Esses est udos foram desenvolvidos no Laborat ório de Com bustíveis e Mat eriais ( LACOM) na Universidade Feder al da Paraíba ( UFPB) em parceria com o Laborat ório de Físico- Quím ica de Alim ent os do Pavilhão Tecnológico da Universidade Federal do Maranhão ( UFMA) , Núcleo de I m unologia Básica e Aplicada ( NI BA) da Universidade Federal do Maranhão ( UFMA) e Cent ral Analíti ca da Unicam p.
4.1- MATERIAIS
Est a pesquisa envolveu a utilização de equipam ent os usuais em um t rat am ent o analítico de plant as arom át icas e em t est es de atividade m oluscicida e t oxicidade.
4.1.1- Moinho elétrico
Utilizou- se o m oinho elét rico Tecnal, m odelo TE–340 para a t rit uração da am ost ra da Pimenta dióica Lindl e um t rit urador para as am ost ras do Citrus Limon Linneo e Zingiber officinale Roscoe.
4.1.2- Extrator de Clevenger
Para a ext ração dos óleos essenciais foi utilizado um ext rat or de Clevenger de vidro, acoplado a um balão de fundo redondo com um a m ant a aquecedora com o fonte de calor.
4.1.3- Coletor dos moluscos
O colet or consist e de um a concha associada a um cabo de m adeira.
4.1.4- Reservatório dos moluscos
A arm azenagem dos m oluscos é feit a em aquários de vidro com água desclorada.
4.1.5- Expositor dos moluscos a luz
A exposição dos m oluscos é realizada em suport es m et álicos, com t rês lâm padas de 60 W.
4.1.6- Estereoscópio de análise
A análise é realizada em lupa STEMI SV6 m arca ZEI SS GERMANY.
4.1.7- Refratômetro
Utilizou- se um refrat ôm et ro de ABBE, m odelo 2 WAJ, para as m edidas de índice de refração.
4.1.8- Balança digital
As pesagens foram realizadas em balança digit al MARTE AL 500, com precisão de 10- 4 unidades.
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4.1.9- Picnômetro
Um frasco de vidro especialm ent e confeccionado e aferido para 1m L.
4.1.10- Espectrofotômetro de infravermelho
Utilizou- se um espect rofot ôm et ro I R PRESTI GE- 21, FOURI ER TRANSFORM I NFRARED ESPECTROPHOTOMETER SHI MADZU.
4.1.11- Cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas
Os óleos essenciais foram analisados em um equipam ent o GC/ EM, HP 5880, HEWLETT PACKARD.
4.2- METODOLOGIA EXPERIMENTAL
As m et odologias realizadas nos experim ent os dest e t rabalho são descrit os a seguir.
4.2.1- COLETA DAS AMOSTRAS
4.2.1.1- Folhas da planta: Pimenta dioica Lindl
As folhas foram colet adas na Cooperat iva Agrícola Mist a do Proj et o Onça LTDA, no m unicípio de Taperoá- BA, Brasil, em abril de 2009, regist rada nos arquivos bot ânicos do I nstit ut o Biodinâm ico( I BD) de Bot ucat u de acordo com cert ificado no CA021205, arm azenadas em recipient es plásticos e t ransport ados
para o Laborat ório de Físico Quím ica de Alim ent os do Pavilhão Tecnológico da Universidade Federal do Maranhão ( UFMA) , onde foram secas em t em perat ura am bient e, t rit uradas ( em pó) e
recolocadas no frasco para fut ura ext ração do óleo essencial.
4.2.1.2- Frutos da planta: Citrus limon Linneo
Os frut os do lim ão foram colet ados no bairro do Sá Viana, sit uado na região da periferia do m unicípio de São Luis- Ma, diret am ent e do pé de lim oeiro, sem uso de qualquer agrot óxico.
O galho e os frut os do lim oeiro foram identificados com o
Citrus limon Linneo, regist rado no Herbárium – Ático Seabra da Universidade Federal do Maranhão (UFMA) sob o núm ero 100379, levados ao Laborat ório de Físico- Quím ica de Alim ent os do Pavilhão Tecnológico da Universidade Federal do Maranhão ( UFMA) para retirar as cascas dos frut os, t rit urar e ext rair o óleo essencial.
4.2.1.3- Rizoma da planta: Zingiber Officinale Roscoe
Os rizom as de gengibre foram obtidos em superm ercado da rede varej ist a de São Luís- Ma, identificados com o zingiber officiale Roscoe, regist rado no Herbárium – Ático Seabra da Universidade Federal do Maranhão (UFMA) sob o núm ero 1678, levados ao Laborat ório de Físico- Quím ica de Alim ent os do Pavilhão Tecnológico da Universidade Federal do Maranhão ( UFMA) para t rit uração e ext ração do óleo essencial.
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sistem a de Clevenger de vidro acoplado a um balão de fundo redondo de 1000 m L, com um a m ant a aquecedora cont rolando- se a t em perat ura a 100 º C. Para a ext ração foram utilizados 30 gram as de cada am ost ra com 300 m L de água destilada, realizadas em t riplicat a e os óleos obt idos foram secos por m eio da percolação com Na2SO4, arm azenados em colet ores de vidro envolt o em papel alum ínio sob refrigeração, a fim de evit ar perdas de constit uint es voláteis.
4.2.2.1- Rendimento de extração do óleo essencial
O cálculo do rendim ent o da ext ração foi avaliado de duas form as, um a, baseado na relação m assa/ volum e, onde o volum e foi sendo observado no próprio sistem a de ext ração, sendo feit as seis ext rações nos tem pos 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; e 5,0 horas, e o m elhor t em po foi det erm inado em função do rendim ent o de cada óleo essencial. A out ra form a, expressa em percent agem , na relação m assa/ m assa pela m edida da densidade, observando o volum e m áxim o obtido de cada óleo por m assa ( g) dos veget ais em est udos, conform e fórm ula abaixo ( FARMACOPEI A BRASI LEI RA I V, 1996) .
( 1) Onde:
V= volum e t ot al de óleo ext raído ( m L) d= densidade do óleo ( g/ m L)
m = m assa do veget al ( g)
4.2.3- CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICAS DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
As propriedades físico- quím icas dos óleos essenciais % R = ( V.d/ m ) x 100
det erm inadas foram a densidade, solubilidade em et anol ( 90% v/ v) , índice de refração, cor e aparência.
4.2.3.1- Densidade
Det erm inou- se a densidade de cada óleo essencial utilizando um picnôm et ro de 1,0 m L, previam ente seco, t arado e aferido, onde se adicionaram as am ost ras à 25 oC, pesando- as em seguida ( I AL, 1985) .
4.2.3.2- Solubilidade em etanol (90%)
Para se det erm inar a solubilidade, foi colocado um volum e const ant e de cada óleo e adicionando volum es proporcionais da solução alcoólica previam ent e preparada a 90% ( v/ v) at é solubilização t ot al.
4.2.3.3- Índice de refração
A det erm inação do índice de refração foi realizada com auxilio de pipeta ―Pasteur‖ de vidro para adicionar as amostras dos óleos diret am ente sobre o prism a do refrat ôm et ro, a um a t em perat ura de 25 º C fazendo- se ent ão as leituras.
4.2.3.4- Cor e Aparência
A t écnica utilizada foi visual, onde, sob um fundo branco, se com parou a cor de cada óleo com cores conhecidas e para a
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4.2.4- ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA VIBRACIONAL NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO
Os espect ros na região do infraverm elho foram obtidos no equipam ent o m odelo I R PRESTI GE- 21, operando com resolução de 8.0 cm- 1 e int ervalo analisado foi de 400 a 4000 cm- 1. Todas as past ilhas foram preparadas m isturando- se um a quantidade de brom et o de pot ássio ( KBr) anidro com um a got a de cada óleo, essa m ist ura foi t rit urada e prensada a alt a pressão com auxilio de um a prensa hidráulica, para garantir que fique t ranslúcida, ou sej a, garant a a passagem da luz.
4.2.5- ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM)
Os constit uint es dos óleos essenciais foram identificados por crom at ografia gasosa acoplado à espect rom et ria de m assas ( CG- EM) na Cent ral Analítica do I nstitut o de Quím ica da Universidade Est adual de Cam pinas. Foi dissolvido 1,0 m g da am ost ra em 1000 µL de diclorom et ano ( pureza 99,9% ) . As condições de análise foram as seguintes:
Mét odo : Adam s.M; Volum e inj et ado: 0,3 µL;
Coluna : Capilar HP- 5MS ( 5% difenil, 95% dim etil polisiloxano ) ( Equivalente DB- 5MS ou CP- Sil 8CB LB/ MS) , nas dim ensões ( 30 m x 0,25 m m x 0,25 µm ) ;
Gás de arrast e : He (99,9995) ; 1,0 m L/ m in; I nj et or : 280 oC, m odo Split ( 1: 10) ;
Forno : 40 oC ( 5,0 m in.) at é 240 oC num a t axa de 4 oC .m in- 1, UFPB Tese de Doutorado – Rom er Pessôa Fernandes 41
de 240 oC at é 300 oC ( 7,5 m in) num a t axa de 8 oC.m in- 1 ) ; tT = 60,0 m in;
Det ect or : EM1; EI ( 70 eV) Modo varredura ( 0,5 seg/ scan) ,
Faixa de m assas: 40 – 500 daltons (uma) Linha t ransferência: 280 oC.
Filam ent o: desligado 0,0 a 4,0 m in
1Espect rôm et ro de m assas tipo quadrupolo linear.
Para a identificação dos com post os na am ost ra utilizou- se o program a AMDI S ( Aut om at ed Mass spect ral Deconvolution Mass & I dentification Syst em ) .
4.2.6- AMOSTRAGEM DOS CARAMUJOS
As am ost ras dos caram uj os da espécie Biomphalaria
glabrata foram capt urados nos períodos chuvosos de j aneiro a j unho dos anos de 2009 e 2010, nas áreas com baixo saneam ent o no bairro Sá Viana, São Luís-Ma, com utilização de EPI’s (equipamento de prot eção individual) .
A t écnica de colet a foi realizada de acordo com propost a de Brasil ( 2007) , efetuando um a varredura com um a concha nas áreas subm ersas e os caram uj os capt urados foram recolhidos em um recipient e de vidro com t am pa, com água do próprio criadouro. A busca dos m esm os foi realizada em diversos pont os de cada criadouro, a fim de obt er um a boa am ost ragem e depois levados para o NI BA ( Núcleo de I m unologia Básica e Aplicada) da UFMA, para post eriores análises.
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4.2.6.1- Análise para testar positividade dos caramujos
Os caram uj os foram m antidos em laborat ório por 30 dias sendo analisados a cada 07 dias, para confirm ação da ausência de infecção por Schistossoma mansoni. Para isso, foram colocados 05 caram uj os em recipient es de vidro t ransparent e com 25 m L de água desclorada, ou sej a, 5 m L/ caram uj o, expost o à luz (lam pâdas de 60 W) por um a hora com um a dist ância de 30 cm para estim ular a liberação das cercárias ( SMI THERS; TERRY, ( 1965) apud SOUZA, ( 1992)) e levados para serem analisados, at ravés de visualização com auxilio de um a lupa est ereoscópica ( 8x) , aqueles que est avam parasit ados ( positivos) eram etiquet ados e separados para fut ura análise individual e os que não apresent aram sinais de infecção pelo t rem at ódeo no período de 30 dias foram selecionados para o t est e de atividade m oluscicida.
4.2.6.2- Teste para atividade moluscicida
Para a avaliação da at ividade m oluscicida foi utilizada à t écnica preconizada pela Organização Mundial de Saúde ( WHO, 1983) , onde dois t estes foram efetuados em t riplicat a. No prim eiro, denom inado de t este pilot o, preparou- se um a solução de cada óleo em estudo num volum e de 500 m L na concent ração de 100 m g.L- 1 e 0,15 m L de Tween 80( tenso ativo) , onde foram colocados 10 caram uj os adult os, negativos para Schistossoma mansoni, obt endo- se no final um a proporção de 50 m L/ caram uj o e alim ent ando- os com alface hidropônico ad.libittum ( MALEK, 1995) . Os m esm os ficaram expost os na solução por 24 h, sob t em perat ura am biente, rem ovidos da solução, lavados por duas vezes com água desclorada, colocados
em um recipiente de vidro contendo 500 m L de água desclorada, alim ent ando- os com alface hidropônico e observados a cada 24 h, por 4 dias para avaliar a m ort alidade.
No segundo t est e, denom inado de concent ração let al ( CL) , foram preparadas soluções de cada óleo num volum e de 500 m L nas concent rações de 10, 25, 50 e 75 m g.L- 1 e 0,15 m L de Tween 80( t ensoativo) , utilizando- se a m esm a m et odologia do t est e pilot o.
Para o cont role negativo, utilizou- se t am bém dois t est es, no prim eiro colocou- se 500 m L de água desclorada e 10 caram uj os em um recipient e de vidro e no segundo 10 caram uj os im ersos em um a solução com 0,15 m L de Tween 80 em 500 m L de água destilada, alim ent ando am bos com alface hidropônico e procedendo- se a análise igualm ent e realizada nos t est es anteriores.
4.2.6.3- Análise dos dados estatísticos do tamanho da amostra
O program a est at ístico Bioestat 5.0 ( 2007) foi o utilizado para o cálculos est atísticos da am ost ragem de caram uj os
Biomphalaria glabrata e dos seguintes parâm et ros: diferença m ínim a ent re a m édia dos t rat am ent os igual 3, desvio padrão de 3,1, núm ero de t rat am ent os igual a 6 ( Cont role negat ivo, 100 , 75, 50, 25 e 10 m g.L- 1 ) , poder do t est e de 80% , nível de significância (α) de 5% , e adicionando m ais 10% de possíveis perdas, ent ão o t am anho am ost ral ficou em 30 caram uj os por t ratam ent os, t ot alizando 1 80 anim ais, assim em cada t rat am ent o deferiu- se grupos com dez caram uj os.
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um aquário cont endo solução salina ( 60 g de sal m arinho/ 1000 m L de água destilada) e sat uração de oxigênio, obt ido com auxílio de bom ba de ar. O aquário foi dividido em dois com part im ent os int erligados, perm anecendo os cist os em um dos com part im ent os, deixando o segundo com part im ent o sob ilum inação art ificial de um a lâm pada de 100 W. Após 24 h, os cist os eclodiram , as larvas m igraram para o com part im ent o ilum inado, por fot ot ropism o positivo. Est as foram t ransferidas para um aquário cont endo solução salina e m antidas em incubação por m ais 24 h, sob as m esm as condições de ilum inação e oxigenação ( Figura 4.1) . A m et odologia utilizada foi a recom endada por Meyer ( 1982) com m odificações.
Fonte: O a u t o r
Figura 4.1. Cultura de Artemia salina Leach, ( a) Filt ração da solução salina, ( b) solução salina sobre saturação de oxigênio, ( c) Aquário dividido em dois
com part im ent os ( cist os e ilum inação e ( d) Exposição os cist os eclodidos sob ilum inação art ificial de um a lâm pada de 100 W.
4.2.7.1- Análise da toxicidade
Para a avaliação da let alidade de Artemia salina Leach, foi preparada um a solução salina est oque de cada óleo essencial na concent ração de 10.000 m g.L- 1 e 0,02 m g de tween 80( t enso ativo) .
(a) (b)
(c) (d)
Aliquot as de 5, 50 e 500 µL dest a foram t ransferidas para recipientes e com plet ados com solução salina j á preparadas ant eriorm ent e até 5 m L, obt endo- se no final concent rações de 10, 100 e 1000 m g.L- 1, respect ivam ent e. Todos os ensaios foram realizados em t riplicat as, onde dez larvas na fase náuplio foram transferidas para cada um dos recipient es. Para o cont role do branco utilizou- se 5 m L da solução salina e para o cont role negativo 5 m L de um a solução 4 m g.L- 1 de Tween 80. Após 24 horas de exposição, realizou- se a cont agem das larvas vivas, considerando- se m ort as aquelas que não se m ovim ent aram durant e a observação e nem com a leve agit ação do frasco.
Adot ou- se o critério est abelecido por Dolabela ( 1997) para classificação da t oxicidade dos óleos essenciais, sendo considerado produt o alt am ent e t óxico quando CL50 ≤ 80 m g.L- 1, m oderadam ent e t óxico para 80 m g.L- 1 ≤ CL50 ≥ 250 m g.L- 1 e levem ent e t óxico ou at óxico quando CL50 ≥ 250 m g.L- 1.
4.2.8- ANÁLISE ESTATÍSTICA DA CONCENTRAÇÃO LETAL (CL50)
A análise est atística dos dados foi realizada de acordo com o m ét odo de REED- MUENCH (1938) , o qual part e do princípio de que um anim al que sobreviva a cert a dose, t am bém irá sobreviver em qualquer out ra dose m enor que aquela, consequent em ent e o anim al que m orrer com cert a dose, t am bém irá m orrer em doses m aiores que aquela. A part ir de um a t abela contendo os dados de m ort alidade para cada concent ração t est ada, é const ruído um gráfico onde se observa um a curva para o acúm ulo de anim ais m ort os em cada
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O pont o de int ercessão ent re as curvas é a Concent ração Let al 50% ( CL50) , pois nesse pont o o núm ero de anim ais sobrevivent es é igual ao núm ero de anim ais m ort os ( COLEGATE e MOLYNEUX, 1993) .
O intervalo de confiança foi calculado segundo o m ét odo de PI ZZI ( 1950) no qual se const rói um gráfico do percent ual de m ort os
versus logaritm o (log) da dose. A seguir det erm ina- se o valor de ―R., que é a diferença entre o log da dose que m ata 75% das larvas e o log da dose que m at a 25% das larvas. Calcula- se t am bem a variavel ―h. que consiste na m édia das diferenças dos valores de log das doses. Com esses dados det erm ina- se o log do erro padrão ( SE) , at ravés da seguint e fórm ula:
(2)
Os valores: 0,79 ( encont rado no dividendo) e 20 ( sit uado no divisor) do quocient e da radiação acim a se referem aos fat ores de conversão necessários para calcular o erro padrão est abelecido nas am ost ras. Finalm ent e, o valor do int ervalo de confiança é igual a 2x10SE.
( SE)2 = 0,79. h.[ R/ 20]
CAPITULO v
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