SUPERFÍCIE OVOCITÁRIA E DESENVOLVIMENTO INICIAL
DE QUATRO ESPÉCIES DE PEIXES DE INTERESSE
COMERCIAL DA BACIA DO RIO SÃO FRANCISCO.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS BELO HORIZONTE – MG
SUPERFÍCIE OVOCITÁRIA E DESENVOLVIMENTO INICIAL
DE QUATRO ESPÉCIES DE PEIXES DE INTERESSE
COMERCIAL DA BACIA DO RIO SÃO FRANCISCO.
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biologia Celular.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS BELO HORIZONTE – MG
Essa dissertação foi realizada no Laboratório de Ictiohistologia do Departamento de Morfologia ICB/UFMG, Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias, CODEVASF-MG, Centro de Microscopia Eletrônica (CEMEL) ICB/UFMG e Laboratório de Microscopia Eletrônica e Microanálises do Departamento de Física ICEX/UFMG, sob orientação do Professor Dr. Nilo Bazzoli, co-orientação da Professora Dra. Elizete Rizzo e colaboração do Dr. Yoshimi Sato, com apoio das seguintes instituições:
- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG);
- Companhia de Desenvolvimento dos Vales do São Francisco e do Parnaíba (CODEVASF).
Dedico esta dissertação às mulheres da minha vida: minha mãe Maristela, minha avó Gilda e minha amada Maria Elvira.
A Deus, por todas as oportunidades concedidas para meu desenvolvimento espiritual, moral e intelectual;
A meus pais e meu irmão Pahan que apesar da distância sempre incentivaram minha busca pelo conhecimento;
A todos meus familiares, especialmente ao meu padrinho Marcos, à minha avó Gilda, aos meus tios Aimã e Jeová, e à minha irmãzinha Dayana pelo incentivo e pelo apoio;
À minha amada Maria Elvira, pelo amor, amizade e cumplicidade;
Aos professores, orientadores e amigos, Dra. Elizete Rizzo e Dr. Nilo Bazzoli que confiaram no meu trabalho e se dedicaram para realização desse projeto;
Ao Dr. Yoshimi Sato pela colaboração constante e aos funcionários da Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias pelo apoio logístico;
A todos do laboratório de Ictiohistologia: aos que acabaram de chegar (Flávia e Fabrício), aos que ainda estão presentes (Hélio, Santer, Fábio, Ralph, Paula, Heder), aos que fizeram parte da história do laboratório (Érika, Regina, Wesley, Renato, Ramón, Emmanuel e Fernanda) e especialmente à Mônica que muitas vezes desempenhou o papel de mãe e amiga.
Aos amigos do laboratório de Genética Molecular e de Microorganismos, pois foi lá que senti pela primeira vez o sabor de fazer ciência;
Aos amigos do curso de graduação em Ciências Biológicas e aos de pós-graduação em Biologia Celular;
Aos professores do curso de Pós-graduação em Biologia celular; Aos funcionários e professores do Departamento de Morfologia;
A todos que estiveram presentes em minha vida e que contribuíram de forma direta ou indireta para meu crescimento profissional.
“O rio somente alcança seus objetivos porque aprendeu a contornar obstáculos”. (Lao-Tsé)
RESUMO... i
ABSTRACT... ii
LISTA DE TABELAS... iii
LISTA DE FIGURAS... iv I. INTRODUÇÃO... 1 1. Espécies em estudo... 1 2. Ovócitos de peixes... 2 3. Desenvolvimento embrionário... 4 4. Ontogênese larval... 6 II. OBJETIVOS... 8 1. Objetivo geral... 8 2. Objetivos específicos... 8
III. MATERIAL E MÉTODOS... 9
1. Desova induzida... 9
2. Histologia e histoquímica de carboidratos... 9
3. Microscopia eletrônica de varredura... 10
4. Morfometria e análise estatística... 10
IV. RESULTADOS... 12
1. Histologia e histoquímica de ovócitos... 12
2. Ultra-estrutura da superfície ovocitária... 15
3. Desenvolvimento embrionário... 17 4. Ontogênese Larval... 23 V. DICUSSÃO... 34 1. Ovócitos... 34 2. Desenvolvimento embrionário... 36 3. Ontogênese Larval... 39 VI. CONCLUSÕES... 43
RESUMO
Em peixes, o desenvolvimento inicial compreende as etapas do ciclo biológico que abrange ovos, embriões e larvas até a reabsorção total do saco vitelínico, sendo importante por fornecer subsídios para aqüicultura, identificação de ovos e larvas na natureza, estudos taxonômicos/filogenéticos e de biologia do desenvolvimento. Características ultra-estruturais dos ovos estão relacionadas aos padrões de comportamento reprodutivo das espécies e acompanham a filogênese, e as moléculas de carboidratos presentes na superfície ovocitária participam nos processos de fertilização e de interação do ovo com o meio. O objetivo do presente trabalho foi analisar comparativamente a superfície e os resíduos de açucares terminais de ovócitos e a morfogênese durante embriogênese e ontogênese larval de Brycon orthotaenia, Leporinus obtusidens, Prochilodus argenteus e Salminus brasiliensis, peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco. Análises histológicas e histoquímicas de carboidratos mostraram características ovocitárias similares nas células foliculares, zona radiata interna e glóbulos de vitelo. Alvéolos corticais e zona radiata externa foram espécie-específicos quanto à constituição histoquímica. A ultra-estrutura da superfície ovocitária mostrou espécie-especificidade na densidade e distância entre poros-canais da zona radiata de B. orthotaenia, L. obtusidens e S. brasiliensis, presença de rede fibrilar em P. argenteus e micrópilas distintas nas quatro espécies. O desenvolvimento embrionário e a organogênese foram semelhantes, com embriogênese rápida, variando entre 17h e 21h em temperatura média de 25ºC. As larvas recém-eclodidas das quatro espécies são pouco desenvolvidas, com mandíbulas não formadas, olhos despigmentados e saco vitelínico grande. A reabsorção total do saco vitelínico variou de 2 dias após eclosão em S. brasiliensis até 5 dias em L. obtusidens e a abertura da boca precedeu um dia a reabsorção total do saco vitelínico. S. brasiliensis e B. orthotaenia apresentaram similaridades quanto à morfologia de ovos e larvas, tais como pregas no vestíbulo micropilar, órgão adesivo na cabeça das larvas, canibalismo e ultra-estrutura dos neuromastos, provavelmente devido à maior proximidade filogenética entre essas espécies.
ABSTRACT
In fishes, early development includes stages of life history, which comprise eggs, embryos and yolk-sac larvae, being important for providing subsidies for aquaculture, egg and larval identification, taxonomic/phylogenetic and developmental biology studies. Ultrastructural features of eggs are related to reproductive behavior and phylogeny, and carbohydrate molecules at oocyte surface play a role in fertilization and egg-environment interaction. The present work had the purpose of analyzing comparatively egg surface, sugar terminal residues in oocytes and the morphogenetic events of embryogenesis and larval ontogenesis in Brycon orthotaenia, Leporinus obtusidens, Prochilodus argenteus and Salminus brasiliensis, commercial fishes from São Francisco River basin. Histological analyses and carbohydrate histochemistry showed similar characteristics in follicular cells, inner layer of zona radiata and yolk globules among all species. Cortical alveoli and outer layer of zona radiata were species-specific. The oocyte surface ultrastructure showed species-specificity for density and distance of zona radiata pore-canals in B. orthotaenia, L. obtusidens and S. brasiliensis, fibrillar net in P. argenteus and different micropyles in all species. The embryonic and organ development were similar, with a brief embryogenesis, ranging from 17h to 21h (mean temperature of 25ºC). The hatching larvae are poorly developed in all species, showing no jaws, depigmented eyes and a big yolk sac. The total yolk sac reabsorption ranged from 2sd day post-hatching in S. brasiliensis to 5th day post-hatching in L. obtusidens and the larval mouth opened one day prior to total yolk sac reabsorption. S. brasiliensis and B. orthotaenia showed similarities in egg and larval morphology, such as ridges at micropylar vestibule, attachment organ on larval head, cannibalism and neuromast ultrastrutucture, which is probably due to phylogenetic proximity between both species.
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Lectinas utilizadas para caracterização histoquímica de resíduos de carboidratos... 10 Tabela II: Reatividade as estruturas ovocitárias à histoquímica de carboidratos em quatro espécies de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco... 12 Tabela III: Reatividade das lectinas na zona radiata externa (ZRE) e alvéolos corticais (AC) de ovócitos de quatro espécies de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco... 13 Tabela IV: Morfometria (média ± desvio-padrão) da superfície de ovócitos recém-desovados de espécies de interesse comercial da bacia do rio São Francisco ao MEV.... 15 Tabela V: Início (hh:mm) dos principais eventos da morfogênese durante embriogênese de quatro espécies de interesse comercial da bacia do rio São Francisco após fertilização à temperatura 23-27°C... 19 Tabela VI: Dados biométricos (média ± desvio-padrão) (mm) de larvas de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco em condições experimentais até a reabsorção total do saco vitelínico... 27
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Histologia e histoquímica de carboidratos em ovócitos de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco... 14 Figura 2: Superfície de ovócitos recém-desovados de espécies de peixes de interesse comercial da bacia do São Francisco ao MEV... 16 Figura 3: Desenvolvimento embrionário de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco ao MEV (A-E) e estereomicroscópio (F-G)... 20 Figura 4: Gastrulação de L. obtusidens ao MEV... 21
Figura 5: Somitogênese e camada sincicial vitelínica em embriões de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco ao MEV (A) e histologia (B-D)... 22 Figura 6: Secções histológicas de larvas de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco durante organogênese... 28 Figura 7: Secções histológicas de larvas de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco durante organogênese... 29 Figura 8: Secções histológicas de larvas de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco durante organogênese... 30 Figura 9: Fossa nasal e botões gustativos de larvas de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco ao MEV... 31 Figura 10: Neuromastos livres na superfície de larvas de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco ao MEV... 32 Figura 11: Órgão adesivo (seta) na cabeça de larvas de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco ao MEV... 33
I. INTRODUÇÃO
O desenvolvimento inicial de peixes compreende as etapas do ciclo biológico que abrange ovos, embriões e larvas até a reabsorção total do saco vitelínico, cujo estudo fornece subsídios para aqüicultura, para identificação de ovos e larvas na natureza, para estudos taxonômicos (NAKATANI et al., 2001) além de oferecer parâmetros importantes nas análises das relações evolutivas entre espécies (FUTUYMA, 2002; SILVEIRA, 2004). A maioria dos embriões de peixes são excelentes modelos experimentais no estudo dos mecanismos de desenvolvimento por apresentarem desenvolvimento relativamente rápido, fertilização e embriogênese externas e facilidade de manipulação e observação (LANGELAND & KIMMEL, 1997; HELFMAN et al., 2000).
Na piscicultura, os eventos da embriogênese são freqüentemente monitorados através de estereomicroscópio tendo em vista a determinação das taxas de fertilização e de anormalidades larvais que indicam a qualidade de ovos e larvas produzidos (SATO, 1999). Poucos estudos utilizaram a microscopia eletrônica na caracterização dos estágios dos desenvolvimentos embrionário e larval (MATSUOKA, 2001; SILVEIRA, 2004). Estes estudos permitem identificar alterações morfológicas no padrão normal de desenvolvimento, uma vez que embriões e larvas são sensíveis às variações ambientais e experimentais (MEIJIDE & GUERRERO, 2000; OWENS & BAER, 2000).
Zebrafish, Danio rerio, é um dos organismos mais utilizados como modelo experimental para estudos de biologia do desenvolvimento (KIMMEL et al., 1995; LANGELAND & KIMMEL, 1997). Considerando-se que os peixes representam aproximadamente 50% dos vertebrados e que apresentam grande diversidade de estratégias reprodutivas (NELSON, 1994), poucas espécies são estudadas. Com isso, análises dos desenvolvimentos embrionário e larval de outras espécies de peixes são relevantes para estudos dos mecanismos de desenvolvimento e determinação de modelos experimentais com estratégias reprodutivas diferentes.
1. Espécies em estudo
Os peixes em estudo são: matrinxã, Brycon orthotaenia Günther, 1864, piau-verdadeiro, Leporinus obtusidens (Valenciennes, 1836), curimatá-pacu, Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 e dourado, Salminus brasiliensis Valenciennes, 1850. Todas as
quatro espécies são peixes migradores de importância econômica na bacia do rio São Francisco, pertencem à ordem Characiformes, apresentam desova total e período reprodutivo curto na estação chuvosa (BRITISKI et al., 1984; REIS et al., 2003; SATO et al., 2003a). Estas espécies não se reproduzem em ambientes lênticos, e são rotineiramente submetidas à reprodução induzida na estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias – CODEVASF, MG, visando o repovoamento de ambientes impactados (SATO et al., 2003b).
O matrinxã é espécie endêmica da bacia do rio São Francisco e pertence à família Characidae (REIS et al., 2003). Tem hábito alimentar onívoro e pode atingir 7 Kg de peso corporal. Devido à degradação ambiental, esta espécie está ameaçada de extinção em algumas regiões do rio São Francisco (BRITISKI et al., 1984; SATO, 1999).
O piau-verdadeiro é encontrado também na bacia do Paraná e pertence à família Anostomidae (REIS et al., 2003). Têm hábito alimentar preferencialmente herbívoro (NELSON, 1984) e pode alcançar 7,5 Kg, sendo provavelmente a espécie que atinge maior porte dentro da família (BRITISKI et al., 1984; SATO, 1999; REIS et al., 2003).
O curimatã-pacu, também encontrado na bacia do Paraná, pertence à família Prochilodontidae e é peixe iliófago (BRITISKI et al., 1984; SATO, 1999; REIS et al., 2003). Já foram registrados indivíduos com mais de 9 Kg de peso corporal, sendo, possivelmente, a espécie de maior porte dentro da família (SATO, 1999).
O dourado, assim como o matrinxã, pertence à família Characidae e encontra-se ameaçado de extinção em algumas regiões da bacia do São Francisco, como à jusante da barragem de Sobradinho e à montante da barragem de Três Marias (BRITISKI et al., 1984; SATO, 1999; REIS et al., 2003). É espécie piscívora e pode atingir 1,4 m de comprimento e cerca de 30 Kg (SATO, 1999).
2. Ovócitos de peixes
A ovogênese é marcada por eventos seqüenciais de diferenciação e maturação dos folículos ovarianos, iniciando com a diferenciação das células germinativas primordiais (PGCs) em ovogônias. Estas entram em meiose originando os ovócitos que passarão pelas fases pré-vitelogênica e vitelogênica, finalizando-se com a maturação final ovocitária que culmina com a ovulação (SELMAN & WALLACE, 1989; TYLER & SUMPTER, 1996, PATIÑO & SULLIVAN, 2002).
Durante o crescimento do folículo, ocorre a formação da zona pelúcida que consiste na deposição de matriz extracelular entre ovócito e células foliculares. Na maioria dos peixes, a zona pelúcida é formada por duas camadas atravessadas por poros-canais, sendo também denominada zona radiata (ZR) (GURAYA, 1996). A camada interna consiste principalmente de proteínas, sendo homóloga a zona pelúcida de mamíferos (MURATA et al., 1997; SCAPIGLIATI et al., 1999) e a camada externa mostra uma combinação de proteínas e polissacarídeos (GURAYA, 1996), sendo responsável pelas interações dos ovos no meio aquático, além de proteger o embrião contra microorganismos patogênicos (KUDO & YAZAWA, 1997). Nos teleósteos, os folículos ovarianos desenvolvem-se de forma semelhante, havendo variações na composição, distribuição e grau de desenvolvimento dos alvéolos corticais, zona radiata e células foliculares, dependendo das estratégias reprodutivas das espécies (BAZZOLI & RIZZO, 1990; BAZZOLI, 1992; BAZZOLI & GODINHO, 1994; RIZZO et al., 1998).
Após desova, os ovos de peixes de água doce podem ser livres ou apresentar vários graus de adesividade, sendo geralmente livres em espécies migradoras e adesivos em espécies sedentárias (SATO, 1999). Análises dos padrões de superfície em ovos recém-desovados mostraram projeções da ZR como glóbulos, vilos e filamentos em ovos adesivos, e ZR lisa com poros-canais ou rede fibrilar em ovos não adesivos (RIZZO et al., 2002). Esses estudos mostram que as características do ovo estão relacionadas aos padrões de comportamento reprodutivo das espécies e acompanham a filogenia. Além dos arranjos de superfície, outros critérios também são necessários para caracterização e identificação dos ovos de peixes, tais como distância entre os poros-canais da ZR, diâmetro dos poros e morfologia da micrópila (RIEHL, 1993; LI et al., 2000).
Moléculas presentes na superfície de ovócitos têm papel determinante na fertilização e na interação do ovo com o meio. A presença de polissacarídeos ácidos na ZR torna os ovos adesivos quando em contato com a água (GURAYA, 1996). Em teleósteos, os espermatozóides ligam-se à parede do canal micropilar como primeiro nível de reconhecimento entre os gametas, ocorrendo a adesão e a fusão das membranas dos gametas na base do canal micropilar (HART, 1990; YU et al., 2002). Neste reconhecimento, como em outras interações celulares, há mediação de carboidratos presentes em glicoproteínas da ZR com receptores complementares pertencentes à família das lectinas na superfície dos espermatozóides (DELL et al., 1999, MENGERINK & VACQUIER, 2001; YU et al., 2002).
Lectinas são proteínas ou glicoproteínas naturais descritas em todos os reinos, desde de microorganismos até animais e plantas (NOSEK et al., 1984; SINGH et al., 1999; KILPATRICK, 2002) e apresentam sítios de ligações com açúcares específicos de polissacarídeos ou com glicoproteínas e glicolipídios (LIS & SHARON, 1998; RHODES & MILTON, 1998). Estas moléculas são excelentes ferramentas para identificação de resíduos de carboidratos, permitindo o esclarecimento de processos biológicos como vias de síntese e de endocitose de glicoconjugados, diagnósticos clínicos e determinação da estrutura de carboidratos e seus conjugados (KENNEDY et al., 1995; RHODES & MILTON, 1998; SINGH et al., 1999). Recentemente, uma lectina foi isolada de alvéolos corticais do peixe Carassius auratus gibelio, sendo a mesma lançada na superfície da ZR após fertilização, sugerindo sua participação no bloqueio da polispermia (DONG et al. 2004). Devido sua importância na fertilização, a glicobiologia de gametas tem sido investigada em várias classes de vetebrados, no entanto, pouca atenção tem sido atribuída aos peixes (SCHINDLER & VRIES, 1989; DELL et al., 1999, MENGERINK & VACQUIER, 2001; YU et al., 2002).
3. Desenvolvimento embrionário
O desenvolvimento embrionário em peixes compreende eventos morfogenéticos que ocorrem desde o ovo fertilizado até a eclosão da larva (KIMMEL et al., 1995). A duração da embriogênese varia entre as espécies, dependendo do tamanho dos ovos e das estratégias reprodutivas das espécies (SATO 1999; NAKATANI et al., 2001).
O desenvolvimento embrionário inicia-se após a fertilização dos ovos com a segregação dos pólos animal e vegetativo e clivagem do blastodisco (LANGELAND & KIMMEL, 1997). Os blastômeros nessa fase inicial estão unidos por junções do tipo gap e junções de adesão (LANGELAND & KIMMEL, 1997; PELEGRI, 2003). As cateninas e caderinas, antes presentes nas junções de adesão entre ovócito e células foliculares, não são degradadas durante a maturação do ovócito, e sim estocadas como complexos protéicos para serem reutilizadas durante a embriogênese (PELEGRI, 2003). Nessa fase, as funções celulares básicas do embrião como metabolismo e divisão celular dependem dos produtos gênicos maternos processados durante a ovogênese e presentes nos ovos no momento da fertilização (PELEGRI, 2003).
Na transição entre blástula e gástrula ocorre o início da ativação do genoma do embrião com mudança gradual do padrão de divisões celulares sincrônicos para assincrônicos e início da motilidade celular, caracterizando a epibolia (WARGA & KIMMEL, 1990; KANE & KIMMEL, 1993; HILL & JOHNSTON, 1997; PELEGRI, 2003). Durante epibolia há participação do citoesqueleto, com formação de dois arranjos distintos de microtúbulos. Um dos arranjos forma uma rede densa na camada sincicial vitelínica (YSL), originada da união de blastômeros marginais, e outro se estende da YSL em direção ao pólo vegetativo (SOLNICA-KREZEL & DRIEVER, 1994).
Em zebrafish, no início da gastrulação ocorre a segregação de células que mantiveram o plasma germinativo, dando origem às células germinativas primordiais (PGCs). Essas células estão localizadas em 4 pontos aleatórios do eixo do embrião, à margem da blastoderme, mais especificamente no hipoblasto (BRAAT et al. 1999; RAZ, 2002). O plasma germinativo é de origem materna, sendo evidenciado, através microscopia eletrônica de transmissão, pela presença de estruturas eletrodensas conhecidas como nuages, onde mitocôndrias associam-se a moléculas de RNAs e proteínas específicas da linhagem germinativa (HOGAN JR., 1978; WYLIE, 1999, 2000; HASHIMOTO et al., 2004). Na microscopia de luz, as PGCs são reconhecidas por seu grande tamanho, citoplasma levemente corado, núcleo altamente vesiculoso e nucléolo evidente (HAMAGUCHI, 1982; BRAAT et al. 1999). O RNA vasa, que codifica uma RNA helicase ATP-dependente da família DEAD Box, é um exemplo de molécula encontrada no plasma germinativo e utilizada como marcador molecular das PGCs (BRAAT et al., 1999; RAZ, 2003).
Durante a gastrulação ocorre o deslocamento das células do blastodisco, levando à separação do epiblasto e hipoblasto, formação da notocorda e a diferenciação dos folhetos germinativos (MULLINS, 1999; STICKNEY et al., 2000). Na epibolia, o epiblasto e a YSL expandem sobre o vitelo até ocorrer o fechamento do blastóporo (KIMMEL et al., 1995). Este evento é importante na aqüicultura para determinar a taxa de fertilização, uma vez que ovos não fertilizados dividem-se por partenogênese e degeneram durante desenvolvimento embrionário e os ovos gorados não são facilmente identificados antes desta fase (WOYNAROVICH & HORVÁT, 1980; RIZZO et al., 2003; SATO et al., 2003b).
O primeiro somito é geralmente formado logo após a gastrulação (STICKNEY et al., 2000). Evidências recentes sugerem que a via sinalizadora Notch, a qual está envolvida
na somitogênese de camundongo e de galinha, também participa na somitogênese de zebrafish (STICKNEY et al., 2000). Notch é um receptor transmembrana que se liga às proteínas da família Delta e Serrate. A união do ligante ao receptor Notch faz com que este seja clivado proteoliticamente, resultando na translocação de seu domínio citoplasmático para o núcleo, o qual regulará a expressão de outros genes (STRUHL & ADACHI, 1998; STICKNEY et al., 2000).
Em zebrafish, durante a fase inicial de segmentação do embrião, as PGCs migram até alcançarem o primeiro somito, formando lateralmente dois grupos. Em seguida, as PGCs migram até alcançarem o oitavo somito, onde encontram os primórdios das gônadas (BRAAT et al. 1999; RAZ, 2002). Estudos recentes sugerem que as células somáticas indicam a via migratória através de sinais atrativos e repulsivos (KUNWAR & LEHMAN, 2003). Um exemplo de molécula que atua durante a migração das PGCs em zebrafish é a quimiocina SDF-1, que é sinalizada pelas células somáticas e que se liga ao receptor Cxcr-4 encontrado nas PGCs (KNAUT et al., 2002; KUNWAR & RUTH, 2003).
4. Ontogênese larval
O período larval inicia-se após a eclosão e termina com a reabsorção do vitelo e início da alimentação exógena (HELFMAN et al., 2000). O grau de diferenciação da larva recém-eclodida varia entre as espécies, dependendo do tamanho do ovo (BLAXTER, 1969). A maioria das larvas de peixes de água doce eclode com boca e mandíbulas ainda não formadas, olhos despigmentados e saco vitelínico grande (NAKATANI et al., 2001). Poucas espécies, como o peixe-lobo, Anarhichas lupus, eclode com características externas semelhantes aos juvenis e órgãos internos já diferenciados, mantendo poucas características larvais como a presença do saco vitelínico (FALK-PETERSEN & HANSEN, 2001).
Antes da abertura da boca, as larvas nutrem-se do vitelo, que é reabsorvido constantemente através de endocitose via camada sincicial vitelínica (SHAHSAVARANI, et al., 2002). Para evitar aumento da mortalidade larval, alimentação exógena deve iniciar a partir do momento em que o vitelo foi completamente reabsorvido (TENGJAROENKUL et al., 2002).
O trato digestivo é originado do endoderma durante a embriogênese, havendo também a formação do fígado e do pâncreas a partir de células do endoderma (OBER et
al., 2003). Durante ontogênese larval, ocorre proliferação de células secretoras de muco e aumento do tamanho do fígado e do pâncreas (GORDON & HECHT, 2002). As larvas de peixes são divididas em 3 grupos de acordo com o desenvolvimento, morfologia, e secreção de enzimas no trato alimentar. O primeiro grupo apresenta um estômago funcional antes da mudança da alimentação endógena (vitelo) para exógena, como encontrado em Salmonidae e Cichlidae. O segundo incluem os que não tem um estômago funcional ou glândulas gástricas durante a fase larval, enquanto o terceiro permanece sem estomago durante a vida adulta, tais como Labridae e Cyprinidae (GORDON & HECHT, 2002). O desenvolvimento do sistema digestivo tem importância prática na piscicultura para determinação do tipo de alimentação a ser utilizada nessa fase do cultivo (TENGJAROENKUL et al., 2002) e tem sido pouco explorado para espécies brasileiras de importância comercial (VEGA-ORLLANA, et al., 2005).
O desenvolvimento do sistema circulatório tem início com o surgimento do coração no período de somitogênese do embrião, continuando durante o desenvolvimento da larva (LANGELAND & KIMMEL, 1997; YELON & STAINIER, 1999; HU et al., 2000). Neste período, as células sanguíneas são bombeadas através de sinusóides presentes no saco vitelínico e nas membranas das nadadeiras (HELFMAN et al., 2000).
Durante o desenvolvimento larval, a presença dos órgãos sensoriais é importante para a procura de alimento e fuga de predadores (MOORMAN, 2001). O olho é o primeiro a se desenvolver, principalmente em larvas pelágicas (SHAND, 1997). O desenvolvimento dos botões gustativos em peixes é pouco conhecido, bem como a descrição completa de sua formação e morfologia. Em peixes, o padrão de distribuição dos botões gustativos varia entre as espécies, podendo ser encontrados, além da cavidade orofaringeal e da boca, na superfície de barbatanas, lábios, cabeça ou sobre todo o corpo (MATSUOKA, 2001; HANSEN et al., 2002). Em peixes, os neuromastos são constituídos por mecanorreceptores responsáveis por perceber movimentos na água, estando localizados superficialmente na epiderme, constituindo os neuromastos livres, e/ou em sulcos e canais, formando o sistema da linha lateral (MATSUOKA, 2001; DIAZ et al., 2003).
A presença de órgão adesivo em larvas de peixes varia entre as espécies, dependendo das estratégias reprodutivas (BRITZ, et al., 2000). Em espécies sedentárias, como Cichlasoma dimerus, o órgão adesivo ajuda a prevenir a dispersão pelas correntes, facilitando o cuidado parental (MEIJIDE & GUERRERO, 2000).
II. OBJETIVOS
1. Objetivo geral
Analisar comparativamente superfície ovocitária, resíduos de açucares terminais de estruturas ovocitárias, e a morfogênese durante embriogênese e ontogênese larval de B. orthotaenia, L. obtusidens, P. argenteus e S. brasiliensis, peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco.
2. Objetivos específicos
• Comparar a morfologia, densidade e distância entre os poros-canais da zona radiata, ao microscópio eletrônico de varredura (MEV), na superfície dos ovócitos recém-desovados.
• Identificar açucares terminais em ovócitos através de técnicas histoquímicas de carboidratos;
• Identificar e estabelecer a duração das diferentes fases do desenvolvimento embrionário ao estériomicroscópio;
• Analisar o desenvolvimento embrionário ao MEV;
• Determinar o comprimento corporal, e o comprimento e a altura do saco vitelínico durante ontogênese larval;
• Analisar a organogênese através de histologia;
• Determinar a fase em que ocorrem a reabsorção total do saco vitelínico e a abertura da boca;
• Analisar o desenvolvimento e a distribuição de órgãos sensoriais e órgãos adesivos; • Comparar a morfologia de ovos, embriões e larvas com as estratégias reprodutivas
III. MATERIAL E MÉTODOS
1. Desova induzida
Reprodutores de B. orthotaenia, L. obtusidens, P. argenteus e S. brasiliensis foram submetidos à reprodução induzida por hipofisação, utilizando 2 injeções de extrato bruto de hipófise de carpa comum na Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias – CODEVASF, de acordo com a rotina da Estação (SATO et al., 2003b). A fertilização foi realizada a seco, misturando-se sêmen aos ovócitos extruídos e adicionando, em seguida, água à mistura. Os ovos fertilizados foram mantidos em incubadoras do tipo funil com 30L de capacidade, com água circulante a 23-27ºC. A embriogênese e a ontogênese larval foram monitoradas até a reabsorção do saco vitelínico com auxílio de estereomicroscópio. 2. Histologia e histoquímica de carboidratos
Amostras de ovários maduros e ovócitos recém-desovados foram fixadas em líquido de Bouin por 8-12 h, incluídas em parafina, seccionadas com 5-7 μm de espessura, coradas com hematoxilina e eosina, e submetidas às seguintes técnicas histoquímicas: ácido periódico Schiff (PAS), Alcian blue pH 2,5 e Alcian blue pH 0,5 (PEARSE, 1985).
Para identificação de resíduos terminais de carboidratos nos ovócitos, secções de 5-7 μm foram submetidas à histoquímica de lectinas conjugadas com peroxidase (Sigma Aldrich) em concentrações determinadas previamente por SCARPELLI (2005) (Tab. I). O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com peróxido de hidrogênio 3% em metanol por 30 min e o bloqueio de sítios inespecíficos, com gelatina tipo A 3% de pele suína (Sigma Aldrich Co.) em tampão tris-HCl pH 7,6 por 1 h, com traços de cloreto de cálcio e magnésio (RHODES & MILTON, 1998). A incubação com lectinas foi realizada em câmara úmida por 1h 30 min à temperatura ambiente e a revelação com 3-3’diaminobenzidina (DAB) em solução tampão Tris-HCl, pH 7,6, contendo 0,2 μg/ml de peróxido de hidrogênio, durante 10 min à temperatura ambiente. O controle da reatividade das lectinas foi realizado com lâminas incubadas apenas com o tampão, omitindo-se as lectinas.
Tabela I: Lectinas utilizadas para caracterização histoquímica de resíduos de carboidratos.
Lectina Sigla Especificidade μg/mL
Canavalia ensiformes ConA α-manose/α-glicose 10 Maclura pomifera MPA α-galactose/α-GalNAc 20
Psophocarpus tetragonolobus PTL galactose/GalNAc 40
Helix pomatia HPA GalNAc 20
Artocapus integrifolia JFL α-galactose 40
Arachis hypogea PNA Galβ1-3 GalNAc 40
Glycine max SBA GalNAc 20
Tetragonolobus purpurea LTA α-L-fucose 20
Ulex europaeus UEA-I α-L-fucose 20
Triticum vulgaris WGA GlcNAc /ácido siálico 40 GalNAc: N-Acetil Galactosamina; β-GlcNAc: N-Acetil β-Glicosamina.
Para estudo da organogênese, larvas fixadas em líquido de Bouin por 8-12 h foram incluídas em glicol-metacrilato, seccionadas em série com 5 μm de espessura e coradas com azul de toluidina-borato de sódio 1%.
3. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Ovócitos recém-desovados, embriões e larvas foram fixados em glutaraldeído 3% ou solução Karnovsky modificado (glutaraldeído 2,5% e paraformaldeído 2%), ambos em tampão fosfato 0,1M, pH 7,3 durante 12 a 24 h a 4 ºC. Em seguida, as amostras foram submetidas à dupla pós-fixação com tetróxido de ósmio 1% durante 2h à temperatura ambiente, intercaladas com solução de ácido tânico 1% como mordente, durante 20 min. Os espécimes foram desidratados e submetidos à secagem em ponto crítico com CO2, montados em suportes de alumínio, metalizados com ouro e analisados ao MEV, modelos DSM-950 da Zeiss e JSM-840A da JEOL, a 20-25 KV. As imagens obtidas foram digitalizadas, armazenadas e tratadas para ajuste de contraste e brilho.
4. Morfometria e análise estatística
Amostras de larvas foram coletadas diariamente (n=10) a partir do momento da eclosão (dia 0) até a reabsorção total do saco vitelínico, fixadas em formol neutro 4% e submetidas à biometria, utilizando-se ocular micrométrica acoplada ao estereomicroscópio. Mediram-se o comprimento total, e comprimento e altura do saco vitelínico, calculando, em seguida a média e o desvio-padrão.
Imagens digitalizadas de ovócitos recém-desovados ao MEV foram submetidas à morfometria pelo programa UTHSCSA-Image Tool versão 3.00 para Windows. Foram mensuradas a densidade e a distância entre os poros-canais da zona radiata, utilizando-se de 10 imagens de 4 a 10 ovócitos de cada espécie.
Os dados biométricos das larvas e dos ovócitos foram submetidos ao teste de normalidade Kolmogorov and Smirnov, à análise de variância ANOVA e ao teste de Tukey com p < 0,05, utilizando GraphPad InStat versão 3.00 e GraphPad Prism versão 4.00, ambos para Windows.
IV. RESULTADOS
1. Histologia e histoquímica de ovócitos
Ovários maduros de B. orthotaenia, L. obtusidens, P. argenteus e S. brasiliensis apresentaram predominância de folículos vitelogênicos com alvéolos corticais concentrados no ooplasma periférico, glóbulos de vitelo acidófilos preenchendo a maior parte do ooplasma, núcleo central ou ligeiramente excêntrico e zona radiata acidófila com camadas interna e externa distintas, células foliculares pavimentosas e teca delgada (Fig. 1A-B). Micrópila em forma de funil ocluída por célula micropilar ocorreu no pólo animal dos ovócitos vitelogênicos das quatro espécies (Fig. 1G).
Através da histoquímica de carboidratos (Tab. II) (Fig. 1C-D) detectaram-se polissacarídeos neutros nos glóbulos de vitelo e zona radiata interna e polissacarídeos neutros e carboxilados nas células foliculares das quatro espécies. A zona radiata externa apresentou polissacarídeos neutros, carboxilados e sulfatados em S. brasiliensis, enquanto as demais espécies apresentaram polissacarídeos neutros e carboxilados. Os alvéolos corticais em L. obtusidens apresentaram polissacarídeos neutros, enquanto em B. orthotaenia, P. argenteus e S. brasiliensis apresentaram polissacarídeos carboxilados.
Tabela II: Reatividade das estruturas ovocitárias à histoquímica de carboidratos em quatro espécies de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco.
B. orthotaenia L. obtusidens P. argenteus S. brasiliensis
PAS AB 2,5 AB 0,5 PAS AB 2,5 AB 0,5 PAS AB 2,5 AB 0,5 PAS AB 2,5 AB 0,5 CF + + - + + - + + - + + - GV + - - + - - + - - + - - ZRE ++ + - ++ + - ++ + - ++ + + ZRI + - - + - - + - - + - - AC - + - + - - - + - - + -
+: reação positiva; ++: reação fortemente positiva; -: reação negativa; CF: Célula folicular; GV: Glóbulo de vitelo; ZRE: Zona radiata externa; ZRI: Zona radiata interna; AC: Alvéolo cortical; PAS: Periodic Acid Schiff; AB 2,5: Alcian Blue em pH 2,5; AB 0,5: Alcian Blue em pH 0,5.
A reatividade das estruturas ovocitárias às lectinas (Tab. III) (Fig. 1E-G) evidenciou células foliculares positivas para todas as lectinas utilizadas, e glóbulos de vitelo e zona radiata interna negativos nas quatro espécies. Zona radiata externa apresentou reação positiva para MPA, HPA, JFL, PNA, SBA e WGA em todas as espécies e positivas para LTA e UEA-I apenas em L. obtusidens e P. argenteus. Os alvéolos corticais apresentaram reação positiva para UEA-I em todas as espécies, para MPA e LTA em L. obtusidens e para MPA, PTL e PNA em S. brasiliensis.
Tabela III: Reatividade das lectinas na zona radiata externa (ZRE) e alvéolos corticais (AC) de ovócitos de quatro espécies de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco.
B. orthotaenia L. obtusidens P. argenteus S. brasiliensis
ZRE AC ZRE AC ZRE AC ZRE AC
ConA + - + - + - + - MPA + - + + + - + + PTL - - - - - - - + HPA + - + - + - + - JFL + - + - + - + - PNA + - + - + - + + SBA + - + - + - + - LTA - - + + + - - - UEA-I - + + + + + - + WGA + - + - + - + -
+: reação positiva; -: reação negativa; ZRE: Zona radiata externa; AC: Alvéolo cortical; ConA:
Canavalia ensiformes; MPA: Maclura pomifera; PTL: Psophocarpus tetragonolobus; HPA: Helix pomatia; JFL: Artocapus integrifólia; PNA: Arachis hypogea; SBA: Glycine Max; LTA: Tetragonolobus purpúrea; UEA-I: Ulex europaeus; WGA: Triticum vulgaris.
2. Ultra-estrutura de superfície ovocitária
A micrópila apresentou vestíbulo com 12 pregas em B. orthotaenia e 9 em S. brasiliensis (Fig. 2A-B). Não foram observadas pregas no vestíbulo da micrópila de L. obtusidens e P. argenteus (Fig. 2C-D). A micrópila de L. obtusidens apresentou formato irregular do vestíbulo e a de P. argenteus apresentou-se com vestíbulo circular (Fig. 2C-D).
A superfície dos ovócitos recém-desovados de P. argenteus apresentou rede fibrilar recobrindo os poros-canais da zona radiata, enquanto as demais espécies apresentaram poros-canais circundados por pequenos grânulos (Fig 2E-F). A rede fibrilar dos ovócitos de P. argenteus foi caracterizada por densa rede de delicadas fibrilas concentradas no pólo vegetativo (Fig. 2F), tornando-se progressivamente menos densa em direção à micrópila (Fig 2E).
Os poros-canais do pólo vegetativo apresentaram maior densidade e menor distância entre si nos ovócitos de L. obtusidens, e menor densidade e maior distância em B. orthotaenia e S. brasiliensis (Tab. IV). A quantificação dos poros-canais na superfície dos ovócitos de P. argenteus não foi realizada devido a presença da rede fibrilar encobrindo totalmente os poros-canais no pólo vegetativo.
Tabela IV: Morfometria (média ± desvio-padrão) da superfície de ovócitos recém-desovados de espécies de interesse comercial da bacia do rio São Francisco ao MEV.
N B. orthotaenia S. brasiliensis L. obtusidens N° poros-canais / μm2 10 3,64 ± 0,66 a 3,59 ± 0,52 a 4,22 ± 0,55 b Distancia poros-canais (μm) 10* 0,61 ± 0,06 a 0,62 ± 0,07 b 0,51 ± 0,05 c
Nº de pregas vestíbulo 4 12 9 -
N: Número de campos/espécies analisados. Letras diferentes na mesma linha indicam diferenças significativas (p< 0,05); Asterisco: foram mensuradas 10 estruturas de cada campo.
3. Desenvolvimento embrionário
A embriogênese ocorreu de forma semelhante nas quatro espécies, sendo dividida nos principais eventos da morfogênese (Tab. V).
Clivagem
Após a fertilização, o ooplasma acumulou-se no pólo animal, originando uma protuberância em forma de disco, o blastodisco unicelular (zigoto). Divisões mitóticas sincrônicas originaram blastômeros de tamanhos regulares (Fig. 3A-B). Durante essa fase, encontraram-se embriões com 2, 4 e 8 blastômeros numa mesma amostra. A partir de 32 blastômeros, as clivagens tornaram-se assimétricas (Fig. 3C).
Blástula alta
Nessa fase, a blastoderme apresentou forma de cúpula (Fig. 3D). Os blastômeros continuaram a se dividir em vários planos de clivagem. Os blastômeros externos achataram-se, originando as células envelopadoras (EVC), enquanto os blastômeros mais internos formaram as deep cells (Fig 4A-C). Ao final dessa fase, os blastômeros que estavam à margem do blastodisco fundiram-se, formando a camada sincicial vitelínica (YSL) constituída de faixa citoplasmática contínua e vários núcleos (Fig. 5D). Ao final dessa fase, iniciou a epibolia com migração da YSL e dos blastômeros em direção a extremidade do pólo vegetativo. Não foi observado processo de cavitação da blástula.
Gástrula
Iniciou-se quando a YSL se encontrava no equador do compartimento vitelínico, 50% de epibolia. Essa fase caracterizou-se pelo movimento de involução, no qual as deep cells que se moviam em direção ao pólo vegetativo retornaram ao pólo animal originando os folhetos germinativos, epiblasto e hipoblasto. Durante a gastrulação, as EVC permaneceram com forma achatada, enquanto as deep cells apresentaram forma irregular, com projeções citoplasmáticas semelhantes a pseudópodes (Fig. 4B-C). A YSL apresentou microvilosidades interagindo com as expansões citoplasmáticas das deep cells (Fig. 4C). Durante gastrulação, ocorreram também formação do eixo embrionário, diferenciação do epiblasto em ectoderma e do hipoblasto em mesoderma e endoderma. No término da
gastrulação, 100% de epibolia, ocorreu o fechamento do blastóporo (Fig. 3E) com 7-8 h para B. orthotaenia e S. brasiliensis, e 8-9 h para L. obtusidens e P. argenteus a 23-26ºC.
Somitogênese
Essa fase iniciou-se logo após o fechamento do blastóporo, ocorrendo simultaneamente o crescimento diferenciado da porção cranial da haste neural. Em seguida, cavitação e constrições da haste neural originaram o tubo neural, subdividindo-se em: prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. Observou-se o desenvolvimento da vesícula óptica entre 11 e 14 somitos. Na fase de21-24 somitos observaram-se a formação do cálice óptico, da vesícula ótica (Fig. 5A-D) e contrações entre a cabeça e o saco vitelínico, indicando o início do desenvolvimento do coração.
Entre 24 e 28 somitos, ocorreu a liberação da cauda (Fig. 3F), culminando no início da movimentação dos embriões. Nessa fase, as células da notocorda apresentaram aspecto vacuolizado e as células dos somitos alongaram-se (Fig. 5C).
Eclosão
A eclosão ocorreu entre 17 e 18 h para B. orthotaenia e S. brasiliensis entre 20 e 21 h para L. obtusidens e P. argenteus a 23-27ºC (Fig. 3G). Após a eclosão, todas as larvas apresentaram início do desenvolvimento das fossas nasais. As larvas de S. brasiliensis e B. orthotaenia apresentaram órgão adesivo. A YSL apresentou projeções citoplasmáticas durante o desenvolvimento embrionário e ontogênese larval para a reabsorção do vitelo (Fig. 5D).
19 B. orthotaenia L. obtusidens P. argenteus S. brasiliensis
Fases do desenvolvimento Tempo T HG Tempo T HG Tempo T HG Tempo T HG
Clivagem 00:40 25 17,0 00:40 23 16,0 00:35 23 14,0 00:40 25 20
Blástula 03:40 25 92,5 03:30 23 80,5 03:10 23 73,6 02:20 26 56,4
Gástrula 06:10 25 155,0 05:30 23 126,5 05:10 23 119,6 04:30 25,5 115,1
Fechamento do blastóporo/Somitogênese 07:40 25 192,5 08:15 23 188,6 09:00 23 207,0 07:00 26 180,1 Formação da vesícula óptica 09:40 26 244,5 11:00 23 253,0 11:20 23 257,0 09:00 27 234,1 Formação do cálice óptica e vesícula ótica 11:10 27 285,0 13:30 23 310,5 14:00 23 322,0 11:00 26 286,1
Liberação da cauda 13:00 27 333,5 15:50 23 363,4 16:30 23 379,5 13:00 24 334,1
454,1 Tabela V: Início (hh:mm) dos principais eventos da morfogênese durante embriogênese de quatro espécies de interesse comercial da bacia do rio São Francisco após fertilização à temperatura 23-27°C.
24 18:00 464,6
20:10 23
Eclosão da larva 17:10 27 447,0 20:30 23 471,5
4. Ontogênese Larval
Durante o desenvolvimento larval, o comprimento e a altura do saco vitelínico diminuíram, enquanto o comprimento corporal aumentou, ocorrendo mais rapidamente em S. brasiliensis, seguido por B. orthotaenia, P. argenteus e L. obtusidens (Tab. VI).
A reabsorção total do saco vitelínico variou de acordo com a espécie, ocorrendo após o 2º dia em S. brasiliensis, 3º em B. orthotaenia, 4º em P. argenteus e 5º em L. obtusidens. A abertura da boca ocorreu um dia antes da reabsorção total do saco vitelínico em todas as espécies.
Durante ontogênese larval, observam-se os desenvolvimentos de:
Arcos branquiais
O esboço dos arcos branquiais em B. orthotaenia e S. brasiliensis formou-se logo após a eclosão das larvas, em P. argenteus no 1º dia após eclosão, e em L. obtusidens após o 2º dia (Fig. 6A). Para as quatro espécies, o início da condrogênese e da irrigação sanguínea dos arcos branquiais ocorreu concomitantemente ao desenvolvimento da boca (Fig. 6C-D).
Bexiga gasosa
Esboço da bexiga gasosa surgiu com 2 dias para B. orthotaenia e S. brasiliensis, e com 3 dias para L. obtusidens e P. argenteus, apresentando epitélio de revestimento simples pavimentoso (Fig. 6C).
Pronefro: rim primitivo
Nas quatro espécies, o pronefro se desenvolveu de forma semelhante, apresentando, logo após a eclosão, dois túbulos laterais de epitélio simples cúbico sem lume aparente, o qual tornou-se evidente no 1º dia após eclosão. A região cranial tornou-se enovelada (Fig. 6D), e a região caudal retilínia (Fig. 6I), acompanhando dorsalmente o intestino (Fig. 7A). Os túbulos do pronefro caudal se uniram e desembocaram, junto ao intestino, na papila urogenital (Fig. 7B).
Células Germinativas Primordiais
As células germinativas primordiais (PGCs) foram identificadas a partir 1º após eclosão das larvas entre o intestino e o rim (Fig. 7A) por apresentarem-se volumosas, núcleo vesiculoso com nucléolo evidente e citoplasma basófilo. Dorsalmente às PGCs, observaram-se melanóforos dendríticos.
Coração
A formação do coração iniciou-se durante a somitogênese. Com 1 dia após eclosão das larvas, o coração apresentava constrição de suas paredes formando seio venoso, átrio, ventrículo e bulbo arterial. O miocárdio do átrio era constituído por uma monocamada celular, enquanto no ventrículo, o miocárdio tinha de 2 a três camadas de células. Ao longo do desenvolvimento larval, apenas o miocárdio do ventrículo aumentou sua espessura (Fig. 7C-D).
Trato digestivo
Observou-se início da formação do fígado na região dorsal do saco vitelínico logo após a eclosão em B. orthotaenia e S. brasiliensis e com 1 dia após eclosão em L. obtusidens e P. argenteus (Fig. 6B). Antes da completa reabsorção do saco vitelínico das quatro espécies, o pâncreas já continha ilhota pancreática única (Fig. 6D, G) e o fígado apresentava-se vascularizado (Fig. 6E-F).
Logo após a eclosão das larvas, o intestino apresentava-se apenas como um túbulo com epitélio de revestimento simples sem lume evidente. O intestino das quatro espécies apresentou epitélio de revestimento simples, prismático com borda estriada e células caliciformes, e presença de pregueamento da mucosa em B. orthotaenia e S. brasiliensis (Fig. 6H).
Com a abertura da boca, observou-se o desenvolvimento de alvéolos germe dentários nas larvas de B. orthotaenia e S. brasiliensis a partir do 1º dia após a eclosão (Fig. 7E-F), e estruturas de apreensão em larvas P. argenteus a partir do 4º dia (Fig. 9E), evidenciadas apenas ao MEV. Na histologia, observou-se o desenvolvimento de base cartilaginosa abaixo alvéolos germe dentários de B. orthotaenia e S. brasiliensis. L. obtusidens não apresentou dentes ou estruturas de apreensão durante o período amostrado. Antes da reabsorção do saco vitelínico, observou-se canibalismo entre as larvas de B. orthotaenia e S. brasiliensis.
Sistema nervoso/sensorial
Para as quatro espécies a diferenciação de regiões do tubo neural em prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo ocorreu simultaneamente à somitogênese. A diferenciação da massa cinzenta e branca ocorreu a partir do 1º dia após a eclosão das larvas (Fig. 6A). Após a reabsorção do saco vitelínico, observaram-se neurônios com núcleo vesiculoso, nucléolo evidente e presença de manchas basófilas no citoplasma (Fig. 8B).
A partir da vesícula ótica houve o desenvolvimento do ouvido interno. As larvas com 1 dia já apresentaram estruturas semelhantes a neuromastos livres no interior do ouvido. Antes a reabsorção total do saco vitelínico, o ouvido interno já apresentava os canais anterior, lateral e posterior definidos (Fig. 8C).
Logo após a eclosão observou-se o desenvolvimento inicial da fossa nasal, com células olfativas contendo pequenos cílios (Fig. 9A-B). A partir de 1-2 dias, as fossas nasais eram constituídas por epitélio estratificado com células prismáticas ciliadas e início da invaginação da fossa nasal (Fig. 9C-D).
Os botões gustativos surgiram após a abertura da boca, localizando-se apenas na superfície dos lábios (Fig. 9E-F).
A presença de neuromastos livres na superfície das larvas ocorreu a partir do 1º dia após a eclosão para todas as espécies, localizando-se na cabeça, principalmente próximo às orbitais dos olhos, e na região médio-lateral do tronco. Os neuromastos foram caracterizados histologicamente por um grupo de células sensitivas com citoplasma fortemente basófilo recobertas externamente por uma cúpula gelatinosa, e um grupo de células de suporte com citoplasma fracamente corado (Fig. 8D). Na ultraestrutura, as células sensitivas apresentaram abaixo da cúpula gelatinosa um cinocílio e uma fileira de estereocílios por célula sensitiva (Fig. 10A-B). Os neuromastos variaram morfologicamente entre as espécies, apresentando maior similaridade entre L. obtusidens e P. argenteus, cujos neuromastos eram mais achatados, com cúpula gelatinosa alongada e base da cúpula com forma amendoada (Fig. 10C-D), e entre B. orthotaenia e S. brasiliensis, cujos neuromastos eram mais esféricos, com cúpula gelatinosa mais curta e base da cúpula arredondada (Fig. 10E-F).
Órgãos adesivos
S. brasiliensis e B. orthotaenia apresentaram órgão adesivo na cabeça a partir da eclosão das larvas, com seu desenvolvimento máximo no 1º e 2º dias (Fig. 8E-I e 11A-E),
regredindo totalmente após o 3º dia. Os órgãos adesivos de ambas espécies eram histologicamente semelhantes, apresentando células prismáticas com núcleo basal e projeções citoplasmáticas na porção apical (Fig. 8E-I). Observaram-se, na ultraestrutura, microrrugosidades na superfície dessas células, havendo maior heterogeneidade em S. brasiliensis (Fig. 11C-F).
- - -
-
Tabela VI: Dados biométricos (média ± desvio-padrão) (mm) de larvas de peixes de interesse comercial da bacia do rio São Francisco em condições experimentais até a reabsorção total do saco vitelínico, com temperatura entre 23-26ºC.
B. orthotaenia L. obtusidens P. argenteus S. brasiliensis
DPH CT CSV ASV CT CSV ASV CT CSV ASV CT CSV ASV
0 3,27±0,11a 1,15±0,03a 0,71±0,03a 3,16±0,11a 0,96±0,13a 0,65±0,04a 4,39±0,07a 1,52±0,04a 0,76±0,05a 4,13±0,02a 1,41±0,05a 0,72±0,03a
1 3,87±0,17b 1,12±0,05a 0,67±0,04a 4,10±0,10b 0,99±0,04a 0,53±0,05b 5,84±0,10b 1,69±0,04b 0,68±0,03b 7,74±0,12b 1,06±0,05b 0,43±0,07b
27
2 5,94±0,23c 0,98±0,10b 0,53±0,05b 4,58±0,15c 0,87±0,03b 0,42±0,05c 6,48±0,12c 1,35±0,04c 0,54±0,05c 8,61±0,45c -
3 6,07±0,30c - - 4,84±0,18d 0,82±0,06b 0,39±0,05cd 6,78±0,23d 1,14±0,04d 0,45±0,04d - -
4 7,28±0,19d - - 4,84±0,09d 0,52±0,07c 0,34±0,05d 7,00±0,31d - - - -
5 - - - 4,94±0,08d - - 8,60±0,20e - - - -
DPH: dias após eclosão; CT: comprimento total; CSV: comprimento do saco vitelínico; ASV: altura do saco vitelínico; Letras diferentes: diferença significativa (p < 0,05; N = 10).
V. DISCUSSÃO
No presente trabalho, analisou-se a superfície de ovócitos e o desenvolvimento inicial de quatro espécies de peixes da bacia do rio São Francisco através de análises histológicas, histoquímica de carboidratos e ao MEV. Apesar de vários estudos terem analisado a dinâmica da ovogênese, poucas investigações identificaram os resíduos de carboidratos presentes nos ovócitos de peixes (NOSEK et al., 1984; SCHINDLER & VRIES, 1989; MANDICH et al., 2002; YU et al., 2002; SCARPELLI, 2005) e o desenvolvimento inicial de peixes neotropicais (NAKATANI et al., 2001). Além de contribuir para o conhecimento da biologia de ovócitos de peixes, este tipo de abordagem fornece subsídios para compreensão dos mecanismos de interação entre gametas, entre ovo e meio ambiente e o relacionamento filogenético entre Characiformes.
1. Ovócitos
Os ovócitos vitelogênicos das quatro espécies estudadas apresentaram padrão morfológico e histoquímico semelhantes quanto aos glóbulos de vitelo, zona radiata interna e células foliculares, variando quanto à constituição dos alvéolos corticais e zona radiata externa que foram espécie-específicos como também detectado por outros autores (BAZZOLI & RIZZO, 1990; BAZZOLI, 1992; BAZZOLI & GODINHO, 1994; RIZZO et al., 1998; MOTTA et al., 2005).
Polissacarídeos ácidos são comumente encontrados na superfície de ovos adesivos, como na pirambeba Serrasalmus brandtii (RIZZO & BAZZOLI, 1991), em Romanichthys valsanicola (RIEHL & PATZNER, 1998), e em traíras (SCARPELLI, 2005). Apesar da presença de polissacarídeos neutros e ácidos na zona radiata externa, os ovos das espécies estudas não são adesivos (SATO et al., 2003a). Estas moléculas também estão presentes nos alvéolos corticais, sendo liberados no espaço perivitelínico durante a reação cortical, interagindo com a zona radiata, evitando a polispermia (TYLER & SUMPTER, 1996).
A zona radiata interna e glóbulos de vitelo não apresentaram reatividade para nenhuma das lectinas analisadas. De fato, a camada interna da zona radiata, que confere proteção mecânica ao embrião em desenvolvimento, é constituída predominantemente por proteínas, contendo poucos resíduos de carboidratos (BRIVIO et al., 1991;
BONSIGNORIO et al., 1996; GURAYA, 1996; MURATA et al., 1997), sendo homóloga à zona pelúcida de mamíferos (MURATA et al., 1997; SCAPIGLIATI et al., 1999).
A zona radiata externa mostrou reatividade para quase todas as lectinas utilizadas. Reação positiva para LTA e UEA-I, específica para α-L-fucose, foi detectada em L. obtusidens e P. argenteus. Há evidências que os carboidratos tem papel na ligação espécie-específica entre gametas de vertebrados (MENGERINK & VACQUIER, 2001). Estudos têm demonstrado que oligossacarídeos de fucose podem mediar a ligação inicial entre gametas e início da reação acrossômica em ouriço do mar (DELL et al., 1999). A interação carboidrato-carboidrato foi demonstrada em truta entre gametas de truta arco-íris, mais especificamente entre o gangliosoídeo (KDN)GM3 (KDNα2→3Galβ4Glcβ1), abundante na superfície do espermatozóide, e Gg3 (GalNAcβ4Galβ4Glcβ1), encontrado na região micropilar dos ovos dessa espécie (YU et al., 2002). Fator de iniciação de motilidade espermática reconhecido pela lectina ConA na região micropilar de ovos de arenque marinho já foi identificado e isolado (PILLAI et al., 1993).
Em L. obtusidens, os alvéolos corticais apresentaram polissacarídeos neutros, e em B. orthotaenia, P. argenteus e S. brasiliensis, polissacarídeos carboxilados, enquanto a histoquímica de lectinas evidenciou a presença de fucose para todas as espécies, galactose e GalNAc em L. obtusidens e S. brasiliensis, e Galβ1-3 GalNAc apenas para S. brasiliensis. Estudo recente utilizando lectinas com diferentes especificidades também demonstrou variação no conteúdo dos alvéolos corticais em várias espécies de teleósteos nototenioides (MOTTA et al., 2005). Além das variações espécie-específicas no conteúdo dos alvéolos corticais, também podem ocorrer variações na composição das vesículas corticais durante o desenvolvimento ovocitário (OHTA et al., 1990).
Lectinas com mesma especificidade podem apresentar diferenças na afinidade de ligação pelo resíduo de carboidrato reconhecido (HAYAT, 1993; LIS & SHARON, 1998), como observado no presente trabalho pela reação positiva de UEA-I e negativa de LTA, ambas com especificidade para α-L-fucose, em alvéolos corticais de B. orthotaenia, P. argenteus e S. brasiliensis.
No presente estudo, além das diferenças observadas na constituição dos alvéolos corticais e da zona radiata externa, observou-se também diferenças ultra-estrutuais na superfície dos ovócitos. A presença de rede fibrilar observada em P. argenteus foi relatada em Prochilodus affinis (RIZZO & BAZZOLI, 1993) e Prochilodus scrofa (RIZZO et al., 2002), e a diferença na densidade entre poros-canais observada no presente estudo também
foi constatada entre ovos de algumas espécies de peixes Perciformes (LI et al., 2000). Zona radiata com poros-canais ou rede fibrilar são geralmente encontradas em ovos não adesivos (RIZZO & BAZZOLI, 1993; RIZZO et al., 1998; RIZZO et al., 2002), ocorrendo também em ovos adesivos como na traíra, Hoplias malabaricus (SCARPELLI, 2005).
O aspecto ultraestrutural da micrópila é importante para identificação de ovos (RIEHL, 1993; LI et al., 2000). A micrópila das quatro espécies em estudo apresentou forma de funil, similar a salmonídeos e truta (GROOT & ALDERDICE, 1985), P. affinis (RIZZO & BAZZOLI, 1993), alguns anostomideos e Salminus hilarii (RICARDO et al., 1996) sendo também o tipo mais freqüente relatado na literatura (HART, 1990; GURAYA, 1996). A micrópila de B. orthotaenia e S. brasiliensis mostraram maior similaridade, apresentando pregas no vestíbulo micropilar, que podem ser uma estratégia para facilitar a fertilização nestas espécies. Presença de pregas proeminentes em espiral na parede do vestíbulo micropilar foi relatado em zebrafish (HART & DONOVAN, 1983). Outras estruturas como filamentos de ancoragem circundando a micrópila são observados em várias espécies de peixes como Gobiesocidae (BREINING & BRITZ, 2000) e piranhas Serrasalmus spilopleura (RIZZO et al. 2002; BARRETO, 2001) e Serrasalmus nattereri (WIRZ-HLAVACEK & HART, 1990), sendo responsável pela fixação do ovo ao substrato nessas espécies. Embora o significado funcional das variações ultra-estruturais e dos açucares presentes na superfície ovocitária não terem sido completamente esclarecidos, ambos podem ser importantes no processo de fertilização, na adesividade de ovos e proteção contra patógenos no meio ambiente.
2. Desenvolvimento embrionário
A embriogênese ocorreu de forma semelhante nas quatro espécies, como também relatado em outros teleósteos neotropicais (CARDOSO et al., 1995; ANDRADE-TALMELLI et al., 2001; LUZ et al., 2001; MORRISON et al., 2001; NAKATANI et al., 2001; REYNALTE-TATAJE et al., 2001; BORÇATO et al., 2004). No presente estudo, durante a clivagem, os blastômeros sofreram divisões mitóticas simétricas e simultâneas, similar a zebrafish (KIMMEL et al., 1995). Os blastômeros nessa fase mantêm-se unidos por junções do tipo gap e junções de adesão (LANGELAND & KIMMEL, 1997) e, enquanto as divisões mitóticas são simétricas e simultâneas, as funções celulares básicas do embrião como metabolismo e divisão celular dependem de produtos gênicos maternos
processados durante a ovogênese (PELEGRI, 2003). Nesse período, observaram-se embriões com diferenças no número de células, apesar de apresentaram o mesmo tempo de desenvolvimento. Essa assincronia durante a clivagem foi relatada em zebrafish (KIMMEL et al., 1995) e na tilápia, Oreochromis niloticus (MORRISON et al., 2001), mesmo para ovos fertilizados simultaneamente e mantidos sob ótimas condições. A partir de 32 blastômeros, as clivagens tornaram-se assimétricas nas quatro espécies em estudo. Essa heterogeneidade no tamanho das células foi constatada a partir da fase de 16 blastômeros para O. niloticus (MORISSON et al., 2001) e 32 blastômeros em zebrafish (KIMMEL et al., 1995; LANGELAND & KIMMEL, 1997).
A blástula alta das quatro espécies não apresentou cavitação do blastodisco. Em O. niloticus (MORRISON et al., 2001) e zebrafish (KIMMEL et al., 1995) foram observados apenas pequenos espaços extracelulares originados, provavelmente, pela perda de conexão entre as deep cells (FISHELSON, 1995). Assim como em zebrafish (KIMMEL et al., 1995; LANGELAND & KIMMEL, 1997), no presente estudo, ocorreu fusão dos blastômeros marginais do blatodisco na fase de blástula alta, originando a camada sincicial vitelínica (YSL) (KIMMEL & LAW, 1985; KIMMEL et al., 1995) e início da movimentação celular, caracterizando a epibolia (WARGA & KIMMEL, 1990).
Na gastrulação, ocorre o comprometimento do destino celular (KIMMEL et al., 1990), e o movimento de involução das deep cells que origina os folhetos germinativos (LANGELAND & KIMMEL, 1997). Estudos com zebrafish mutantes e com super-expressão gênica sugerem a participação de fatores da família Nodal na diferenciação do hipoblasto em endoderma e mesoderma (OBER et al., 2003). Durante epibolia, os microtúbulos contribuem para a migração YSL em direção ao pólo vegetativo, não havendo, entretanto, acoplamento da YSL e das células do blastoderma durante esse processo de migração. Mesmo inibindo a epibolia com taxol, estabilizador de microtúbulos, a gastrulação e a morfogênese parece prosseguir normalmente (SOLNICA-KREZEL & DRIEVER, 1994). No presente trabalho, observaram-se projeções citoplasmáticas das deep cells ao MEV, indicando migração ativa dessas células. Projeções de filopódios em deep cells durante migração celular também foram relatadas em Fundulus heteroclitus (TRINKAUS & ERICKSON, 1983) e zebrafish (WARGA & NÜSSLEIN-VOLHARD, 1999).
A YSL está envolvida na mobilização de vitelo durante a embriogênese (KRIEGER & FLEIG, 1999; SHAHSAVARANI, et al., 2002). No presente trabalho, observaram-se
através de histologia a emissão de projeções citoplasmáticas da YSL para o interior do compartimento vitelínico e a reabsorção de glóbulos de vitelo. Em Perca fluviatilis, o vitelo é degradado no compartimento vitelínico e a YSL participa apenas no transporte dos sub-produtos do vitelo para as demais células do embrião (KRIEGER & FLEIG, 1999).
Com o termino da epibolia, que culminou com o fechamento do blastóporo, ocorreu o início da somitogênese, como também observado na maioria dos teleósteos (CARDOSO et al., 1995; KIMMEL et al., 1995; PRIVILEGGI et al., 1997; MEIJIDE & GUERRERO, 2000; ANDRADE-TALMELLI et al., 2001; LUZ et al., 2001; NAKATANI et al., 2001; REYNALTE-TATAJE et al., 2001; PADILHA, 2003; BORÇATO et al., 2004; GOMES, 2005), exceto em O. niloticus cuja somitogênese inicia-se antes do término da epibolia (MORRISON et al., 2001). Isso pode ter ocorrido devido ao grande tamanho dos ovos dessa espécie quando comparados aos ovos das quatro espécies em estudo. Já foram identificados mais de 50 genes necessários para o desenvolvimento normal dos somitos, incluindo a via sinalizadora Notch que está envolvida na somitogênese de camundongo e galinha (STICKNEY et al., 2000). A notocorda também parece estar envolvida na somitogênese através da secreção de moléculas sinalizadoras (STICKNEY et al., 2000). Durante essa fase, as células dos somitos se diferenciam em esclerótomos e dermomiótomos (KIMMEL et al., 1995). Os dermomiótomos originarão as células musculares e os esclerótomos a cartilagem vertebral (KIMMEL et al. 1995; LANGELAND & KIMMEL, 1997). Nas quatro espécies em estudo, os desenvolvimentos do cálice óptico, vesícula ótica e tubo neural ocorram, durante a somitogênese, semelhante ao descrito para outras espécies de teleósteos (CARDOSO et al., 1995; KIMMEL et al., 1995; HILL & JOHNSTON, 1997; MORRISON et al., 2001; PADILHA, 2003; GOMES, 2005).
No presente estudo, a embriogênese das quatro espécies foi curta, ocorrendo entre 17h e 21h. Desenvolvimento embrionário rápido é característico de espécies migradoras, com estratégia reprodutiva sazonal, que apresentam alta fecundidade e ausência de cuidado parental (SATO et al., 2003a). A diferença no tempo de desenvolvimento nas quatro espécies relacionou-se com a temperatura da água. As larvas de L. obtusidens e P. argenteus, que foram mantidas a uma temperatura menor, eclodiram mais tardiamente, enquanto larvas de S. brasiliensis e B. orthotaenia eclodiram com um tempo menor e foram mantidas a temperaturas mais altas. Estudos mostram que animais ectotérmicos apresentam desenvolvimento mais acelerado em temperaturas mais elevadas, devido a
alterações que a temperatura induz nas atividades enzimáticas durante organogênese (OJANGUREN & BRAÑA, 2003).
3. Ontogênese larval
As larvas recém-eclodidas das quatro espécies em estudo apresentaram mandíbulas não formadas, olhos despigmentados e saco vitelínico grande, semelhante ao observado para a maioria das larvas de peixes neotropicais de água doce (NAKATANI et al., 2001). O grau de diferenciação da larva recém-eclodida varia entre as espécies, dependendo do tamanho do ovo (BLAXTER, 1969). Espécies que apresentam ovos pequenos e alta fecundidade têm o desenvolvimento embrionário mais rápido e larvas menos desenvolvidas, enquanto as que apresentam ovos grandes e baixa fecundidade têm desenvolvimento embrionário prolongado e maior grau de desenvolvimento das larvas (SATO et al., 2003a). Nesse sentido, peixe-lobo, Anarhichas lupus apresenta ovos grandes e larvas recém-eclodidas semelhantes aos juvenis, mantendo poucas características larvais como a presença do saco vitelínico (FALK-PETERSEN & HANSEN, 2001), enquanto espécies com larvas pouco desenvolvidas apresentam ovos pequenos, tais como Leporinus macrocephalus (REYNALTE-TATAJE et al., 2001); Leporinus piau (BORÇARTO et al., 2004), Leporinus taeniatus (PADILHA, 2003), Pimelodus maculatus (LUZ et al., 2001) e Prochilodus lineatus (SILVEIRA et al., 2004). De acordo com SANCHES et al. (1999), larvas de peixes com baixa fecundidade são geralmente mais desenvolvidas, apresentando, conseqüentemente, vantagens ecológicas, pois são capazes de explorar mais nichos e são menos susceptíveis a predação.
A reabsorção do saco vitelínico variou entre as quatro espécies em estudo, desde 2 dias para S. brasiliensis até 5 dias para L obtusidens, e a abertura da boca precedeu 1 dia a total reabsorção do saco vitelínico, semelhante ao observado em outros estudos (NOGUEIRA, 2000; GODINHO et al., 2003). Com a abertura da boca, observou-se o desenvolvimento de dentes nas larvas de B. orthotaenia e S. brasiliensis. Através de análises ao MEV, também foi possível visualizar delicadas estruturas de apreensão em larvas de P. argenteus. No presente estudo, observou-se canibalismo nas larvas de B. orthotaenia e S. brasiliensis como também relatado por outros autores (ANDRADE-TALMELLI, 2001; SANTOS & GODINHO, 2002; GODINHO et al., 2003; VEGA-ORELLANA et al., 2005). Devido ao alto índice de canibalismo, larvas de S. brasiliensis
