3. 1. Materiais e equipamentos
As pesagens foram realizadas em balança analítica de precisão (Marte, modelo: AY220, Brasil), com resolução de 0,0001 g e capacidade máxima de 210 g. Para o ajuste de pH foi utilizado um pHmetro digital (Instrutemp, ITMPA-210) equipado com eletrodo de vidro combinado de mesma fabricação. Para o preparo de diluições foram utilizadas micropipetas de capacidade variável (Gilson). Quando necessário, as amostras foram solubilizadas com auxílio de um banho ultrassônico Sanders Medical (modelo SoniClean 2PS). Para a obtenção de água ultrapura foi utilizado um purificador Heal Force (modelo NW).
Os espectros de absortividade molecular foram obtidos com um espectrofotômetro PG Instruments (modelo TV80+ UV/VIS) com cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico, com leituras no intervalo de 190 a 400 nm de comprimento de onda.
Foram utilizados dois equipamentos de CE. Estudos prévios de condições de separação por CE e algumas análises foram realizados em equipamento Agilent 3D CE G1600AX equipado com sistema de detecção UV Vis e software para aquisição e tratamento de dados (Agilent ChemStation versão B.04.03), pertencente ao laboratório de pesquisa da Universidade Estadual de Campinas – Campinas, SP. A maior parte das análises foi realizada com um equipamento Beckman Coulter Instruments, modelo P/ACE™ MDQ (Fullerton, CA, USA) equipado com sistema de detecção de arranjo de diodos (PDA) e software para aquisição e tratamento de dados (32 Karat TM v. 8.0), do laboratório didático da Universidade Federal do ABC - Santo André ,SP.
O método para a análise de ENL e HCTZ foi desenvolvido com base na literatura [39 - 44] e adequado para as nossas amostras. Foram utilizadas as seguintes condições de análise: potencial de separação de 25 kV, temperatura 25ºC, injeção hidrodinâmica com aplicação de 34,5 mbar de pressão por 5 segundos, capilar de sílica fundida com 50 μm de diâmetro interno e 40 cm de comprimento
total, 30 cm até o detector. Os eletroferogramas foram obtidos em 214 e 260 nm de comprimentos de onda.
3. 2. Reagentes e soluções
Todos os reagentes utilizados são de grau analítico, sem purificação prévia: hidróxido de sódio, ENL, HCTZ, cafeína e ácido salicílico (Sigma-Aldrich), tetraborato de sódio, ácido bórico e metanol (MeOH) (Labsynth). Todas as soluções foram preparadas em água ultrapura com resistividade de 18.2 MΩ.cm.
As soluções estoque dos padrões de ENL e HCTZ foram preparadas, separadamente, na concentração de 1,0 mg mL-1 ou, para a construção das curvas de calibração, em uma única solução, na concentração de 0,5 mg mL-1, sempre em MeOH, com dissolução assistida por banho de ultrassom por 30 segundos. Para a construção das curvas de calibração os padrões foram diluídos em eletrólito, utilizando micropipetas de volume variável e balões volumétricos. Além das soluções dos padrões foram utilizadas também as seguintes soluções:
Soluções estoque:
- Hidróxido de sódio 3,0, 1,0 e 0,10 mol L-1 - Cafeína, 10 mmol L-1.
- Ácido Salicílico 10 mmol L-1. - Ácido Bórico 100 mmol L-1.
As soluções estoque foram armazenadas em geladeira por até 5 dias.
Soluções preparadas diariamente:
- Maleato de enalapril, 1,0 mg mL-1 e 0,5 mg mL-1. - Hidroclorotiazida, 1,0 mg mL-1 e 0,5 mg mL-1. - Hidróxido de sódio (NaOH), 1mol L-1.
- Hidróxido de sódio (NaOH), 0,1mol L-1. - Cafeína 1 mmol L-1.
- Ácido Salicílico 1 mmol L-1.
- Tampão tetraborato de sódio 20 e 2,0 mmol L-1, pH 8,5. Preparadas a partir do ajuste de pH de uma solução de ácido bórico com NaOH 3,0 mol L-1.
3. 3. Critérios de escolha das amostras e descrição dos testes realizados
Neste trabalho, foram escolhidos 3 laboratórios industriais fabricantes de ENL e HCTZ em associação fixa: o laboratório referência, um laboratório fabricante de medicamentos genéricos e um laboratório fabricante de marca similar, sendo nomeados L1, L2 e L3, respectivamente. Essas informações constam na tabela 1, assim como a localização da aquisição desses medicamentos, preço e quantidade. Todas as amostras apresentaram em seu rótulo a dosagem de 10 mg e 25 mg para ENL e HCTZ, respectivamente.
Tabela 1. Formulações estudadas e respectivas identificações.
Fabricante/Laboratório Local da Aquisição Preço Quantidade Sigla
Laboratório Referência Santo André - SP R$ 28,00 30 cp L1
Laboratório Genérico Santo André - SP R$ 14,00 30 cp L2
Laboratório Similar Jundiaí - SP R$ 21,00 30 cp L3
Farmácia de Manipulação 1 Jundiaí - SP R$ 26,50 60 cáps F1
Farmácia de Manipulação 2 Santo André - SP (2x RS 39,00) R$ 78,00 2 formulações 60 cáps cada F2
Ainda foram escolhidas duas farmácias de manipulação para o presente estudo, sendo nomeadas F1, localizada na cidade de Jundiaí – SP, e F2, de Santo André - SP. As formulações foram obtidas mediante apresentação de receita médica, fornecidas para fins de pesquisa. Ambas foram manipuladas em quantidade para um tratamento de 60 dias. Essas informações e o preço das formulações constam na tabela 1.
As amostras da F1 foram produzidas associando ENL e HCTZ, na mesma dosagem dos laboratórios industriais estudados (ENL 10 mg e HCTZ 25 mg). Já as amostras obtidas da farmácia F2 não apresentaram os princípios ativos em associação, mas em formulações separadas, nas dosagens de 10 mg para o ENL e 12,5 mg para HCTZ.
Foram realizados os testes de identificação dos compostos por espectrofotometria de absorção molecular na região do UV, determinação de peso médio, determinação do teor do lote, teste de uniformidade de dosagem por CZE. As determinações de teor e uniformidade foram repetidas após 30 dias para
confirmação dos resultados e para avaliação da estabilidade das formulações em um período compatível com a duração da embalagem (normalmente 30 comprimidos para ingestão de uma dose diária).
3. 3. 1. Determinação de peso médio
Segundo a farmacopeia brasileira, a determinação de peso se aplica às formas farmacêuticas sólidas em dose unitária, como comprimidos, pastilhas, cápsulas duras e moles e supositórios, formas farmacêuticas sólidas acondicionadas em recipientes para dose unitária e a formas farmacêuticas sólidas e semissólidas acondicionadas em recipientes para doses múltiplas. A finalidade do teste é justamente verificar se as unidades de um mesmo lote apresentam uniformidade de peso [47].
Para determinar o peso individual, foram utilizados 20 comprimidos de ENL e HCTZ de um mesmo lote, os quais foram pesados individualmente em uma balança analítica. Em seguida, foram calculados o peso médio e a variação de peso de cada comprimido em relação ao peso médio. O procedimento foi realizado para cada um dos laboratórios industriais estudados. No caso das cápsulas, 20 delas foram pesadas antes e após remover o conteúdo de cada uma. O peso do conteúdo de cada cápsula foi determinado pela diferença de peso entre a cápsula cheia e vazia. Em seguida, foi determinado o peso médio do conteúdo das cápsulas, de cada formulação analisada, assim como a variação do peso de cada unidade em relação ao peso médio.
3. 3. 2. Identificação espectrofotométrica dos compostos ativos
Foram obtidos espectros de absorção molecular de padrão dos dois medicamentos em soluções distintas e nas amostras comerciais de ENL (10mg) e de HCTZ (25mg), na forma farmacêutica de comprimidos e também em cápsulas, sendo de ENL (10 mg) e HCTZ (12,5mg). Todas as amostras foram diluídas a 0,05 mg mL-1, em tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1, pH 8,5 e todas as leituras foram realizadas com cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico, no intervalo de 190 a 400 nm
3. 3. 2. Análises de teor, uniformidade de dosagem e estabilidade
Para cada laboratório, foi realizado o teste de uniformidade de dosagem (TU), avaliando-se 10 unidades de um mesmo lote de fabricação, na data de aquisição dos medicamentos, seguindo a metodologia determinada pela farmacopeia brasileira.
Cada comprimido (de L1, L2 e L3) foi dissolvido, sem pulverização prévia, diretamente em um balão volumétrico de 50 mL. Para auxiliar a desintegração dos comprimidos, 2 mL de água deionizada foram adicionados ao balão, ficando 2 minutos em banho ultrassônico. Após a desintegração total do comprimido, o balão foi avolumado com MeOH. A solução foi filtrada com uma seringa com capacidade de 3 mL e filtro PVDF 0,22 um (Millipore Millex-GV) para posterior injeção em triplicata.
No caso das cápsulas (de F1 e F2), após esvaziamento das cápsulas, em balões volumétricos de 50 mL, o conteúdo foi dissolvido em MeOH, seguido da filtração e injeção em triplicata para análise em CZE.
Como as amostras F2 não apresentaram os princípios ativos em associação, as análises foram feitas com a mistura do pó de uma cápsula de cada princípio ativo. O teor do lote foi considerado como sendo o valor médio do valor encontrado na respectiva análise de uniformidade. Já os testes de estabilidade (TE) foram realizados pela repetição do TU após um período de 30 dias utilizando os mesmos lotes de fabricação. Durante este período, todos os medicamentos foram armazenados conforme recomendações do fabricante: mantido na embalagem do produto, em temperatura ambiente (15 a 30°C), protegidos da luz e umidade.
3. 4. Aspectos gerais do método de eletroforese capilar usado
O condicionamento diário dos capilares foi realizado lavando primeiramente com água desionizada, por 3 minutos, seguido de 2 minutos com solução NaOH 1 mol L-1, 1 minuto com NaOH 0,1 mol L-1 e em seguida, com o eletrólito de corrida (tampão tetraborato de sódio, 20 mmol L-1) por 10 minutos. Entre as injeções foi realizada a lavagem do capilar da seguinte maneira: lavagem por 0,5 minuto de
água desionizada, 0,5 minuto de solução NaOH 0,1 mol L-1 e 1,5 minuto com o eletrólito de corrida.
Para o monitoramento do tempo de migração do EOF foi utilizada cafeína, cuja fórmula estrutural está representada na figura 8. A cafeína é uma substância neutra na faixa de pH utilizada nas separações por CE e apresenta absortividade molar adequada para monitoramento do EOF nos comprimentos de onda utilizados nas análises.
Figura 8. Fórmula estrutural da cafeína.
Para correção de erros relacionados à imprecisão do volume injetado, comum à técnica de CE [31, 45], foi utilizada padronização interna, com a escolha do ácido salicílico para essa finalidade. A fórmula estrutural do ácido salicílico está representada na figura 9. Assim, para a determinação de ENL e HCTZ, as áreas dos respectivos picos foram divididas pela área do pico do padrão interno.
As condições ideais para escolha da substância usada como padrão interno são: ser similar ao analito a ser quantificado; ter absorção de luz na mesma região de comprimento de onda do analito; ter tempo de migração próximo a este analito; não fazer parte da amostra; não reagir com este ou outro componente da matriz e não co-migrar com todas as demais substâncias presentes na amostra na separação [45].
Figura 9. Fórmula estrutural do ácido salicílico.
A utilização de padrão interno é muito útil em análises eletroforéticas, onde a quantidade de amostra analisada ou a resposta do equipamento variam ligeiramente entre as análises, e, principalmente, para a correção de erros de injeção. Essas variações podem ocorrer, por exemplo, por mudanças de temperatura, variando o volume de injeção da amostra devido à consequente alteração de viscosidade, o que pode alterar a resposta do detector. Porém, a resposta relativa do detector ao analito e ao padrão, normalmente é constante para inúmeras condições [35, 45].