Papel do estresse do RE na inibição da via de sinalização PI3K/AKT

De acordo com a nossa hipótese, a disfunção contrátil de cardiomiócitos causada pelo estresse do RE resultaria da inativação da via de sinalização PI3K/AKT pela proteína JNK. Para testar essa hipótese, incubamos cardiomiócitos isolados, 30 min antes da indução do estresse do RE, com o SP600125 e o PI3K α inhibitor II, inibidores específicos das proteínas JNK e PI3K, respectivamente. Quinze horas após a adição da tunicamicina no meio de cultura, avaliamos a expressão proteica de GRP78, CHOP, JNK e AKT, além dos níveis de fosforilação de AKT e JNK.

A indução do estresse do RE com 10 µg/ml de tunicamicina aumentou mais uma vez a expressão proteica dos marcadores de estresse do RE, GRP78 e CHOP, nos cardiomiócitos (Figura 11A e B). Nenhuma alteração significativa na expressão proteica dos marcadores de estresse do RE foi observada em resposta à inibição das proteínas JNK e PI3K (Figura 11). Contudo, observamos que o co-tratamento dos cardiomiócitos com o SP600125 e o PI3K α inhibitor II, antes da adição de tunicamicina, atenuou o

aumento da expressão proteica de CHOP, observado nos cardiomiócitos que receberam apenas tunicamicina (Figura 11B). Uma vez que não observamos efeito da inibição de JNK no aumento da expressão proteica de CHOP induzido pelo estresse do RE, é razoável sugerir que a atenuação da expressão dessa proteína, observada nos cardiomiócitos que receberam o SP600125 e o PI3K α inhibitor II antes da indução do estresse do RE, seja resultado da inibição da PI3K.

A via de sinalização PI3K/AKT está envolvida na hipertrofia fisiológica do coração e quando ativada, aumenta a síntese proteica nos cardiomiócitos (DEBOSCH et al., 2006; KEMI et al., 2008). Pelo fato da inibição da via de sinalização PI3K/AKT diminuir a síntese proteica e a tunicamicina inibir a reação de glicolisação de proteínas, causando o acúmulo de proteínas mal enoveladas no RE, é possível que a atenuação da expressão proteica de CHOP pela inibição da PI3K, seja resultado de uma menor quantidade de proteínas a serem sintetizadas no RE.

Figura 11. Expressão das proteínas A) GRP78 e B) CHOP em cardiomiócitos

isolados, incubados (+) ou não (-) com SP600125 (20 µM), PI3K α inhibitor II (20 µM) e tunicamicina (10 µg/ml). O SP600125 e o PI3K α inhibitor II foram adicionados 30 min antes da incubação dos cardiomiócitos com tunicamicina por 15 horas. O número amostral em cada tratamento foi de 7 e 6 para GRP78 e CHOP, respectivamente. Os dados estão apresentados em média ± EPM.

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Corroborando a nossa hipótese, o estresse do RE aumentou a fosforilação de JNK (Figura 12B), apesar de não ter alterado a expressão dessa proteína (Figura 12A). O SP600125 também não interferiu na expressão proteica de JNK (Figura 12A). Entretanto, observamos que essa droga foi efetiva no sentido de inibir a JNK, uma vez que o aumento na fosforilação dessa proteína causado pelo estresse do RE não foi observado nos cardiomiócitos tratados com o SP600125 (Figura 12B). Além disso, nenhuma alteração foi observada na expressão ou na fosforilação da proteína JNK em resposta ao tratamento dos cardiomiócitos com o PI3K α inhibitor II (Figura 12A e B_).

O aumento da fosforilação da JNK em resposta ao estresse do RE já foi demonstrado por outros grupos de pesquisa e está bem caracterizado na literatura (URANO et al., 2000; GROENENDYK et al., 2010). A fosforilação dessa quinase é resultado da ativação de um dos efetores da UPR, o IRE-1, que quando ativado pelo desligamento da GRP78 inicia uma cascata de sinalização que culmina com a fosforilação e ativação da JNK (URANO et al., 2000; GROENENDYK et al., 2010_{). Porém, o que não está claro ainda é o papel da JNK na disfunção contrátil} de cardiomiócitos isolados induzida pelo estresse do RE.

Diferente da nossa hipótese, o estresse do RE não diminuiu a fosforilação de AKT (Figura 12D). Além de não inibir a via de sinalização PI3K/AKT, o estresse do RE também não alterou a expressão proteica de AKT (Figura 12C). Da mesma forma, o SP600125 não teve efeito na expressão e na fosforilação de AKT (Figura 12C e D). Contudo, o PI3K α inhibitor II reduziu os níveis de AKT fosforilada, mas sem alteração na expressão de AKT (Figura 12C e D).

Apesar dos nossos resultados sugerirem que o estresse do RE não inative a via de sinalização PI3K/AKT em cardiomiócitos, outros pesquisadores observaram que a indução do estresse do RE reduziu os níveis de AKT fosforilada (OZCAN et al., 2004; PETROVSKI et al., 2011; ZHANG et al., 2011). Entretanto, essa resposta parece ser dependente da fase da UPR. De fato, PETROVSKI et al. (2011) demonstraram que a diminuição da fosforilação de AKT no coração de ratos tratados com diferentes doses de tunicamicina acontece somente na fase de apoptose da UPR.

Figura 12. Níveis proteicos de A) JNK, B) JNK fosforilada nos sítios

Thr183/Tyr185, C) AKT e D) AKT fosforilada no sítio Ser473 em cardiomiócitos isolados, incubados (+) ou não (-) com SP600125 (20 µM), PI3K α inhibitor II (20 µM) e tunicamicina (10 µg/ml). O SP600125 e o PI3K α inhibitor II foram adicionados 30 min antes da incubação dos cardiomiócitos com a tunicamicina por 15 horas. O número amostral em cada tratamento foi de 5, 6, 7 e 6 para JNK, pJNK, AKT e pAKT. Os dados estão apresentados em média ± EPM.

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II, &p _{≤ 0.05 vs. + Tunicamicina + SP600125 + PI3K α inhibitor II.}

Nesse sentido, os cardiomiócitos analisados no presente estudo parecem estar em uma fase da transição entre a fase de adaptação e a fase de apoptose da UPR. Essa hipótese é reforçada, pelo fato de apesar dos cardiomiócitos tratados com tunicamicina apresentarem um aumento na expressão proteica de CHOP, essas células ainda têm níveis proteicos elevados de GRP78 (Figura 11A e B). Contudo, independe da fase da UPR, na

qual a via de sinalização PI3K/AKT é inativada, nossos dados sugerem que a disfunção contrátil de cardiomiócitos isolados independe da inativação dessa via de sinalização. Além disso, nossos resultados demonstram que em cardiomiócitos isolados, o estresse do RE de fato ativa a JNK, porém, a ativação dessa proteína não é acompanhada por uma inibição da via de sinalização PI3K/AKT.

5.1.5. Participação da proteína JNK na disfunção contrátil de