Purificação

Componentes do antígeno total de larvas de Taenia solium responsáveis por reações cruzadas constituem o maior fator limitante em testes sorológicos para diagnóstico da cisticercose humana, por isso a purificação do antígeno total de larvas de Taenia solium e de polipeptídeos específicos dele originados, pode ser uma boa alternativa de reagente para emprego em técnicas de alta sensibilidade como o ELISA (GOTTSTEIN et al., 1986).

Ao verificar que antígenos de glicoproteínas purificadas em cromatografia propiciaram especificidade superior à dos antígenos total e precipitado com sulfato de amônia, em imunoblot para cisticercose humana, MONTENEGRO et al (1994) concluíram que o uso mostraram altas especificidades no teste de imunodifusão frente a soro de coelho imunizados.

Testando antígenos fracionados por cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose ), visando evitar reações cruzadas em pacientes com cisticercose ou teníase, NASCIMENTO & ARAÚJO ( 1982b) verificaram que os picos 11 e III foram os mats sensíveis na detecção de anticorpos contra larvas de Taenia solium; ainda verificaram que os

BIBLIOTECA I CIR F/&,CULOADE DE SAÚDE PUBLICA

Ui'liV[RSIDAOE DE SÃO PAULO

antígenos preparados a partir de T solium adulta não se prestam ao diagnóstico da cisticercose.

Os antígenos de escólex e de pico 11, foram mais específicos para anticorpos contra larvas de Taenia solium que os de membrana, líquido vesicular e total de larvas de Taenia so/ium (NASCIMENTO & MAYRINK, 1984).

Segundo GOTTSTEIN et ai (1986) a corrida de SDS-PAGE em gradiente de 5-20%

do antígeno total de larvas de Taenia solium revelou um complexo antígeno com peptídeos de peso molecular relativo variando entre 250 e 8kD, a maioria entre 94 e 28kD, evidenciando ainda uma segunda região de peptídeos de baixo PM entre 24 e 8kD. Dois peptídeos, 26 e 8kD, detectaram anticorpos em pacientes com cisticercose, sem acusar reação em pacientes com equinococose cística ou alveolar. O desempenho do peptídeo de 26kD foi melhor, neurocisticercose reconheceram os componentes antigênicos da fração 11 pelo teste Erythro-LIT, utilizando conjugado contendo lectina com afinidade para eritrócitos de carneiro.

KUMAR & GAUR ( 1987) fracionaram 5ml de antígeno de larvas de Taenia solium em cromatografia de filtração em gel sob fluxo de ascenção de 3, 7crnlh, empregando coluna de Sephadex G-200, equilibrada com PBS (pH 7,2). Avaliando os antígenos obtidos pelo teste ELISA de soros suínos naturalmente e experimentalmente infectados, os autores observaram que o I o pico revelou maior sensibilidade, 95,8%, frente ao escólex (91 ,6%) e ao 2° pico

(70,8%) e maior especificidade, 96,2%, ao lado de 92,3% para o escólex e para o 2° pico; o 1°

pico não mostrou reação cruzada, a qual apareceu com T. hidatigena e A. suum ao utilizar 2°

pico e escólex.

CHENG & KO ( 1992) purificaram o antígeno total de larvas de Taenia solium em coluna de gel contendo Sephacryl S-200 (26,4 ml/h) obtendo 4 frações (3 picos), as quais foram testadas por imunoensaios (ELISA, imunoblot, Imunodifusão e Imunoeletroforese), frente aos soros de suíno previamente imunizados com antígeno total de larvas de Taenia solium e frente aos soros de coelho imunizado contra antígenos heterólogos de outras 11 parasitoses (T. hidatigena, E. granulosus, A. suum, Metastrongylus apri, Trichinella spiralis, Trichuris suis, Toxocara canis, Dipylidium caninum, Fasciolopsis buski, Hymenolepis diminuta, Gnathostoma hispidum). As condições ótimas para reação no teste ELISA foram: soro de suino (1/1.000), soro de coelho (1/8.000), antígeno (10f.1g/ml) e conjugado (1/1.000).

Todas as frações obtidas por CHENG & KO (1992) mostraram-se reativas aos soros de suínos imunizados. Não houve reação cruzada do soro suíno contra larvas de Taenia solium testado com as quatro frações obtidas e os antígenos heterólogos das II parasitoses mencionadas, mas as quatro frações apresentaram epítopos comuns a outras patologias, quando testados com soros de coelhos imunizados, principalmente com antígenos de T. hidatigena e de E granulosus: provavelmente estas reações foram provocadas por elementos presentes, exclusivamente, nos soros de coelhos.

Analisando as frações do antígeno de larvas de Taenia solium, a ma10na dos determinantes antigênicos reativos identificados pelo imunoblot estavam na 1 a e na 2a frações, especialmente os de peso molecular de 105, I 03 e 95kD, o primeiro e o último considerados como subunidades do antígeno B. A segunda fração antigênica (180, 165, 146, 134, 122, 105, I 03, 95, 78, 73, 68, 51, 42 e 39kD) demonstrou ter alta sensibilidade e ser um antígeno

potencialmente eficiente no sorodiagnóstico da cisticercose suína, se submetido a novas

Quadro 1. Peptídeos responsáveis por reatividade cruzada pelo imunoblot (gel 12%) segundo MONTENEGRO et ai. ( 1994)

Antígenos Soros humanos infectados Soros humanos infectados por T. solium por E. granulosus

T. solium(total) 13,14,18,42,50,61 12,13,17,40,62,105,120

T solium (precipitado) 13, 14, 18,42,50,61 12, 13, 17,40,62, 92,105 T. so/ium(glicoproteínaspurificadas) 13 ,14,18,21,24,42,50* 40,62

E. granulosus (total) 38,54 13,17,27,62

*Peptídeos glicoproteicos específicos para cisticercose; além destes foi detectada um peptídeo não glicoproteico também específico, de 61-67 kD.

A segunda fração do antígeno total de larvas de Taenia solium eluída de Sephadex G-200 a uma taxa de fluxo de 2,4cm/h, por KAUR et ai (1996), apresentou sensibilidade de 95,2% e especificidade de I 00% no teste ELISA para neurocisticercose humana, sensibilizando as placas com I O~g/ml. Esta eficiência, bem como sua natureza glicoprotéica termoestável a 60°C, favorecem seu emprego em levantamentos soroepidemiológicos. Os peptídeos encontrados nessa fração foram: 24, 20 e 18kD. O bom desempenho da referida fração também foi detectado em suínos por KAUR et.al. (1995),

sensibilizando as placas com 30lJ.g/ml da segunda fração para os ensaios do teste ELISA, cinco vezes inferior à concentração do antígeno original.

A tecnologia do DNA recombinante ainda não revelou resultados satisfatórios no tocante à purificação de antígenos para aplicação no diagnóstico da cisticercose, embora tenha apontado algumas perspectivas positivas (GEVORKIAN et ai, 1996).

Me MANUS et ai ( 1991) procederam a clonagem de vários lotes de metacestódeo de Taenia solium, identificando 40 clones soropositivos, representando alguns deles, polipeptídeos altamente específicos diferenciando soros de pessoas com cisticercose daqueles de pessoas infectadas por E granulosus, E. multilocularis e 7: saginata.

MANOUTCHARIAN et ai (1996) verificaram a proteção 96,8% de suínos vacinados com os peptídeos 74, 66 e 56kD de larvas de Taenia crassiceps quando desafiados com ovos de Taenia so/ium. Este desempenho influenciou na escolha dos peptídeos 74 e 56kD para o estudo de DNA recombinante, visando obter antígeno com maior poder diagnóstico. A partir da seqüência de DNA obtida, foram detectados e isolados 13 clones recombinantes fortemente soropositivos, dos quais cinco reagiram com um pool de soros de suínos portadores de cisticercose.

GEVORKIAN et ai ( 1996) selecionaram um dos cinco clones destacados por MANOUTCHARIAN et ai (1996) como importantes no estudo da cisticercose, o KETc7, rico em prol i na (29% ), com a finalidade de produzir peptídeos sintéticos imunodominantes de interesse no diagnóstico da cisticercose. Foram identificados diversos epítopos potencialmente antigênicos em KETc7 e escolhidos três para síntese protéica. Os peptídeos sintetizados foram testados em confronto com o antígeno vesicular de larvas de Taenia crassiceps pelo teste ELISA, obtendo-se valores inferiores de D.O. para os antígenos sintéticos e baixo poder discriminatório dos soros de suínos experimentalmente infectados com Taenia so/ium. Os autores associam a deficiência do antígeno sintético à escassez de

material antigênico utilizado na síntese, devendo-se empregar múltiplos peptídeos provenientes de diferentes clones para aprimorar o sorodiagnóstico.