1. Seletividade
A seletividade é o primeiro passo no desenvolvimento da validação de método e deve ser reavaliada continuamente durante a validação e posteriormente no uso do método (RIBANI et al., 2004).
A seletividade é realizada para avaliar a influência da matriz na curva analítica. No documento do INMETRO, o DOC-CGCRE-008, de agosto de 2016, não há recomendação de nenhuma forma de cálculo para a determinação da seletividade.
Corresponde o quanto o método responde, exclusivamente, ao analito de interesse na análise, além disso, investiga os efeitos de interferências de outros analitos, usualmente é utilizada adição de interferentes nas amostras de branco e adições padrões nas amostras de interesse ou materiais de referências, amostras com ou sem o analito, observando assim as respostas. Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a tendência e a precisão estarão seriamente comprometidas (EURACHEM/CITAC Guide, 2014).
2. Linearidade e faixa de trabalho
A linearidade corresponde a capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito analisado, dentro de uma determinada faixa de aplicação, além de verificar até que ponto a faixa de concentração do analito coincide com a faixa dinâmica linear, e certificar que não ocorra nenhuma interferência na resposta ao analito(RIBANI et al., 2004).
A faixa de trabalho é o intervalo entre a menor concentração e a maior concentração de analito para a qual se demonstrou que o procedimento analítico possui um nível aceitável de precisão, exatidão e linearidade (ICH, 2005). Assim, a faixa linear de trabalho é, por inferência, a faixa de concentração do analito onde sua resposta é proporcional (EURACHEM/CITAC Guide, 2014).
A linearidade é observada a partir de um gráfico de intensidade em função da concentração do elemento, deve-se verificar a ausência de valores discrepantes (em
inglês, outliers), pelo teste de Grubbs (Equação AN 1) para cada nível de concentração, e depois verificação pela equação da regressão linear, determinada pelo método dos mínimos quadrados (INMETRO, 2016).
=
| ̅| (AN 1)Onde:
xi : valor individual do sinal instrumental
x : média dos valores do sinal instrumental
A correlação entre o sinal medido e a massa ou concentração de um elemento a ser quantificado muito esporadicamente é conhecido antes da análise, neste caso, faz necessário o uso de uma relação matemática entre o sinal e a concentração do elemento a ser quantificado. Essa relação matemática chama-se curva analítica, conforme apresentado na Equação AN 2 (RIBANI et al., 2004):
= +
(AN 2) Sendo:y : resposta medida (intensidade, absorvância, área, etc.); x : concentração;
a : coeficiente linear (intersecção com eixo y, quando x = 0);
b : coeficiente angular (inclinação da curva analítica = sensibilidade).
Os coeficientes da equação da reta são calculados através das Equações AN 3 e AN 4 abaixo:
=
∑ ∑= −
̅
(AN 3)=
∑ ∑ ̅̅ (AN 4) Onde:
xi : valores individuais de concentração;
yi: valores individuais de sinal instrumental;
x : média de valores de x (concentração); y : média dos valores de y (sinal instrumental).
Na Figura 23, estão representados os parâmetros de desempenho descritos neste item.
Figura 23: Exemplo típico de uma curva analítica com a identificação de alguns parâmetros de desempenho.
Quanto mais sensível, maior é a variação na resposta, ou seja, maior inclinação (b). Porém, para se encontrar a linearidade necessita-se de no mínimo cinco pontos de concentração para a curva analítica e o número de replicatas deve ser o mais próximo do praticado na rotina de análise (THOMPSOM, 2002).
Além do cálculo para encontrar os coeficientes de regressão a (interseção) e b (inclinação) da curva analítica, também é possível calcular os resíduos e o coeficiente de correlação (r).
O resíduo, apresentado na Equação AN 5, é a diferença entre o valor medido e o valor calculado pela equação da reta de regressão para cada valor de x, eles devem ser representados graficamente e observado se há comportamento aleatório. Caso se observe alguma tendência, pode haver indício que o modelo linear seja inadequado (INMETRO, 2016).
í = |X − X | (AN 5) Onde:
Xmedido : valor medido de concentração
O coeficiente de correlação (r) permite estimar uma qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0 menor a dispersão no conjunto de pontos da curva analítica. Um coeficiente de correlação maior que 0,999 demonstra um ajuste ideal dos dados da linha de regressão. Para o INMETRO um coeficiente de correlação acima de 0,90 é considerado ideal. É um bom indicativo do quanto a reta pode ser considerada adequada como modelo matemático, porém não é conclusivo. Desse modo, devem ser avaliados os resíduos para verificar essa adequação(RIBANI et al., 2004).
3. Limite de detecção
O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância em exame que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental (RIBANI et al., 2004).
É utilizado, durante a validação, para estabelecer o limite inferior da faixa de operação prática do método (EURACHEM Guide, 2014). O limite de detecção pode variar conforme o tipo de amostra, devido a isso é de grande importância assegurar que todas as etapas do procedimento do método analítico sejam inclusas na determinação desse limite de detecção. Ao realizar uma validação do método é fundamental distinguir a detecção do analito do sinal do branco ou ruído (INMETRO, 2016).
O limite de detecção é calculado neste trabalho pelo método baseado em parâmetros da curva analítica e pode ser expresso como:
= 3,3 ×
(AN 6)Onde:
s : estimativa do desvio padrão da resposta, neste trabalho o desvio padrão do branco; b : inclinação (coeficiente angular) da curva analítica.
4. Limite de quantificação
O limite de quantificação (LQ) é a quantidade mínima de um analito que é quantificada com um nível aceitável de precisão e exatidão no método desenvolvido.
Equivale normalmente ao padrão de calibração de menor concentração, sem considerar o branco. Ao determinar o limite de quantificação o mesmo deve ser testado com amostras independentes, para certificar se a precisão e a tendência encontradas são satisfatórias (INMETRO, 2016).
O limite de quantificação é calculo neste trabalho pelo método baseado em parâmetros da curva analítica e pode ser expresso como:
= 10 ×
(AN 7)Onde:
s : estimativa do desvio padrão da resposta, neste trabalho o desvio padrão do branco; b : inclinação (coeficiente angular) da curva analítica.
5. Exatidão
Representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro (RIBANI et al., 2004).
Para a avaliação da recuperação é utilizado estudos com materiais de referência certificado (MRC) ou por adições padrões certificados (spikes), além de participações em comparações interlaboratoriais e realizações de ensaios de recuperação (EURACHEM Guide, 2014).
A exatidão pode ser expressa como recuperação analítica, definida como:
çã % =
×100
(AN 8)É importante estabelecer critérios de aceitação para a recuperação, de preferência seguindo as orientações normativas da legislação aplicável às áreas de atividades. Normalmente, os critérios estão atrelados ao nível de concentração. Na Tabela 20, temos os critérios sugeridos pela AOAC.
Tabela 20: Exemplo de critério de aceitação para recuperação.
Analito, % Razão do Analito Unidade Recuperação média, %
100 1 100% 98 – 102 10 10-1 10% 98 – 102 1 10-2 1% 97 – 103 0,01 10-3 0,1% 95 – 105 0,001 10-4 100 mg.L-1 90 – 107 0,0001 10-5 10mg.L-1 80 – 110 0,00001 10-6 1 mg.L-1 80 – 110 0,000001 10-7 100 ug.L-1 80 – 110 0,0000001 10-8 10 ug.L-1 60 – 115 0,00000001 10-9 1 ug.L-1 40 – 120 Fonte: AOAC, 2012 6. Precisão
A precisão consiste da dispersão de valores em um método, no qual se observa a concordância entre os resultados de medição sucessivas de um mesmo método. A precisão é avaliada pelo desvio padrão absoluto (DP) ou pelo desvio padrão relativo (DPR,%), também conhecido como coeficiente de variação (CV), Equação AN 9. Os testes que podem ser realizados para avaliar a precisão são a repetibilidade, precisão intermediária e a reprodutibilidade (VOCABULÁRIO INTERNACIONAL DE METROLOGIA, 2012).
=
=
×100
(AN9)Sendo:
DP : desvio padrão;
6.1.1 Repetibilidade
O objetivo da repetibilidade é observar a concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo método, em diferentes preparações e pode ser expressa pela estimativa do desvio padrão relativo (DPR,%)(RIBANI et al., 2004).
As condições de repetibilidade devem-se seguir as seguintes premissas: mesmo procedimento de medição; mesmo observador; mesmo instrumento usado sob mesmas condições; mesmo local e repetições no menor espaço de tempo possível, além de recomendar sete ou mais repetições para o cálculo da estimativa do desvio padrão (INMETRO, 2016).
Os critérios estabelecidos para aceitação do desvio padrão relativo (DPR,%), sob condições de repetibilidade é mostrado na Tabela 21, sugerido pela AOAC.
Tabela 21: Critério de aceitação para repetibilidade.
Analito, % Razão do analito Unidade DPR, %
100 1 100% 1,3 10 10-1 10% 1,9 1 10-2 1% 2.7 0,01 10-3 0,1% 3,7 0,001 10-4 100 mg.L-1 5,3 0,0001 10-5 10mg.L-1 7,3 0,00001 10-6 1 mg.L-1 11 0,000001 10-7 100 ug.L-1 15 0,0000001 10-8 10 ug.L-1 21 0,00000001 10-9 1 ug.L-1 30 Fonte: AOAC, 2012 6.2 Precisão intermediária
O propósito da precisão intermediária é avaliar a análise sob efeito de variações, no qual avalia-se a mesma amostra ou os mesmos padrões, o mesmo método no mesmo laboratório, mas variando algumas condições, podendo ser diferentes analistas; diferentes equipamentos e diferentes tempos de análise (INMETRO, 2016). Com os
dados de precisão intermediária pode-se verificar que o método fornece os mesmos resultados. O cálculo pode ser feito a partir da estimativa do desvio padrão relativo (DPR,%) (RIBANIet al., 2004).
Uma prática metrológica adotada para avaliar se alguma condição testada influencia significativamente o valor do desvio padrão da precisão intermediária é considerar os grupos testados (por exemplo, dias diferentes) estatisticamente semelhantes e comparar os resultados pelo teste T, definido como:
=
(AN 10)Onde:
X : média da amostra da população 1; Y : média da amostra da população 2; n1 : número de amostras da população 1;
n2: número de amostras da população 2;
sp : desvio padrão agrupado, que é dado por:
=
(AN 11)Onde:
n1 : número de amostras da população 1;
n2: número de amostras da população 2;
s2
1 : variância da amostra proveniente da população 1
s2
2 : variância da amostra proveniente da população 2
6.3 Reprodutibilidade
A reprodutibilidade utiliza as mesmas amostras ou padrões, semelhante à precisão intermediária, porém as análises devem ser feitas com analistas, equipamentos e laboratórios diferentes (INMETRO, 2016).
Os critérios estabelecidos para aceitação do desvio padrão relativo (DPR%), sob condições de reprodutibilidade é mostrado na Tabela 22, sugerido pela AOAC.
Tabela 22: Critério de aceitação para reprodutibilidade.
Concentração (C) Fração mássica (C) DPR predito (%)
100% 1,0 2 1% 0,01 4 0,01% 0,0001 8 10 ppm 0,00001 12 1ppm 0,000001 16 100 ppb 0,0000001 24 10 ppb 0,00000001 32 1ppb 0,000000001 45