Padronização do teste ELISA

Na fase inicial da padronização do teste ELISA foram consideradas as leituras de D.O.

de soros controles negativos e positivo fraco e fixado o critério de diferenciação destes, conforme ítem 4.4.2.

Observa-se na figura 4, nítida melhoria no desempenho do teste à medida que a diluição de soro e a concentração do antígeno L V aumentam e a diluição do conjugado se reduz, tendo sido por isso sendo escolhido como melhor o bloco 2f.1g/ml para antígeno, 1/400 soro e 1/1.000 conjugado, revelando inclusive a maior amplitude da diferença de D.O.

entre soros negativos e positivo fraco (89,2%).

Para o antígeno E (Figura 5), houve certo nivelamento entre os diferentes blocos estudados. Embora 5f.1g/ml - 11100 - 1/1.000 tenha sido o bloco de maior amplitude, sua alta D.O. e o alto nível de reações inespecíficas, justificam sua substituição por uma condição de menor D.O. sem maiores alterações em relação ao valor da amplitude, ou seja, 5f.1g/ml

-11100- 1120.000.

Também não ocorreram destacados contrastes entre a maioria dos blocos analisados em LT e em CT, nem nítidas tendências de elevação da amplitude à medida que se variavam as quantidades dos reagentes em teste, como ocorrera com o antígeno L V, exceto uma relativa tendência de melhoria no desempenho para o conjugado 1/20.000.

Para ambos os casos foi escolhido o mesmo bloco selecionado para o antígeno E, por se situar entre os de maior amplitude e pela semelhança entre os três antígenos no SDS-P AGE, principalmente quanto ao número de peptídeos revelados (Tabela 2).

Os valores da amplitude da diferença entre soros negativos e positivo fraco não ultrapassou a 25,5% para os antígenos E, L T e CT, ultrapassando frequentemente este valor nos ensaios com o antígeno LV, chegando até 89,2% (Tabelas 16 a 19).

O teste da comparação simultânea dos quatro antígenos (Figura 8, Tabela 20) confirmou o melhor desempenho do antígeno L V na fase inicial da padronização.

Tendo em vista a variação do desempenho do teste ELISA à medida que se variaram razão da alta sensibilidade do teste imunoenzimático, que também amplifica reações inespecíficas.

pnmetro, contribuindo para maiOr destaque das reações específicas em detrimento das PERALTA& FRIAS (1987) e VENKATESAN & WAKELIN (1993).

Quanto aos periodos de incubação de antígenos, soros , conjugado e substrato, considerando o antígeno L V, não houve diferenciação nítida entre os analisados (Figuras 9 a 12), sendo fixados 5 minutos para substrato, 30 minutos para soro e conjugado e 12 horas a 4°C para antígeno, visando principalmente obter D.O. mais baixa, pelos motivos já expostos.

Como o propósito dos testes iniciais da padronização era apenas detectar uma tendência de melhor tipo de antígeno e de melhores condições experimentais da técnica básica do teste ELISA, utilizou-se a princípio um baixo número de amostra (uma positiva e quatro negativas) e procederam-se ensaios posteriores com todos os soros controles disponíveis, visando consolidar um teste ELISA de desempenho melhor definido e recomendável para o diagnóstico da cisticercose suína.

As taxas de sensibilidade e de especificidade para os quatro antígenos testados frente a todos os soros controles foram altas, mas os dois antígenos de larvas de Taenia crassiceps revelaram maiores valores de sensibilidade que os dois antígenos de larvas de Taenia solium (Tabela 5). O antígeno L T obteve melhor desempenho, embora fosse superado pelo L V na especificidade(l 00%) e valor preditivo positivo, quando o ponto de corte escolhido utilizou 3sd, indicando que o LV assegura maior confiança nos resultados das amostras positivas nessa circunstância, além de não evidenciar a ocorrência de reações falso-positivas.

À medida que se elevou o desvio-padrão de 2sd para 3sd na determinação do ponto de

corte, a sensibilidade se reduziu para os quatro antígenos. Com pouca influência no antígeno LT, também ocorreu nos três outros, relativa manutenção do valor preditivo negativo e elevações da especificidade e do valor preditivo positivo (expressiva), quando o desvio-padrão foi aumentado de 2sd para 3sd. O coeficiente de correlação intragrupal foi maior em 2sd para os quatro antígenos.

Portanto empregando-se 2sd vislumbra-se um teste ELISA para diagnóstico da cisticercose suína com maior poder de detecção de amostras verdadeiramente positivas, mas com maior probabilidade de acusar reações inespecíficas e cruzadas (falso-positivas). Por outro lado 3sd reduziu o aparecimento de reações falso-positivas, mas aumentou a ocorrência das falso-negativas.

Todas as amostras falso-negativas em LV (5) também se confirmaram nessa condição quando testadas frente aos outros antígenos. As reações cruzadas e as inespecíficas (falso-positivas) desapareceram em 3 sd quando se empregou L V e permaneceram com o L T.

Portanto justifica-se a escolha do antígeno L V para o teste ELISA da fase de inquérito desta pesquisa, considerando ainda o seu melhor desempenho atingido nas fases iniciais da padronização (Figuras 4 a 8).

Ressalta-se que ainda não se obtiveram registros do emprego do antígeno L V com objetivo de diagnóstico da cisticercose suína e que o outro antígeno de larvas de Taenia crassiceps, estudado no presente trabalho (L T), vem sendo estudado, nos últimos anos, com o mesmo propósito (BIONDI, 1994).

Os testes de reprodutibilidade do antígeno L V no ELISA limitaram-se à fase inicial da padronização (Figura 14), não se estendendo a todos os soros controles, devido ao esgotamento de alguns desses soros e da mesma partida do antígeno no final da pesquisa.

Considerando o emprego inédito do antígeno L V no diagnóstico da cisticercose suína pelo teste ELISA e os resultados pouco conclusivos dos testes de reprodutibilidade, necessitam-se de pesquisas adicionais no sentido de validar o teste para emprego na rotina de diagnóstico nas condições padronizadas à princípio, embora a condições experimentais e o desempenho do teste ELISA estabelecidos por outros autores não variem substancialmente em relação a esta pesquisa.

A padronização do teste ELISA com o emprego de soros controle e de concentrações ótimas dos reagentes, bem como modificações dos procedimentos analíticos da técnica tradicionalmente empregada para o diagnóstico da cisticercose humana, adotados neste trabalho, parece ter aumentado a eficiência deste teste no diagnóstico da cisticercose suína, quando comparado com algumas taxas menos favoráveis alcançadas por outros autores (GONZALEZ et al, 1990; PATHAK et al, 1994). 100%. Em contrapartida, GONZALEZ et al. (1990) e PATHAK et al. (1994), revelaram taxas inferiores de sensibilidade, 79,2% e 70%, respectivamente. P ATHAK et al (1994) também evidenciaram alta taxa de especificidade (93,4%), mas a determinada por GONZALEZ et al. ( 1990) foi de apenas 76,2%.

Considerando o imunoblot como o melhor teste para diagnóstico da cisticercose suína disponível no momento, pode-se concluir em relação ao ELISA, que na fase de inquérito

ocorreram neste teste (2sd), 17,9% de amostras falso-positivas e nenhuma falso-negativa, enquanto no 3sd apenas 2,6% de amostras falso-positivas e 3,1% de falso-negativas.

Com relação ao teste ELISA isoladamente, a decisão de utilizar 2sd ou 3sd como ponto de corte dependerá do interesse da pesquisa ou da finalidade do teste: evitar os falso-positivos (3sd) ou os falso-negativos (2sd).

Ponderando o emprego de diferentes provas padrões para a análise dupla do teste ELISA nas fases de padronização (exame post-mortem) e de inquérito (imunoblot), observaram-se acentuadas quedas das taxas de especificidade, valor preditivo positivo (VP+) e coeficiente de correlação intragrupal (K) na fase de inquérito, quando se utilizou 2sd como ponto de corte. As taxas mostraram pouca variação nas outras três condições analisadas; o critério de ponto de corte com 3sd foi mais vantajoso, sobretudo na fase de inquérito (Tabela 14).

Via de regra, o critério de 3sd (maior especificidade), quando pretendida em levantamentos epidemiológicos (inquérito), confere melhor desempenho para fins de diagnóstico, enquanto que 2sd (maior sensibilidade) atua melhor quando o propósito é triagem. O critério 3sd permite uma abrangência de 97,5% da população, ou seja apenas 2,5% dos eventos ocorreriam ao acaso e o critério de 2sd atinge 95% da população, com uma margem de erro de 5%. A condição mais rigorosa imposta pelo critério de 3sd, com uma margem de erro menor, requer uma amostragem maior, o que constitui uma desvantagem de sua aplicação em fases de triagem de levantamentos epidemiológicos, quando comparado com 2sd.

Embora proporcione menor sensibilidade, a opção pelo critério de 3sd, para o teste ELISA como única alternativa diagnóstica, se justifica, pois a maioria das amostras falso-negativas detectadas na fase de inquérito, geralmente com D.O. entre os pontos de corte envolvendo 2 e 3sd, foram confirmadas como negativas pelo imunoblot; considerando ainda

que as outras taxas de desempenho obtidas foram superiores em 3sd, principalmente para especificidade, VP+ e K (Tabela 13). GUO et ai (1994) e PATHAK et ai (1994) utilizaram 3sd como critério para fixar o ponto de corte no diagnóstico da cisticercose suína pelo teste ELISA.

Assim depreende-se que a maioria das amostras duvidosas se encontram entre 2sd e 3sd; o que sugere o emprego do imunoblot com a finalidade de confirmação de resultados do teste ELISA nas amostras com leitura superior ao ponto de corte com 2sd, principalmente entre 2sd e 3sd, como foi efetuado nesta pesquisa.