interação com tecidos adjacentes para sua diferenciação, sugerindo que a notocorda é requerida, em parte, para o desenvolvimento do mesmo através da supressão da expressão do gene Shh do endoderma (OBER et al., 2003). Fígado e pâncreas já diferenciados são observados em larvas que iniciam a alimentação exógena logo após

eclosão tais como em peixe-palhaço Amphiprion percula (GORDON & HECHT, 2002) e peixe-lobo, A. lupus (FALK-PETERSEN & HANSEN, 2001).

O pronefro se desenvolveu de forma similar nas quatro espécies, sendo observado desde a eclosão das larvas. De acordo com KIMMEL et al. (1995), o pronefro desenvolve-se na fadesenvolve-se inicial da somitogênedesenvolve-se entre o desenvolve-segundo e o terceiro somito. Nos peixes, o pronefro se diferencia em mesonefro apenas nos indivíduos juvenis/adultos (DRUMMOND et al. 1998). As células germinativas primordiais foram identificadas a partir do 1 º dia após eclosão das larvas entre o intestino e o rim. Sua localização e características morfológicas foram semelhantes ao descrito para outros teleósteos (SATOH & EGAMI, 1972; HAMAGUCHI, 1982; BRAAT et al., 1999; MORISSON et al., 2001). Esboço da bexiga gasosa surgiu com 2 dias para B. orthotaenia e S. brasiliensis, e com 3 dias para L. obtusidens e P. argenteus, apresentando epitélio de revestimento simples pavimentoso, similar ao relatado em outros (SANTOS, 1992; SANTOS & GODINHO, 1996; NOGUEIRA, 2000; SANTOS & GODINHO, 2002; GODINHO et al., 2003). O desenvolvimento do coração foi semelhante ao observado em zebrafish, com seu aparecimento durante a somitogênese, e espessamento somente do miocárdio do ventrículo ao longo da ontogênese larval (YELON & STAINIER, 1999; HU et al., 2000). O coração é primeiro órgão definitivo a se desenvolver e tornar-se funcional durante a embriogênese (HU et al., 2000).

O desenvolvimento dos órgãos sensoriais é importante para a sobrevivência das larvas e está intimamente relacionado com o início da alimentação exógena, fuga de predadores e migração vertical na coluna d’água (MATSUOKA, 2001). Nas quatro espécies em estudo, os olhos, o ouvido interno, a fossa nasal e os neuromastos do sistema da linha lateral, foram as primeiras estruturas sensitivas a se desenvolverem e os botões gustativos os últimos, sendo identificados após a abertura da boca, localizando-se apenas nos lábios. Os botões gustativos podem estar situados no epitélio dos lábios, cavidade orofaringeal, barbilhões, cabeça e algumas vezes por todo o corpo (HANSEN et al., 2002). Em zebrafish, os botões gustativos foram observados com 3-4 dias nos lábios e com 4-5 dias nos arcos branquiais (HANSEN et al., 2002). De acordo com FALK-PETERSEN & HANSEN (2000) a presença dessa estrutura é um indicador que as larvas de peixe-lobo, A. lupus, já estão prontas para início da alimentação exógena.

A distribuição dos neuromastos, responsáveis pela percepção de vibração na água, é espécie-especifica e acompanha a filogenia (GHYSEN & DAMBLY-CHAUDÈRE, 2004).

Em algumas espécies, o neuromasto está envolvido com o sistema eletro-sensorial através de uma especialização das células sensitivas (DAMBLY-CHAUDÈRE, et al., 2004). Nas quatro espécies em estudo, observaram-se diferenças ultra-estruturais dos neuromastos, indicando que além da sua localização na superfície, padrões morfológicos dessas estruturas também podem apresentar espécie-especificidade e acompanhar a filogenia, já que foram observadas maiores similaridades entre espécies pertencentes ao mesmo grupo taxonômico, B. orthotaenia e S. brasiliensis (REIS, et al., 2003).

A presença de órgão adesivo ocorreu em B. orthotaenia e S. brasiliensis, como registrado previamente por NOGUEIRA (2000) e SANTOS & GODINHO (2002), sendo observado pela primeira vez ao MEV no presente trabalho. Esse órgão apresentou-se histologicamente semelhante em ambas espécies, com variações quanto a sua ultra-estrutura de superfície. A ultra-estrutura anatômica dos órgãos adesivos é muito diversa nos peixes, podendo ser constituída de numerosas células adesivas separadas, como em Nandus nandus (BRITZ, 1997) e Cichlasoma dimerus (MEIJIDE & GUERRERO, 2000), até uma glândula multicelular complexa como em alguns Gymnotiformes (BRITZ et al., 2000). Em espécies sedentárias, como C. dimerus, o órgão adesivo ajuda a prevenir a dispersão das larvas pelas correntes, facilitando o cuidado parental (MEIJIDE & GUERRERO, 2000). Há, ainda, outras funções para os órgãos adesivos: evitar que as larvas sejam lançadas para habitats menos favoráveis, tais como locais com menor concentração de oxigênio, e mantê-las aderidas a locais seguros contra predadores (BRITZ et al., 2000). De acordo com GODINHO et al. (2003), o órgão adesivo das larvas de espécies migradoras teria um papel importante na dispersão larval, aderindo-as à superfície da água, permitindo que sejam conduzidas pela correnteza. Em espécies migradoras, após a fecundação, os ovos são levados pelas águas em direção a remansos e lagoas marginais formadas durante a estação chuvosa, permanecendo nesses locais até o fim da fase juvenil (CAROLSFELD et al., 2003; POMPEU & GODINHO, 2003). Com isso, o órgão adesivo também poderia manter as larvas aderidas a substratos encontrados em remansos e lagoas marginais durante a fase inicial do desenvolvimento, período em que estão mais susceptíveis a predação.