Segunda etapa

Nos experimentos in vitro, o intuito foi o de verificar se o estresse do RE causaria a disfunção contrátil de cardiomiócitos por meio da ativação de JNK. Na segunda etapa, submetemos ratos infartados a um protocolo de corrida em esteira rolante, no intuito de verificar se a ativação da via de sinalização JNK/BNIP3 pelo estresse do RE ocorre no coração de ratos infartados e se o TFA seria capaz de atenuar essa resposta.

4.2.1. Animais de experimentação e tratamento

Utilizamos ratos (Rattus Norvergicus) da linhagem Wistar, com massa corporal média de 200 g, os quais foram alojados em gaiolas coletivas (quatro animais por gaiola), receberam água e ração comercial ad libitum, foram mantidos em ambiente com temperatura de 22°C e regime de luminosidade invertido de 12/12 horas escuro/claro.

Os animais foram divididos em 3 grupos: controle sedentário (SHAM- SED, n = 6), infartado sedentário (INF-SED, n = 5) e infartado treinado (INF-TF, n = 5). A cirurgia para indução do IM foi realizada nos animais dos grupos INF-

SED e INF-TF. Em contrapartida, os ratos do grupo SHAM-SED foram submetidos aos mesmos procedimentos cirúrgico, porém sem a ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda. Quatro semanas após a realização ou simulação da cirurgia para indução do IM, os animais do grupo INF-TF foram submetidos a um protocolo de TFA em esteira rolante previamente padronizado em nosso laboratório (FERREIRA et al., 2007) e descrito no item 4.2.3. Os ratos dos grupos SHAM-SED e INF-SED, permaneceram sedentários durante todo o período experimental (Figura 7).

Figura 7. Sequência experimental referente a etapa 2 do estudo. Os valores

abaixo das setas representam as semanas do período experimental, enquanto as caixas de texto acima das setas indicam os procedimentos que foram realizados ao longo deste período.

4.2.2. Teste de corrida em esteira rolante

Para avaliar a tolerância a realização de esforço físico, submetemos todos os animais a um teste progressivo escalonado até a exaustão em esteira rolante, onde a velocidade inicial da esteira foi de 6 m/min, sem haver inclinação da mesma. A cada três minutos, a velocidade da esteira foi acrescida de 3 m/min até a exaustão do animal de acordo com protocolo padronizado anteriormente no laboratório (FERREIRA et al., 2007). A variável medida foi a distância em metros percorrida por cada animal durante o teste

máximo. Este parâmetro foi utilizado para prescrição da intensidade e avaliação da eficácia do TFA (Figura 7).

4.2.3. Protocolo de treinamento físico em esteira rolante

Os animais do grupo INF-TF foram submetidos a um protocolo de corrida em esteira rolante, com objetivo de testar a hipótese de que o TFA seria capaz de atenuar o estresse do RE e a ativação via de sinalização JNK/BNIP3 no coração de ratos infartados (Figura 7).

O TFA em esteira rolante foi realizado durante 8 semanas, com sessões de exercício com duração de 60 minutos, 5 vezes por semana, à 60% da velocidade máxima atingida no teste de corrida em esteira rolante, realizado na quarta semana após a cirurgia para indução do IM (Figura 7). Vale destacar que essa intensidade foi obtida em estudo prévio do nosso laboratório (FERREIRA et al., 2007), a qual corresponde à máxima fase estável do lactato sanguíneo.

4.2.4. Análise ecocardiográfica

Para avaliar a estrutura e função cardíaca dos animais, realizamos analise ecocardiográfica em modo M, em dois períodos, 4 e 12 semanas após a realização da cirurgia para indução do IM (Figura 7). Para isso, os animais foram anestesiados com xilazina (10 mg/kg, i.p.) e quetamina (50 mg/kg, i.p.), colocados em posição supinada e submetidos à tricotomia do tórax. A profundidade da anestesia foi controlada pela frequência cardíaca dos animais, mantendo-a semelhante em todos os animais durante o exame ecocardiográfico. As dimensões cardíacas foram mensuradas por ecocardiógrafo (Acuson Sequoia 512, Siemens, EUA) equipado com transdutor linear de 14 Mhz .

As medidas realizadas foram: dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DDFVE), dimensão sistólica final do ventrículo esquerdo (DSFVE), espessura do septo interventricular na diástole (SIVD), espessura do septo interventricular na sístole (SIVS), espessura da parede posterior do ventrículo

esquerdo na diástole (PPVED); espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na sístole (PPVES); frequência cardíaca (FC) e a função contrátil do ventrículo esquerdo foi determinada por meio da fração de encurtamento (FE), calculada pela fórmula: FE (%) = [(DDFVE - DSFVE) / DDFVE] x 100.

4.2.5. Avaliação do tamanho do IM

Para determinar a eficiência da cirurgia para indução do IM e verificar o efeito do TFA no tamanho da área infartada, avaliamos a extensão do IM conforme descrito anteriormente (BOZI et al., 2013) (Figura 8). Para isso, os corações foram cortados em 3 secções transversas: ápice, anel mediano (aproximadamente 3 mm) e base. O anel mediano foi imediatamente fixado em formalina 4% por 24 horas e depois submetido ao processamento histológico de rotina (desidratação, diafanização e impregnação) para inclusão em parafina. Em seguida, as secções foram cortadas em 5 µm de espessura utilizando um micrótomo rotativo (Reichert-Jung 2045 Multicut, Alemanha). Para análise da extensão do infarto os cortes foram corados com Picrosirius. Foi utilizado um scanner (HP deskjet F380, EUA) para captura das imagens destinadas à análise da extensão do infarto. O cálculo da porcentagem de infarto foi realizado utilizando a seguinte fórmula (Mulder et al., 2002):

(CEN + CEP / PEN + PEP) x 100

Onde, CEN = perímetro da cicatriz endocárdica; PEN = perímetro endocárdico total; CEP = perímetro da cicatriz epicárdica; PEP = perímetro epicárdico total.

O tamanho do infarto dos grupos (porcentagem do ventrículo esquerdo infartado) foi expresso como porcentagem da extensão.

4.2.6. Análise da expressão proteica (Western blotting)

Para verificar se a ativação da via de sinalização JNK/BNIP3 pelo estresse do RE ocorre no coração de ratos infartados e se o TFA seria capaz de atenuar essa resposta, analisamos a expressão proteica de GRP78, CHOP,

JNK, BNIP3, além dos níveis de JNK fosforilada, pela técnica de Western

blotting, conforme descrito no item 4.1.2.