Padronização da Amplicon PCR

O processo de padronização do preparo e condições de reação de Amplicon PCR, que resultou no método anteriormente ilustrado na Tabela 6, encontra-se descrito a seguir. Uma vez que apenas a Amplicon PCR foi realizada nessa etapa de padronização, utilizou-se de 25 a 35 ciclos de reação, possibilitando a avaliação de seus resultados por eletroforese em gel 2%.

1.1. Teste de Enzimas: Phusion vs Tth

As enzimas Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) e Tth DNA Polymerase (Sigma Aldrich) foram testadas e comparadas. Como template, utilizou-se três pontos de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC saudável (Peripheral Blood Mononucleated Cells), nas proporções 5 x 10-5_, 5 x 10-4 _{e 10}-3_{. Também foi utilizada uma amostra de PBMC pura e uma amostra D0} da mesma leucemia usada para preparar a diluição seriada. Foram utilizados 50 ng de gDNA para cada amostra amplificada. O resultado obtido por eletroforese em gel de agarose 2% está representado na Figura 8.

Foram observadas bandas com tamanhos correspondentes aos amplicons de rearranjos V(D)J de IgH utilizando as duas enzimas testadas. No entanto, ambas as condições também apresentaram alto índice de formação de primer-dimer e baixa uniformidade entre as bandas observadas.

Figura 8. Comparação das enzimas Phusion High Fidelity DNA Polymerase e Tth DNA Polymerase. Bandas esperadas de rearranjos V(D)J de IgH destacadas em vermelho (cerca de 300 pares de base). Controle negativo representado por NC. Bandas de cerca de 120 pares de base correspondem a primer-dimer. Bandas de cerca de 60 pares de bases correspondem a resto de primer. Ladder 1 Kb plus (ThermoFisher Scientific).

1.2. Touchdown PCR

Buscando elevar a especificidade da reação para reduzir a formação de primer- dimer previamente observada, testou-se a elevação da temperatura de anelamento utilizada em 2 °C, juntamente ao uso de uma touchdown PCR durante os 5 primeiros ciclos da reação. Como template, utilizou-se três pontos de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC saudável, nas proporções 5 x 10-5_{, 5 x} 10-4 _{e 10}-3_{. Também foi utilizada uma amostra de PBMC pura e uma amostra D0 da} mesma leucemia usada para preparar a diluição seriada. Foram utilizados 600 ng de gDNA para cada amostra amplificada, excetuando D0, para qual utilizou-se 50 ng de gDNA. O resultado obtido por eletroforese em gel de agarose 2% está representado na Figura 9.

Apenas o uso de touchdown PCR foi pouco efetivo na redução da formação de primer-dimers. A PCR utilizando a enzima Phusion High-Fidelity DNA Polymerase continuou por apresentar baixa uniformidade entre as bandas observadas. A PCR utilizando a enzima Tth DNA Polymerase apresentou a formação de amplicons não identificados de cerca de 150 pares de base.

Figura 9. Efeito do uso de Touchdown PCR na comparação entre as enzimas Phusion High Fidelity DNA Polymerase e Tth DNA Polymerase. Bandas esperadas de rearranjos V(D)J de IgH destacadas em vermelho (cerca de 300 pares de base). Controle negativo representado por NC. Bandas de cerca de 120 pares de base correspondem a primer-dimer. Bandas de cerca de 60 pares de bases correspondem a resto de primer. Ladder 1 Kb plus (ThermoFisher Scientific).

1.3. Redução da Concentração de Primers

A concentração do pool de oligonucleotídeos no volume final da PCR foi reduzida de 200 nM para 100 nM para tentar, em conjunto a touchdown PCR previamente descrita, reduzir a formação de primer-dimer. Como template, utilizou-se três pontos de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC saudável, nas proporções 5 x 10-5_{, 5 x 10}-4 _{e 10}-3_{. Também foi utilizada uma amostra} de PBMC pura e uma amostra D0 da mesma leucemia usada para preparar a diluição seriada. Foram utilizados 600 ng de gDNA para cada amostra amplificada, excetuando D0, para qual utilizou-se 50 ng de gDNA. O resultado obtido por eletroforese em gel de agarose 2% está representado na Figura 10.

A redução da concentração de primers na Amplicon PCR com Phusion High- Fidelity DNA Polymerase diminuiu fortemente a formação de primer-dimer. Observou- se também a formação de amplicons não identificados com cerca de 550 pares de base. Esse DNA, no entanto, não compromete a determinação da NGS DRM, uma vez que o seu tamanho é consideravelmente maior que o do amplicon alvo da técnica. Desse modo, as sequências de rearranjos V(D)J IgH se ligam a flow cell em taxas muito maiores que esse amplicon maior. O mesmo efeito positivo não foi observado

Figura 10. Efeito da redução da concentração de primers na comparação entre as enzimas Phusion High Fidelity DNA Polymerase e Tth DNA Polymerase. Bandas esperadas de rearranjos V(D)J de IgH destacadas em vermelho (cerca de 300 pares de base). Controle negativo representado por NC. Bandas de cerca de 120 pares de base correspondem a primer-dimer. Bandas de cerca de 60 pares de bases correspondem a resto de primer. Ladder 1 Kb plus (ThermoFisher Scientific).

na Amplicon PCR com Tth DNA Polymerase, na qual a formação de primer-dimer ainda foi bastante pronunciada.

1.4. Teste da Enzima GoTaq G2 Hot Start DNA Polymerase

Considerando a natureza do método de NGS DRM, de possível integração à rotina clínica de centros de diagnóstico de biologia molecular, buscamos substituir a enzima Phusion High-Fidelity DNA Polymerase pela GoTaq G2 Hot Start DNA Polymerase (Promega), uma alternativa cerca de cinco vezes mais barata e com maior disponibilidade a pronta entrega. A Amplicon PCR com essa enzima foi testada mantendo os parâmetros anteriormente determinados (redução de concentração de primers e uso de touchdown PCR).

Como template, utilizou-se um ponto de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC saudável, na proporção 10-2_{. Foram utilizados 600 ng} de gDNA. O resultado obtido por eletroforese em gel de agarose 2% está representado na Figura 11.

O amplicon de rearranjo V(D)J de IgH foi observado através de uma banda nítida correspondente a cerca de 300 pares de base, enquanto a taxa de formação de primer-dimer foi baixa, representada através de uma banda quase inexistente correspondente a cerca de 120 pares de base. Por fim, a banda não identificada de cerca de 550 pares de base continua presente, mas em níveis menores que os observados utilizando as enzimas Phusion High-Fidelity DNA Polymerase e Tth DNA Polymerase. Desse modo, padronizou-se o preparo de bibliotecas para DRM NGS com a enzima GoTaq G2 Hot Start DNA Polymerase.

Figura 11. Teste da Amplicon PCR utilizando a enzima GoTaq G2 Hot Start DNA Polymerase. Banda esperada de rearranjos V(D)J de IgH destacada em vermelho (cerca de 300 pares de base). Controle negativo representado por NC. Ladder 1 Kb plus (ThermoFisher Scientific).