5.2 Crom at ografia líquida de alt a eficiência HPLC
5.2.2 Parâm et ros que afect am a separação em HPLC
Os parâm et ros que afect am a separação em HPLC são os seguint es:
• Com posição e m odo de operação da fase m óvel (eluente), nom eadam ente: o Com posição de eluent es ( os solvent es devem t er elevado grau de
pureza) ; o pH;
o Modo de eluição: isocrát ica ou por gradient e. Na prim eira a com posição do solvent e de eluição perm anece const ant e, ao passo que no segundo a com posição é alt erada ao longo da análise.
• Bom bas – o seu desem penho afecta o tem po de retenção, a reprodutibilidade, a sensibilidade do det ect or e a est abilidade do fluxo produzido, um a vez que a velocidade do fluxo flutuant e origina ruído de fundo no det ect or, o que leva à degradação dos sinais de m enor int ensidade ( Harris, 1999) .
• Coluna crom atográfica – onde ocorre a separação dos com ponentes da m ist ura. ( foi usada um a coluna de fase reversa C18 não polar. É necessário ter em at enção ( Buchholz, 2007) :
o Tem perat ura de operação da coluna. O aum ent o da t em perat ura perm it e obt er t em pos de ret enção m ais baixos t endo em cont a que a viscosidade do solvent e dim inui, obt endo um a m elhor resolução. A t em perat ura deve ser adequada à fase est acionária e deve ser m ant ida const ant e para m elhorar a reprodut ibilidade e a precisão quant it at iva;
o Dim ensões da coluna. As colunas m ais com uns t êm com prim ent os de 100 a 250 m m , e de 3 a 9 m m de diâm et ro int erno;
o Espessura e t ipo de part ículas da fase est acionária. O em pacot am ent o m ais com um é constituído por part ículas m icroporosas de sílica, cobertas com finos film es orgânicos, que se ligam à superfície das part ículas de sílica. O int ervalo de variação dos poros das part ículas
t em de ser m uit o pequeno de m odo a garant ir um a elevada eficiência e perm eabilidade.
• Detector – deverá ser sensível a baixas concentrações de analito, originando um a respost a linear, e insensível a variações de t em perat ura e da com posição do solvente. A m aioria dos com postos orgânicos pode ser analisada por det ect ores UV/ VI S que possui um a relat iva facilidade de operação do equipam ent o. O seu funcionam ent o baseia- se na Lei de Lam bert - Beer, onde a absorvância de radiação é proporcional à concent ração do com post o e ao com prim ent o da célula ( Harris, 1999) .
6 . Ext racção em Fase Sólida - SPE
A extracção em fase sólida ( SPE) é, act ualm ent e, o m ét odo m ais frequent em ent e em pregue para a ext racção, concent ração e purificação de analit os present es em m at rizes líquidas ( Hennion, 1999) .
A SPE, por vezes t am bém referida com o ext racção sólido- líquido, pode ser descrit a com o um a técnica de ext racção onde um a fase m óvel contendo o analito ( ex: m atriz aquosa) percola um a fase sólida ( ex: C- 18) prom ovendo o isolam ent o/ ret enção do analit o na fase sólida, com base na part ição select iva ent re as duas fases. A recuperação ou eluição do analito da fase sólida realiza- se post eriorm ent e at ravés da “ lavagem ” dest a com um solvent e orgânico apropriado. A percolação consist e na capacidade do líquido at ravessar um det erm inado m eio. No caso da SPE, define- se com o a passagem lent a de um líquido, sob pressão, at ravés de um m eio sólido, para efect uar a sua filt ração ou fazer a ext racção de subst âncias present es nesse m eio.
A eficiência do m ét odo depende principalm ent e da escolha apropriada da fase sólida ( adsorvent e) e do “ solvent e de lavagem ” . Act ualm ent e exist em com ercialm ent e disponíveis um a vast a gam a de adsorventes com diferentes selectividades ( e em diferentes form atos) sendo os de fase reversa os m ais generalizados na extracção de analit os de am ost ras aquosas ( Queiroz, 2001) .
A crescent e utilização da SPE e aceitação pelas “ agências de regulação” com o a USEPA deve- se às vant agens que apresent a com parada com out ros m ét odos t radicionais, com o a ext racção líquido- líquido, das quais se dest acam ( Cast ilho et
al., 1995) :
rapidez e facilidade de m anuseam ent o e aut om at ização; selectividade e reprodutibilidade;
boas recuperações e m aiores fact ores de concent ração;
redução do volum e de solvent es orgânicos ut ilizados e do tem po de operação Na Figura 6.1 apresenta- se a estrutura geral dos cartuchos usados em SPE.
Figura 6 .1 Cart ucho para ext racção em fase sólida ( Phenom enex, 2007)
A retenção de analit os orgânicos de um a solução polar ( ex. água) no enchim ento deve- se á int eracção exist ent e ent re os analit os e os grupos funcionais present es no enchim ent o. Est as int eracções podem ocorrer ent re forças at ract ivas apolares, denom inadas por forças Van- der Waals ou forças de dispersão ( Som enath, 2003) . O m at erial de enchim ent o deverá, port ant o, ser seleccionado m ediant e o t ipo de com post os que se pret ende analisar ( select ividade) , de form a a aum ent ar a eficiência do processo ( Nogueira, 2004) .
Os cart uchos polim éricos de fase reversa perm it em a ret enção rápida de com post os polares e apolares. Possuem um a elevada select ividade para com post os polares e arom át icos, elevadas taxas de recuperação para com post os ácidos, neut ros e básicos e são est áveis para gam as de pH ent re 1 e 14 ( Phenom enex, 2007) .
Consoant e os analit os que se pretendem separar recorre- se a enchim ent os diferent es. No ent ant o algum as caract eríst icas necessit am de ser respeit adas, nom eadam ent e ( Pereira, 2006) :
ser poroso e com elevada área superficial; garant ir um a adsorção reversível do analit o; t er um a baixa percentagem de im purezas; apresentar est abilidade quím ica e t érm ica;
proporcionar um a boa superfície de cont act o ent re a fase sólida e o analit o;
Corpo da coluna Enchimento
prom over t axas de recuperação elevadas;
Operacionalm ent e a SPE é um a t écnica de preparação de am ost ra que t em genericam ent e associados t rês princípios ( Pereira, 2006) :
- concent ração do analito;
- rem oção de subst âncias int erferent es;
- alt eração da m at riz do analito para post erior análise.
O processo de SPE divide- se em quatro et apas fundam ent ais, sendo elas: o condicionam ent o, passagem da am ost ra, lavagem do m at erial adsorvent e e a eluição dos analit os ( Phenom enex, 2007) . O esquem a ilust rat ivo da t écnica encont ra- se na Figura. 6.2.
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Figura 6 .2 Ext racção em fase sólida ( adapt ado de Phenom enex, 2007)
1. Acondicionamento 2. Passagem da amostra 3. Lavagem 4. Eluição Lavagem com metanol H2O Lavagem com metanol e H2O Analito Interferente Interferente Analito Acetona
7 . Processo elect rocinét ico
O processo elect rocinét ico é um a t écnica de rem ediação, aplicada com sucesso a m at rizes sólidas porosas cont am inadas. O fenóm eno engloba diferent es m ecanism os de transport e que estão relacionados com a presença de iões adsorvidos a part ículas, form ando cam adas duplas eléct ricas. O processo est á especialm ent e indicado para a rem ediação de solos de granulom et ria fina, devido à presença da cam ada dupla difusa.
I núm eros est udos de elecro- rem ediação t êm sido conduzidos à escala laborat orial de bancada e de pilot o, em diferent es t ipos de m at rizes cont am inadas ( Ot t osen et
al., 2003) , nom eadam ent e, solos ( Ot t osen et al., 1997; Ribeiro, 1998; Ribeiro et al., 2005, Ribeir o & Rodríguez- Marot o, 2006) , lam as ( Ot t osen et al., 2007) ,
resíduos m ineiros ( Hansen et al., 2005) , cinzas ( Pedersen et al., 2003; Ferreira et
al., 2005; Ot t osen et al., 2006) , sedim ent os ( Nyst roem et al., 2005) e em resíduos
de m adeira t rat ada ( Ribeiro et al., 2000; Christ ensen et al., 2006; Ribeiro et al., 2007) .
Em det alhe, o processo elect rocinét ico consist e na aplicação de um a corrent e direct a de baixa int ensidade, que produz um a densidade de corrent e na ordem dos m A/ cm2, sendo aplicada na secção transversal da m assa de solo, ou de out ra
m at riz, ent re um par ( ou vários pares) de eléct rodos. O solo ou a m at riz cont am inada hum edecida cont ém part ículas carregadas, verificando- se que as espécies poluent es ( e out ras) são conduzidas na direcção de um dos eléct rodos, de onde poderão ser rem ovidas ( Ribeiro, 1998; Ribeiro & Rodríguez- Marot o, 2006) . As espécies carregadas posit ivam ente m ovem - se na direcção do cát odo e as espécies com carga negat iva m ovem - se na direcção do ânodo. Assim , o obj ect ivo principal dest a t écnica consist e em operações de rem ediação/ descont am inação am bient al, at ravés da rem oção de poluent es ( m et ais pesados e contam inant es orgânicos) do solo e sub solo, quer in- sit u, quer ex- situ, t endo vindo t am bém a ser aplicada na solução de problem as geot écnicos em proj ect os de fundações e/ ou est abilização de t aludes ( Ribeiro, 1998; Souza, 2002) , um a vez que induz a m obilização de espécies presentes no solo a concentrarem - se e ficarem confinadas ao espaço que rodeia um dos eléct rodos. Exist em t rês processos principais de
t ransport e que são responsáveis por est e m ovim ent o: elect rom igração, elect roosm ose e elect roforese ( Ribeiro, 1998; Ribeiro & Rodríguez- Marot o, 2006) , adiant e explicados com m aior det alhe.
A Figura 7.1 ilustra os processos de transport e que ocorrem nos poros do solo subm etido à acção de um cam po eléct rico.
Figura 7 .1 Processos de transporte ( Batt isti, 2006)
Múltiplas variáveis influenciam a contribuição dos t rês processos referidos ant eriorm ent e, nom eadam ent e, a solução existente no interior dos poros, a sua condut ividade, a m ineralogia do solo e a sua porosidade. Os processos de transporte são acom panhados de fenóm enos de adsorção, precipitação e dissolução, interacções quím icas no solo e reacções várias na solução exist ente nos poros ( Acar & Alshawabkeh, 1993; Probst ein & Hicks, 1993) .
O transporte físico- quím ico da carga, a acção de partículas carregadas e os efeitos do pot encial eléct rico aplicado na form ação e t ransport e da solução no m eio poroso, const it uem o fenóm eno elect rocinét ico que ocorre na m at riz. Um a com binação ent re fluxos e gradient es eléct ricos, quím icos e hidráulicos, j unt am ent e com a cam ada dupla difusa origina, por sua vez, vários fenóm enos elect rocinét icos, nom eadam ent e a elect rom igração, elect roosm ose e elect roforese, a seguir det alhados ( Alshawabkeh & Acar, 1996) .
7 .1 Elect rom igração
A electrom igração consist e no m ovim ent o de iões sob a acção de um cam po eléct rico. Apresent a predom inância em solos sob a acção de um pot encial eléct rico, em part icular com espécies solúveis carregadas ( por ex.: os m et ais pesados Pb2+,
Cd2+, Cu2+) , onde o pot encial zet a do solo pode não exist ir ou ser dim inut o. Tal
com o ant eriorm ent e referido, as espécies carregadas posit ivam ent e m ovem - se em direcção ao cátodo e as negat ivam ente em relação ao ânodo ( Ribeiro, 1998) .
A corrent e eléct rica t ende a passar pelo m eio onde a resist ência eléct rica é m enor. Nos solos, a resist ência é m enor na cam ada dupla difusa, onde os iões se encont ram acum ulados m as não adsorvidos especificam ent e. Assim , é expect ável que a corrent e eléct rica passe j unt o à superfície dos colóides do solo e nos m icroporos ( Ottosen, 1995) .
A teoria da electrom igração em solos revest e- se de especial dificuldade tendo em conta que os iões precisam de ser conduzidos através dos canais tortuosos existentes no solo, ou sej a, percorrem dist âncias consideráveis. Tam bém a adsorção não específica dos iões à superfície dos coloides do solo influencia a m igração ( Ottosen, 1995) .
A eficiência da corrent e na elect rom igração dum a espécie iónica específica é expressa pela proporção de carga eléct rica arrast ada pela espécie em est udo, em relação à quant idade de carga arrast ada por t odas as espécies carregadas na solução ( Ribeiro, 1998) . A m igração é o processo que m ais contribui para o fluxo t ot al ( Acar & Alshawabkeh, 1993; Pam ukcu & Wit t le, 1994)
A electrom igração pode ser teoricam ente calculada através da expressão de Nernst – Einstein:
)
(
*φ
−
∇
=
i i i em ic
RT
F
z
D
J
(7.1)
Onde:Jiem = fluxo de electrom igração ( m ol m- 2 s- 2) ;
Di* = coeficiente de difusão efectiva da substância quím ica i; zi= carga na espécie quím ica i;
R e T = const ant e universal dos gases e t em perat ura absolut a, respect ivam ent e;
ci = concentração da substância quím ica i na fase aquosa ( m ol dm- 3) ;
∇ φ = gradiente de potencial eléctrico (V m- 1) .