Materiais e Equipamentos
Os materiais e equipamentos que foram necessários para realizar esta dissertação encontram-se disponíveis no Instituto de Química da UNICAMP (Quadro 1) e no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS).
QUADRO 1: Relação dos principais equipamentos e materiais utilizados na parte experimental.
Equipamentos/Materiais Marca Modelo
Cuba e aparatos para eletroforese: placas
de vidro, pente e espaçadores de Teflon Fanezze PD–244
Potenciômetro Digimed DM–20
Agitador por efeito vortex Thermolyne M-37600
Ultracentrífuga Revan 14000-D
Balança Analítica; precisão = 0,1mg Mettler AE-200 Forno de microondas, operando a 2450±13
MHz, com potência nominal de 1200 W e equipado com sensor de temperatura e
frascos de Teflon
Provecto DTG–100
Chapa de aquecimento Marconi MA-289 Destilador de ácido sub-ebulição Marconi MA-075 Analisador elementar (CHN) Perkin-Elmer PE-2400
Reagentes e Soluções
Todas as soluções utilizadas foram preparadas com reagentes de grau analítico e água de alta pureza (18,2 MΩ cm), purificada com sistema de filtração Milli-Q (Millipore).
Os reagentes empregados para a eletroforese de gel e mineralização das bandas de proteínas foram da J. T. Baker. O padrão protéico de pesos moleculares conhecidos empregado na SDS- PAGE foi da MBI Fermentas.
A vidraria utilizada foi aquela de uso comum a um laboratório de química analítica.
As soluções-estoque (1000 mg.L-1) para Ca, K e Na foram
preparadas a partir dos seguintes sais: CaCO3, KNO3 (Carlo Erba) e
NaCl (Synth). Para os metais Cu, Fe, Mg, Mn e Zn foram utilizadas
soluções estoques (1000 mg.L-1) comerciais (J. T. Baker), a mesma
concentração de solução estoque foi empregada para o ítrio (SPEX).
Todas estas soluções foram preparadas empregando HNO3 2% (v/v).
Para as determinações de Ca e Mg empregando FAAS, foi adicionado determinado volume de uma solução de La 10% (m/v), de modo que a concentração final de La foi de 0,1% (m/v). A solução 10 % (m/v) de
La foi preparada pesando-se 58,7 g de La2O3 e dissolvendo-se esta
massa em 150 mL de HCl (conc.). O volume final desta solução foi aferido para 500 mL com água destilada/deionizada.
Procedimento de Limpeza
A limpeza das vidrarias foi realizada em banho de HNO3 10%
(v/v) por aproximadamente 10 h, sendo, em seguida, enxaguadas várias vezes em água ultra-pura.
Amostras
Os calos nucelares de laranja Valência (Citrus sinensis L. Osbeck) foram obtidos de acordo com o procedimento descrito por Benedito et al. [47]. O meio de cultura utilizado para a multiplicação
e 0,5 g.L-1 de extrato de malte. Após a auto clavagem por 20 min, o
valor de pH do meio de cultura foi de 5,8. Este meio, também, apresenta em sua composição uma série de sais e compostos orgânicos, o que pode ser verificado no Quadro 2.
Como os calos apresentam uma grande variabilidade no tamanho e forma de seus agrupamentos celulares, foi necessário empregar um procedimento para a amostragem [49] com o intuito de minimizar a heterogeneidade nos experimentos. Neste, a amostra que está inserida numa placa de Petri, contendo o meio de cultura, foi divida em quatro partes. Conseqüentemente, foram coletadas quatro sub-amostras de ca. 75 mg por divisão, totalizando aproximadamente 300 mg. A Figura 1 ilustra uma das amostras de calos de Citrus.
As amostras de calos foram obtidas do Laboratório de Biotecnologia Vegetal, CENA-USP.
QUADRO 2: Composição do meio de cultura EME.
Constituintes Concentração (mg.L-1) Constituintes Concentração (mg.L-1)
Na2MoO4.2H2O 0,25 NH4NO3 1650 CuSO4.5H2O 0,025 KNO3 1900 CoCl2.6H2O 0,025 MgSO4.7H2O 370 Tiamina-HCl 10,0 KH2PO4 150 Piridoxina-HCl 10,0 K2HPO4 20 Ácido nicotínico 5,0 CaCl2.2H2O 440 Glicina 2,0 FeSO4.7H2O 27,8 Meso-Inositol 100 Na2EDTA 37,3 Ágar 8,0x103 H 3BO3 6,2 MnSO4.H2O 2,3 KI 0,83 ZnSO4.7H2O 8,6
FIGURA 1: Calos de Citrus (aumento de 8 x).
Extração das Proteínas
Para a extração das proteínas do calo de Citrus foi utilizada uma solução tampão (solução que é designada também de tampão de incubação ou tampão de amostra) [15] contendo, 60 µL de SDS 10% (m/v), 30 µL de glicerol (conc.), 15 µL de β-mercaptoetanol (conc.),
8 µL de bromofenol 0,05% (m/v), 38 µL de tris-HCl 0,5 mol.L-1, pH 6,8
e 150 µL de H2O. A proporção empregada do tampão e de massa de
calo foi de 1:1. Assim, adicionou-se a solução tampão ao calo, e este foi macerado com o auxílio de um almofariz e pistilo em banho de
gelo, para manter a temperatura em aproximadamente 0oC. Após
esta etapa, a amostra foi colocada em um frasco adequado (tipo eppendorf), este frasco foi tampado e agitado por efeito vortex durante 20 min. Finalizada a agitação, a amostra foi centrifugada a 8500 g durante 5 minutos. A solução sobrenadante foi recolhida e armazenada em frasco adequado. Esta foi aquecida em banho-maria
aquecimento na presença de β-mercaptoetanol e SDS foi necessário para a desnaturação das proteínas. Além disso, o β-mercaptoetanol atua como agente redutor, quebrando as ligações dissulfídricas presentes em grande parte das proteínas. Esta quebra torna-se necessária para facilitar o acesso do SDS às partes internas das proteínas, além de contribuir para a separação de cadeias polipeptídicas mantidas por esta ligação covalente [15, 16].
Para aplicação no gel, aguardou-se o resfriamento da mesma à temperatura ambiente. Vinte µL de amostra foram aplicados em cada divisão do gel. A Figura 2 mostra um resumo de todo o processo de preparo da amostra de calo de Citrus anterior à aplicação no gel.
0oC 300 mg + 300 µL tampão Tris- HCl pH 6,8 75 mg 8500 g (13000 rpm) 5 min 100oC 10 min Aplicação no gel Agitação por efeito vortex 20 min 75 mg 00ooCC 300 mg + 300 µL tampão Tris- HCl pH 6,8 75 mg 8500 g (13000 rpm) 5 min 8500 g (13000 rpm) 5 min 100oC 10 min100 oC 10 min100 oC 10 min Aplicação no gel Agitação por efeito vortex 20 min 75 mg
FIGURA 2: Esquema das etapas realizadas para a extração das proteínas de calo de Citrus.
Gel de Eletroforese
Os géis empregados foram compostos por duas partes denominadas por gel concentrador ou de empilhamento (gel superior, pH 6,8) e gel fracionador ou separador (gel inferior, pH 8,8) [21]. Para a composição destas duas partes, foi necessário o seguinte procedimento: duas placas de vidro foram justapostas, sendo
separadas por espaçadores (confeccionados em Teflon). Estes
espaçadores têm como função determinar a espessura do gel, assim, foram fixados com graxa de silicone nas laterais e na parte inferior de uma das placas. Finalizada a montagem da placas, foi feita a aplicação da solução do gel fracionador até a altura suficiente para o
encaixe do pente de Teflon somando mais uma distância de 1,5 cm.
Aplicou-se, aproximadamente, 3 mL de água para a formação de um filme líquido sobre a superfície do gel. Assim é evitado o contato do
mesmo com o O2 do ar que pode interferir na polimerização, e
também são eliminadas as freqüentes bolhas formadas durante a etapa de aplicação. O gel requer cerca de 40 min para polimerização. Com o gel fracionador já polimerizado, a água foi devidamente retirada, adicionou-se a solução do gel concentrador e um pente de
Teflon foi encaixado. Após a polimerização (aproximadamente 30
min), o pente foi cuidadosamente retirado. Assim, onde os dentes dos pentes estavam encaixados formaram-se pequenas cavidades, as quais foram usadas para a aplicação das alíquotas da solução contendo as proteínas extraídas. Para montagem do sistema de eletroforese, o espaçador inferior foi retirado, para que a solução tampão, previamente adicionada, do reservatório inferior entrasse
em contato com o gel. As placas foram fixadas na cuba com o auxílio de prendedores. Posteriormente a esta etapa, a amostra protéica foi aplicada no gel concentrador (mais poroso), cuja função é efetuar uma separação prévia das proteínas. A Figura 3 mostra um esquema do sistema eletroforético. Nos reservatórios da cuba foi utilizado o
tampão tris-Glicina (tris 0,25 mol.L-1 e glicina 1,92 mol.L-1) de pH 8,3.
As funções e as composições de cada solução utilizada no preparo dos géis podem ser visualizadas no Quadro 3.
QUADRO 3: Composição dos géis concentrador (superior) e fracionador (inferior). Gel concentrador 3,0% (m/v) pH 6,8 Gel fracionador 12,5% (m/v) pH 8,8 Solução Função Volume (mL) Volume (mL) Acrilamida (29,1% m/v) + Bis- acrilamida (0,9% m/v) Acrilamida– monomêro; Bis- acrilamida–agente de ligação cruzada 1,00 4,20 Solução tampão
Tris-HCl Eletrólitos do meio (Tris+, Cl-) (1,0 mol.L1,25; -1) (1,5 mol.L2,50; -1) SDS 10% (m/v) Normaliza a carga e a forma das proteínas 1,00
Persulfato de amônio 10% (m/v) Gerador de radicais livres 0,05 TEMED Catalisador 0,01 Água destilada/
deionizada solvente/diluição final ≈ 10 mL) 6,75 (volume
2,30 (volume final ≈ 10 mL)
As condições empregadas na corrida eletroforética foram: correntes e tensões (inicial e final) de 10 e 30 mA, 40 e 120 V, respectivamente. Durante a corrida, o sistema de eletroforese foi
mantido sob refrigeração (10-15 oC). As dimensões do gel foram de:
185 x 135 x 1,5, largura, altura e espessura (mm), respectivamente. O tempo total da corrida eletroforética foi de aproximadamente 10 h. O término da corrida foi indicado por uma linha frontal formada por um corante presente no tampão de amostra, o azul de bromofenol, esta linha migra à frente das proteínas. Assim, quando a linha está a uma distância de aproximadamente 0,5 cm anterior à extremidade final do gel fracionador, a fonte elétrica deve ser desligada.
Finalizada a corrida eletroforética, foi necessário revelar as proteínas. Desta forma o gel foi cuidadosamente retirado das placas de vidro e imerso numa solução composta por: 0,15 g de Comassie
Brilliant Blue G–250 (CBG–250), 90 mL de metanol, 30 mL de ácido
acético glacial (conc.) e 180 mL de água destilada/deionizada. O gel foi colocado em contato com esta solução por aproximadamente 12 horas. Após este tempo, todo o gel adquire uma coloração azul, assim é necessário remover o excesso de corante utilizando a mesma solução descrita anteriormente, porém, sem a adição do CBG–250. O processo de descoloração durou aproximadamente 10 horas. A troca de solução foi necessária até se verificar um contraste das bandas de proteínas com a transparência do gel. A coloração azul permanece apenas nas bandas de proteínas, porque esta é resultante da reação entre os grupamentos sulfônicos do CBG-250 com os grupamentos amina das proteínas [50].
Reservatórios Gel Concentrador (pH 6,8) Gel Fracionador (pH 8,8) Local onde é aplicada a amostra 5 cm - Catodo + Anodo Fio de Platina Fio de Platina Solução tampão Tris-glicina (pH 8,3) Solução tampão Tris-glicina (pH 8,3)
Estimativa do Peso Molecular das Proteínas
Para estimar o peso molecular das proteínas do calo de Citrus, separadas por SDS-PAGE, foi empregado um padrão de proteínas com pesos moleculares conhecidos. Este padrão também foi aquecido a
100oC, por 5 min e aplicado em uma das divisões do gel (Figura 3). O
Quadro 4 mostra as proteínas presentes no padrão e os seus respectivos pesos moleculares.
QUADRO 4: Padrões protéicos de diferentes pesos moleculares.
Proteína Peso Molecular (kDa) β-galactosidase 116 albumina de soro bovino 66,2
ovalbumina 45,0 lactato dehidrogenase 35,0
endonuclease restrição Bsp98I 25,0 β-lactoglobulina 18,4
lisozima 14,4
Assim, a estimativa dos pesos moleculares é realizada utilizando uma curva do logaritmo do peso molecular versus mobilidade relativa (Rf), após a separação das proteínas por SDS-PAGE [15, 16, 19]. Na Equação 1 pode ser verificado como foi realizado o cálculo para Rf.
frontal linha pela percorrida distância proteína pela percorrida distância Rf = Equação (1)
A partir desta curva, foi gerada uma equação, sendo possível estimar os pesos moleculares das bandas de proteínas do calo de
Mapeamento de espécies químicas presentes nas bandas de proteínas
As varreduras foram realizadas na linha de Fluorescência de Raios-X (XRF) do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) [51]. A fonte de radiação síncrotron desta linha foi direcionada por um dipolo magnético D09B (dispositivo que mantém o feixe de elétrons em uma trajetória circular) no qual o campo magnético é de 1,65 T. A energia do elétron no interior do anel de armazenagem é de 1,37 GeV que gera uma energia crítica do fóton de 2,08 keV. Um sistema de fendas, controlado por computador, foi utilizado para colimar o feixe branco, de forma a se obter um micro-feixe de 280 x 280 µm na estação experimental. Um filtro de selênio foi colocado entre a amostra e o micro-feixe, para reduzir a intensidade dos componentes de maior energia do espectro. Já, para coletar a fluorescência, bem como a radiação proveniente das varreduras das amostras, foi utilizado um detector de energia dispersiva de Si(Li).
Para o mapeamento, algumas bandas do gel foram cuidadosamente retiradas com o auxílio de um bisturi. As varreduras nestas bandas foram efetuadas de duas formas: (1) varredura em uma área de 1000 x 1000 µm, totalizando 9 pontos, sendo o tempo de medida de 100 segundos por ponto, e (2) varredura em uma única direção, totalizando 3 (branco) e 8 (bandas de proteínas) pontos, o tempo de medida por ponto foi de 500 s. A Figura 4 mostra um esquema dos procedimentos adotados.
280 µm
(b)
(a) 1000 µm
500 µm
FIGURA 4: Esquema das varreduras realizadas nas bandas do gel de poliacrilamida. O tempo de medida em cada região (círculos) foi de (a) 100 s/ponto e em (b) 500 s/ponto.
Na realização das varreduras, a amostra (banda de proteína separada por SDS-PAGE) foi fixada com fita adesiva em um porta– amostra confeccionado em alumínio. O porta–amostra estava posicionado sobre um sistema controlado por computador que
permitiu movimentos nas direções X, Y, Z, θz, e estava localizado a
45o da direção do feixe incidente. A Figura 5 mostra a configuração
Fita
adesiva Porta- amostras (Al) Peça do gel contendo banda protéica e- Detector Si/Li Sistema Colimador Anel de armazenamento de elétrons 90o 45o 45o Motor de passos x y z
FIGURA 5: Configuração do sistema empregado na µSR-XRF para o mapeamento de espécies químicas nas bandas de proteínas separadas por SDS-PAGE.
Mineralização dos géis de poliacrilamida contendo as bandas de proteínas
No procedimento para a mineralização deste tipo de amostra, foi necessário cortar cuidadosamente, com o auxílio de um bisturi, os géis que possuíam as bandas de proteínas. O mesmo processo foi realizado para o branco (que foi definido como uma região do gel, onde não havia banda protéica). As dimensões de cada banda foram de aproximadamente 5 a 7 mm de largura por 1 a 2 mm de altura. As massas destas variaram entre 10–80 mg.
Nas mineralizações, foi utilizado um forno de microondas tipo
cavidade, equipado com sensor de temperatura e frascos de Teflon;
operando a 2450±13 MHz, com potência nominal de 1200 W. Dois programas (compostos por três etapas) de mineralização foram
testados (Tabela 1). As proporções de HNO3/H2O2 empregadas foram
de 4:1 e de 5:1 mL. Neste caso, os programas foram executados uma e duas vezes para se comparar a eficácia das mineralizações.
TABELA 1: Programações utilizadas no forno de microondas tipo cavidade.
Programa 1 Programa 2 Etapa Tempo
(min) Potência (W) Tempo (min) Potência (W)
1 03 400 03 400 2 03 790 06 790
3 03 0 03 0
Após o término do programa utilizado, aguardou-se, por
condições de segurança, o resfriamento dos frascos de Teflon. Em
seguida, os frascos foram colocados em chapa de aquecimento (60 a
70 oC), para a evaporação lenta do excesso de ácido. Posteriormente,
os volumes finais das amostras foram ajustados para 5 mL com HNO3
0,2% (v/v) em balões volumétricos.
Determinação de Metais em Proteínas empregando SR-TXRF
As determinações foram realizadas na linha XRF do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) empregando um detector de raios- X de energia dispersiva com as mesmas características descritas para o mapeamento dos metais por µSR-XRF. Neste caso, foi utilizado um
feixe branco com 0,3 mm de largura e 2 mm de altura para excitação das amostras.
Para o preparo da amostra, foram utilizados 45 µL de cada amostra mineralizada (bandas de proteínas de diferentes pesos
moleculares), sendo adicionados 5 µL de solução de Y (100 mg.L-1)
que foi utilizado como padrão interno. Assim, a concentração final de
Y em cada amostra foi de 10,0 mg.L-1. Cinco µL das amostras foram
aplicados em discos de acrílico do tipo Perspex [52] (3 cm ∅), sendo este volume seco à temperatura ambiente em porta-amostra individual para proteção contra possíveis contaminações.
As amostras foram excitadas por 300 s e os espectros foram avaliados pelo programa computacional AXIL [53] para o cálculo das intensidades de raios-X.
Na Figura 6 pode ser verificada a configuração do sistema empregado para a SR-TXRF.
≈180o e- Sistema Colimador Anel de armazenamento de elétrons Motor de passos x y z Detector Si/Li Disco Perspex
Local onde as soluções das amostras mineralizadas foram depositadas
FIGURA 6: Configuração do sistema empregado na SR-TXRF para a determinação quantitativa das espécies químicas em bandas de proteínas mineralizadas.
Determinação de Metais em Proteínas empregando FAAS e FAES
Para a determinação das espécies químicas nas amostras mineralizadas foi utilizado um espectrômetro de absorção atômica, Perkin-Elmer AAnalyst 300, equipado com lâmpada de deutério para a correção de sinal de fundo. Nas determinações foram utilizadas lâmpadas de catodo oco (Perkin-Elmer) de Ca (λ=422,7 nm, abertura de fenda=0,7 nm) e Mg (λ = 285,2 nm, abertura de fenda=0,7 nm) como fontes primárias de radiação. O Na foi determinado por FAES e empregou-se o mesmo equipamento descrito anteriormente. Os sinais analíticos foram registrados de acordo com a absorbância (FAAS) ou
intensidade (FAES) média e coletados por um tempo de aproximadamente 5s. As demais condições analíticas empregadas foram aquelas recomendadas pelo fabricante do equipamento [54].