UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Mapeamento e Determinação de Espécies Químicas
ligadas às Proteínas de Calos de Citrus
Fabíola Manhas Verbi
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
Campinas-SP Dezembro/2003
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA UNICAMP
Verbi, Fabíola Manhas.
V581m Mapeamento e determinação de espécies químicas ligadas às proteínas de calos de Citrus / Fabíola Manhas Verbi. -- Campinas, SP: [s.n], 2003.
Orientador: Marco Aurélio Zezzi Arruda
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química. 1. Proteínas. 2. Metais. 3. Eletroforese de gel. 4. Fluorescência de raios-x. I. Arruda, Marco Aurélio
Zezzi. II. Universidade Estadual de Campinas. III. Título.
Dedico esta dissertação,
especialmente, aos meus pais Rocco e Waldete, meu irmão Rocco Jr. e meu grande amor Edenir, pelos momentos de incentivo e paciência
“Algo só é impossível até que alguém duvide e prove o contrário” (Albert Einstein)
Agradecimentos
À minha família pela motivação, confiança e ensinamento que fizeram parte da minha rotina em todos os dias dedicados a esta dissertação de mestrado.
Ao meu orientador Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda pela oportunidade e orientação.
Ao CNPq pela bolsa de pesquisa.
À Profa. Dra. Adriana Pinheiro Martinelli Rodriguez do Laboratório de
Biotecnologia Vegetal, Centro de Energia Nuclear na Agricultura– Universidade de São Paulo (CENA/USP) pela cessão das amostras de calo de Citrus.
À Sra. Sandra Cristina Capaldi Arruda pela ajuda inicial no preparo dos géis de eletroforese.
Ao Sr. Carlos Alberto Pérez pela ajuda nos experimentos realizados no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron e sugestões relevantes nos estudos empregando fluorescência de raios-X.
Aos Prof.(s) Dr.(s) Maria Izabel Maretti Silveira Bueno e Lauro Tatsuo Kubota pelas contribuições científicas concernentes a esta dissertação.
Aos funcionários, principalmente aos das oficinas de vidraria e marcenaria, pela confecção dos aparatos de eletroforese e especialmente, à D. Ana que sempre foi muito gentil e atenciosa comigo.
Curriculum Vitae
Dados Pessoais Fabíola Manhas Verbi
Nascimento: 28/12/1975 – São Paulo/SP - Brasil E-mail: fmverbi@uol.com.br
Formação Acadêmica 2001-2003
Mestrado em Química - área de concentração: Química Analítica Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas/SP, Brasil 1994-1999
Bacharelado em Química
Universidade Federal de São Carlos – UFSCar, São Carlos/SP, Brasil
Atuação Profissional
1. 08/2003 – 11/2003 IQ/UNICAMP, Campinas/SP
Estagiária da disciplina QA-216 (Química Analítica II), Programa Estágio Docente (PED)
2. 08/2001 – 12/2001 Governo do Estado de São Paulo, Mogi-Mirim/SP Professora Educação Básica I
3. 09/1999 – 03/2000 Resana Ltda., Mogi das Cruzes/SP
Estagiária em Pesquisa e Desenvolvimento, Laboratório de Síntese Aperfeiçoamento de produtos de linha, área de emulsões
4. 02/1995-08/1998 Laboratório Interdisciplinar de Eletroquímica e Cerâmica-LIEC, DQ/UFSCar Iniciação Científica Idiomas Inglês avançado; Italiano intermediário Prêmios 1996
Principais trabalhos apresentados em congressos
1. Verbi, F. M., Pérez, C. A., Arruda, S. C. C., Rodriguez, A. P. M., Arruda, M. A. Z. Mapping of metal-binding proteins combining gel electrophoresis and synchrotron radiation x-ray fluorescence, Colloquium Spectroscopicum Internationale XXXIII, Granada-Espanha, 2003. Colloquium Spectroscopicum Internationale XXXIII, p.68 (2003)
2. Verbi, F. M., Pérez, C. A., Arruda, M. A. Z. Mapeamento de metais em proteínas utilizando a técnica não-invasiva de fluorescência de raios-x com luz síncrotron, 26a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Poços de Caldas-MG/Brasil, 2003. Livro de resumos, QA107 (2003)
3. Verbi, F. M., Pérez, C. A., Arruda, M. A. Z. Emprego de microfluorescência de raios-x com luz síncrotron no mapeamento de metais em proteínas, 13a Reunião
Anual de Usuários-LNLS, Campinas-SP/Brasil, 2003. 13a Reunião Anual de
Usuários-LNLS, p.224 (2003)
4. Verbi, F. M., Nascimento, A. M. R., Longo, E. Efeito da adição de um novo dopante nas propriedades varistoras do sistema SnO2.CoO.Nb2O5, 42o Congresso
Brasileiro de Cerâmica e 4o Iberoamericano de Cerâmica, Vidros e Refratários, Poços de Caldas- MG/Brasil, 1998.
5. Verbi, F. M., Nascimento, A. M. R., Longo, E. Estudo das características elétricas de um novo sistema varistor SnO2.CoO.Ta2O5.Cr2O3, 41o Congresso Brasileiro de
Cerâmica e 2o Congresso de Cerâmica e Minerais Industriais do Mercosul, São
Paulo-SP/Brasil, 1997.
6. Verbi, F. M., Nascimento, A. M. R., Longo, E. Caracterização elétrica do sistema varistor SnO2.CoO.Nb2O5 dopado com Cr2O3, IV Congresso de Iniciação Científica
da UFSCar, São Carlos-SP/Brasil, 1996.
7. Verbi, F. M., Nascimento, A. M. R., Longo, E. Influência do Cr2O3 nas
propriedades elétricas do sistema varistor SnO2.CoO.Nb2O5, 19a Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, Poços de Caldas-MG/Brasil, 1996. Publicações
1. Mapping of metal binding proteins employing X-ray microfluorescence with synchrotron radiation, Campinas: Activity Report LNLS, 2002, p. 83-84.
2. Metal-binding proteins mapping and determination by combining gel electrophoresis, synchrotron radiation X-ray fluorescence and flame atomic spectrometry, submetido em janeiro de 2004 para publicação em revista internacional.
Resumo
Autora: Fabíola Manhas Verbi
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
Mapeamento e determinação de espécies químicas ligadas às proteínas de calos de Citrus
Neste trabalho de dissertação foram mapeadas bandas de proteínas provenientes de calos embriogênicos in vitro (Citrus
sinensis L. Osbeck). Estas bandas de proteínas foram, previamente,
separadas utilizando eletroforese de gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio. Para efetuar este mapeamento foi empregada a micro fluorescência de raios-X com radiação síncrotron. Com os resultados obtidos foi verificada a presença de Fe nas bandas de proteínas com pesos moleculares de 81, 62, 55, 36, 32 e 14 kDa. Já, para a banda de 53 kDa foram obtidos resultados mais promissores. Além de Fe, o mapeamento indicou a presença de outras espécies químicas, tais como, Ca, Cu, K, e Zn. A quantificação de metais ligados às proteínas foi realizada empregando fluorescência de raios-X por reflexão total excitada com radiação síncrotron (determinação de Ca, Cu, Fe, K e Zn), bem como espectrometria de absorção atômica (Mg e comparação dos resultados para Ca) e espectrometria de emissão atômica com chama (Na). Nestas determinações foram empregadas bandas de proteínas mineralizadas e o Fe foi determinado nas proteínas de 81 e 14 kDa, (105 e 21,8
Cu, K, Mg, Na e Zn nas faixas de concentrações de 42,4 a 283; 0,91 a
15,9; 2,47 a 96,8; 2,01 a 4,59; 29,3 a 305 e 3,39 a 29,7 µg.g-1,
Abstract
Author: Fabíola Manhas Verbi
Adviser: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
Mapping and determination of chemical species binding to Citrus callus proteins
In the present work, protein bands from in vitro embriogenic callus (Citrus sinensis L. Osbeck) were mapped using micro synchrotron radiation X-ray fluorescence (µSR-XRF) after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) separation. According to the analysis of the protein bands, it is possible to observe that both 81 and 14 kDa proteins present different Fe signal intensity at different mapped positions. The analysis of 53 kDa-protein, showed even more interesting results. Besides Fe, the mapping indicates the presence of Ca, Cu, K and Zn. Metal-binding protein quantification was done by synchrotron radiation total reflection X-ray fluorescence (Ca, Cu, Fe, K and Zn), flame atomic absorption spectrometry (Ca and Mg) and flame atomic emission spectrometry (Na). In the mineralised protein bands of 81
and 14-kDa-band only Fe was determined (105 and 21.8 µg g-1). For
those protein bands (86-14 kDa), Ca, Cu, K, Mg, Na and Zn were determined in a wide concentration range, 42.4 to 283; 0,91 to 15.9;
2.47 to 96.8; 2.01 to 4.59; 29.3 to 305 and 3.39 to 29.7 µg g-1,
Índice
LISTA DE QUADROS ...XIV
LISTA DE TABELAS ...XV
LISTA DE FIGURAS ...XVI
INTRODUÇÃO ...1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...5
ELETROFORESE DE GEL DE POLIACRILAMIDA... 7
TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS EMPREGADAS PARA MAPEAMENTO E QUANTIFICAÇÃO DE METAIS EM PROTEÍNAS... 9
FLUORESCÊNCIA DE RAIOS-X COM RADIAÇÃO SÍNCROTRON...11
Microfluorescência de Raios-X com Radiação Síncrotron...14
Fluorescência de raios-x por reflexão total excitada com radiação síncrotron...15 CALOS...16 PARTE EXPERIMENTAL ... 19 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ...21 PROCEDIMENTO DE LIMPEZA...22 AMOSTRAS...22
EXTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS...24
GEL DE ELETROFORESE...26
ESTIMATIVA DO PESO MOLECULAR DAS PROTEÍNAS ...30
MAPEAMENTO DE ESPÉCIES QUÍMICAS PRESENTES NAS BANDAS DE PROTEÍNAS...31
MINERALIZAÇÃO DOS GÉIS DE POLIACRILAMIDA CONTENDO AS BANDAS DE PROTEÍNAS33 DETERMINAÇÃO DE METAIS EM PROTEÍNAS EMPREGANDO SR-TXRF ...34
RESULTADOS E DISCUSSÃO... 39
GEL DE ELETROFORESE...41
MAPEAMENTO DE ESPÉCIES QUÍMICAS PRESENTES NAS BANDAS DE PROTEÍNAS...43
MINERALIZAÇÃO DOS GÉIS DE POLIACRILAMIDA CONTENDO AS BANDAS DE PROTEÍNAS52 DETERMINAÇÃO DE METAIS EM PROTEÍNAS EMPREGANDO SR-TXRF ...53
DETERMINAÇÃO DE METAIS EM PROTEÍNAS EMPREGANDO FAAS E FAES...60
CONCLUSÕES ... 65
Lista de Quadros
QUADRO 1: Relação dos principais equipamentos e materiais
utilizados na parte experimental. ...21
QUADRO 2: Composição do meio de cultura EME. ...23 QUADRO 3: Composição dos géis concentrador (superior) e
fracionador (inferior). ...27
Lista de Tabelas
TABELA 1: Programações utilizadas no forno de microondas tipo
cavidade. ...34
TABELA 2: Características analíticas para SR–TXRF...55 TABELA 3: Resultados obtidos (em µg.g-1) empregando SR-TXRF para os metais ligados às proteínas; (n=3). *< LD...56
TABELA 4: Características analíticas para as determinações
empregando FAAS e FAES. ...61
TABELA 5: Resultados obtidos (em µg.g-1) empregando FAAS e FAES para os metais ligados às proteínas; (n=3). *<LD, **FAES...61
Lista de Figuras
FIGURA 1: Calos de Citrus (aumento de 8 x). ...24 FIGURA 2: Esquema das etapas realizadas para a extração das
proteínas de calo de Citrus. ...25
FIGURA 3: Esquema de um sistema de eletroforese descontínua,
utilizado na separação das proteínas...29
FIGURA 4: Esquema das varreduras realizadas nas bandas do gel de
poliacrilamida. O tempo de medida em cada região (círculos) foi de
(a) 100 s/ponto e em (b) 500 s/ponto...32 FIGURA 5: Configuração do sistema empregado na µSR-XRF para o
mapeamento de espécies químicas nas bandas de proteínas separadas por SDS-PAGE...33
FIGURA 6: Configuração do sistema empregado na SR-TXRF para a
determinação quantitativa das espécies químicas em bandas de proteínas mineralizadas. ...36
FIGURA 7: Imagem de um gel obtido por SDS-PAGE para amostra de
calo de Citrus. Os números à direita representam os pesos moleculares já conhecidos do padrão de proteínas e P. M. corresponde ao peso molecular (kDa). ...41
FIGURA 8: Curva obtida para os padrões de pesos moleculares
protéicos conhecidos e a respectiva equação gerada...42
FIGURA 9: Gráficos de contagens obtidos com o emprego da µSR-XRF
para (a) branco e (b) banda de proteína de 53 kDa. As energias, a seguir, se relacionam com os elementos mostrados no gráfico: (Cl) 2,622; (Ar) 2,957; (K) 3,313; (Ca) 3,691; (Ti) 4,510; (Fe) 6,403; (Cu) 8,046; (Zn-Kα) 8,637 e (Zn-Kβ) 9,570 keV. ...44
FIGURA 10: Gráfico representando as varreduras do branco. Onde I.
F. corresponde à intensidade de fluorescência (unidades arbitrárias). ...45
FIGURA 11: Gráfico representando as regiões mapeadas das bandas
de proteínas com 53 kDa e as espécies químicas encontradas. ...47
FIGURA 12-Parte 1: Gráficos das varreduras realizadas para o Fe nas
bandas de proteínas, (a) 81 kDa e (b) 62 kDa. Onde P. V. e P. H. correspondem às posições vertical e horizontal, respectivamente e I. F. é a intensidade de fluorescência (unidades arbitrárias). ...49
FIGURA 12-Parte 2: Gráficos das varreduras realizadas para o Fe nas
bandas de proteínas, (c) 55 kDa e (d) 36 kDa. ...50
FIGURA 12-Parte 3: Gráficos das varreduras realizadas para o Fe nas
bandas de proteínas, (e) 32 kDa e (f) 14 kDa. ...51
FIGURA 13: Gráficos de contagens obtidos com o emprego da
SR-TXRF para (a) branco e (b) banda de proteína de 32 kDa. As energias são: (Y-Kα) 14,956 e (Y-Kβ) 16,735 keV. Para as demais energias das outras espécies químicas verificar Figura 9. ...54
FIGURA 14: Gráficos de distribuição das espécies químicas, em
relação às bandas protéicas. Os valores apresentados acima de cada coluna correspondem aos pesos moleculares das proteínas em kDa. 56
FIGURA 15: Comparação dos resultados obtidos para Ca empregando
SR-TXRF e FAAS. Os números apresentados juntos aos círculos correspondem aos pesos moleculares das proteínas em kDa. ...62
A determinação de espécies químicas ligadas às proteínas é uma informação fundamental para um melhor entendimento das estruturas e funções destas macromoléculas biológicas. Dentre as espécies químicas, os íons metálicos despertam um interesse maior, pois podem exercer seus efeitos como uma parte inerente à atividade central das proteínas, definindo, em muitos casos, a função destas [1, 2].
Desta forma, é de evidente importância o entendimento dos mecanismos relacionados à interação metal-proteína. Na literatura, podem ser encontrados alguns estudos sobre esta interação e a influência da composição mineral (macro e micronutrientes) em processos bioquímicos, como no caso das plantas. Dentre estes, pode ser citada a revisão de Fox e Guerinot [3]. Os autores descreveram diversas informações relacionadas com o transporte de cátions (Ca, Cu, Fe, K, Mn e Zn) em plantas.
Entre os metais responsáveis por processos bioquímicos e fisiológicos em plantas, o cálcio é um dos mais importantes por atuar como um agente sinalizador em processos bioquímicos, tais como, crescimento, diferenciação celular e expressão genética em plantas [4, 5]. Devido às suas ligações químicas com a calmodulina e outras proteínas, o cálcio atua diretamente em vários processos fisiológicos [6-8]. O ferro também participa em tais processos como sinalizador no metabolismo de plantas [9].
O estudo dos processos bioquímicos, fisiológicos, entre outros, em plantas é de interesse para a biotecnologia vegetal. Esta área emprega, principalmente, a propagação in vitro de plantas para estes
estudos [10]. No entanto, na literatura, são poucos os trabalhos que apresentam resultados significativos quanto à localização e quantificação de metais em proteínas que participam destes processos.
Assim, estudos científicos multidisciplinares podem viabilizar a possibilidade de se obter informações relevantes a respeito da ligação metal-proteína. Além disso, estas informações poderiam ser empregadas como uma ferramenta para se entender problemas atuais, como: desenvolvimento de plantas geneticamente melhoradas, solos e/ou plantas contaminados com metais tóxicos, mutações genéticas em plantas e seres vivos em geral e doenças como mal de Alzheimer e câncer, entre tantas outras possibilidades [11-14].
Diante destas perspectivas apresentadas e com o intuito de uma contribuição analítica, o objetivo da presente dissertação foi o estabelecimento de uma metodologia analítica que possibilite o mapeamento de espécies químicas ligadas a proteínas de material biológico (calo de Citrus), bem como a determinação destas espécies (macro e micro constituintes).
Eletroforese de gel de poliacrilamida
Eletroforese é um processo de separação relacionado à migração de partículas carregadas em um determinado meio, sob a influência de uma diferença de potencial [15-17].
Alguns exemplos das variações da técnica de eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE, do inglês, polyacrylamide gel
electrophoresis) mais empregadas são: eletroforese de gel de
poliacrilamida descontínua (DISC-PAGE, do inglês, discontinuous
polyacrilamide gel electrophoresis), eletroforese de gel de
poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE, do inglês,
sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis),
eletroforese em gradiente de gel (PGE, do inglês, pore gradient
electrophoresis), eletroforese por focalização isoelétrica (IEF, do
inglês, isoelectric focusing) e eletroforese de gel de poliacrilamida bidimensional (2D PAGE, do inglês, two-dimensional gel
electrophoresis) [18]. Na presente revisão, será dada ênfase para a
SDS-PAGE.
A técnica SDS-PAGE foi estabelecida para a estimativa de pesos moleculares em proteínas, devido à relativa facilidade com a qual pode ser empregada [19, 20]. O SDS é um tensoativo aniônico que atua se ligando às partes hidrofóbicas das proteínas, sendo que a relação entre o SDS e a proteína é de 1,4 g de SDS/g de proteína. Esta combinação promove a uniformidade das cargas e forma das proteínas, assim, a distinção entre estas está relacionada apenas com os seus pesos moleculares. De uma forma mais específica, este processo ocorre da seguinte forma: os complexos polipeptídeos-SDS
formados possuem densidades de carga, essencialmente iguais (cargas negativas do SDS), e a migração destes complexos nos géis de poliacrilamida ocorre conforme os seus raios moleculares efetivos, que são aproximadamente iguais aos seus pesos moleculares. Este efeito é chamado de peneiramento molecular [16].
O sistema descontínuo descrito, primeiramente, por Laemmli [21] é o mais usado. Este sistema é definido como descontínuo devido a três características diferenciadas: a porosidade dos géis, a composição química e o pH das soluções-tampão dos géis e reservatórios (parte anódica e catódica). No caso dos géis, um deles é chamado de gel concentrador [3-5% de acrilamida (m/v)], de poros mais largos e o outro de gel fracionador [5-20% de acrilamida (m/v)], de poros menores que o anterior. O pH da solução-tampão utilizada no gel fracionador deve ser, no mínimo, duas unidades acima daquela do gel concentrador [15].
Para a eletroforese, a amostra protéica é aplicada no gel concentrador, cuja função é efetuar uma prévia separação das proteínas. Isto ocorre com a organização das bandas protéicas em discos diminutos, umas sobre as outras, em ordem decrescente de suas mobilidades líquidas. Assim, quando as proteínas chegam até o gel fracionador estas já estão separadas, apenas tendo suas resoluções aumentadas. As mobilidades das proteínas previamente separadas no gel concentrador são ampliadas, devido ao deslocamento para um meio com pH superior àquele do gel concentrador. As proteínas de maiores pesos moleculares apresentam uma mobilidade menor [16].
A simplicidade relativa e a alta resolução são características da SDS-PAGE, além da possibilidade do emprego de amostras diluídas com quantidades na ordem de microgramas de proteínas [18]. A limitação desta técnica desnaturante é que há possibilidade das proteínas não interagirem com a quantidade adequada de SDS (1,4 g de SDS/g de proteína) [15].
Técnicas espectroscópicas empregadas para mapeamento e quantificação de metais em proteínas
Na literatura, são encontrados alguns trabalhos relacionados com a determinação de metais em proteínas. Como exemplos, Szökefalvi-Nagy et al. [22] descrevem um método de localização in
situ de Fe em bandas de proteínas especiais contendo ferro e enxofre
(HiPIP, do inglês, high-potential iron-sulfur protein). O peso molecular destas proteínas é de 10 kDa e as mesmas foram separadas por SDS-PAGE. A HiPIP é importante para, por exemplo, a transferência de elétrons no processo de fotosíntese e fixação de nitrogênio. Os autores empregaram a espectroscopia com emissão de partícula induzida de raios-X (PIXE, do inglês, particle induced X–ray
emission). As bandas de proteínas contendo uma concentração de
HiPIP menor que 1 µg foram localizadas com a detecção do Fe presente nas mesmas. Segundo, os autores, a localização do Fe neste tipo de proteína pode ser uma grande fonte de informações a respeito da funcionalidade e estrutura destas macromoléculas. Seguindo esta linha de pesquisa, o mesmo grupo de trabalho
empregou o método comentado anteriormente para localizar Fe e Ni na bactéria Thiocapsa roseopersicina [23]. Os autores concluíram que o Fe estava ligado com subunidades de maior peso molecular (64 kDa). Já, o Ni estava ligado a subunidades menores (34 kDa).
Strivay et al. [24] comprovaram, também, a viabilidade de se quantificar metais em bandas de proteínas obtidas por SDS-PAGE empregando PIXE. No entanto, concluíram que devido ao superaquecimento do gel houve perda significativa deste, durante o bombardeamento com o feixe de prótons.
Chéry et al. [25] apresentaram um método de quantificação de selênio ligado a proteínas de leveduras. As proteínas foram previamente separadas por SDS-PAGE, sendo realizada, em cada banda, a determinação de Se por vaporização eletrotérmica com espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ETV-ICP-MS, do inglês, electrothermal vaporization inductively coupled
plasma mass spectrometry). O limite de detecção foi de 50 ng.mL-1
de Se por banda.
No estudo apresentado por Neilsen et al. [26] foi empregada a espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado e as amostras foram introduzidas com o auxílio da ablação a laser (LA-ICP-MS, do inglês, laser ablation inductively coupled plasma-mass
spectrometry) combinada a eletroforese. Neste trabalho foram
utilizados géis de agarose, (em uma e duas dimensões) para a identificação e quantificação de Co ligado a proteínas em amostras de sangue humano. As amostras de sangue empregadas foram
sinais analíticos suficientemente elevados para ser realizada a ablação a laser dos géis. A superfície dos géis foi mapeada e os autores obtiveram resultados interessantes quanto à distribuição de Co ligado a proteínas deste tipo de amostra, conseguindo detectar
proteínas específicas ligadas ao Co, como exemplo, a β1-lipoproteína.
Chen et al. [27] apresentaram um estudo sobre a localização e quantificação de Se em proteínas de fígado humano. As proteínas foram previamente separadas por SDS-PAGE e para a detecção foi empregada a técnica de espectrometria por fluorescência atômica com geração de hidretos (HG-AFS, do inglês, hydride generation
atomic fluorescence spectrometry). Os autores conseguiram
encontrar 24 tipos de proteínas ligadas ao Se nas frações subcelulares de fígado humano saudável. Os pesos moleculares destas proteínas variaram de 20-30 kDa e 50-80 kDa. Sendo que as maiores concentrações de Se foram encontradas para proteínas de 61 e 21 kDa, as quais, segundo os autores, foram identificadas como, a seleno-proteína P e a peroxidase glutiona, respectivamente.
Fluorescência de Raios-X com Radiação Síncrotron
A radiação síncrotron é definida como a radiação eletromagnética emitida por elétrons relativísticos (elétrons com
velocidade próxima a da luz, 3,00 x 105 Km.s-1). Assim, quando um
campo magnético é atravessado por elétrons relativísticos ocorre o fenômeno de radiação síncrotron, ou seja, os elétrons começam a espiralar no campo magnético e passam a emitir energia nos comprimentos de onda da região do infravermelho até os raios-X
duros (10-3 a 10-10 m) que corresponde às freqüências de 3x105 a
3x1012 MHz [28].
As propriedades mais importantes da radiação síncrotron são provenientes de brilho (Intensidade/Área) intenso do feixe de elétrons, colimação alta, abrange uma ampla faixa do espectro de energia e apresenta polarização variável (a radiação é linearmente polarizada no plano de órbita do elétron e também, elipticamente acima e abaixo deste plano) [28, 29]. Os anéis de armazenamento de última geração estão equipados com dispositivos chamados de
wigglers ou undulators (estes são empregados para produzir fluxos
contínuos de raios-X mais intensos [30]). Estes fatores permitem
oferecer um feixe de elétrons com um brilho ca. 1012 vezes mais
intenso do que as fontes de equipamentos convencionais de raios-X [29].
O emprego da radiação síncrotron foi consolidado na década de oitenta com a construção expressiva de anéis de armazenamento destinados à pesquisa (Laboratórios de Radiação Síncrotron). Sendo que o seu auge foi alcançado na década de noventa com equipamentos mais avançados [29].
A tendência na literatura quanto ao emprego da espectrometria de raios-X (XRS, do inglês, X-ray spectrometry), no período de 1990 a 2000, foi avaliada na revisão de Injuk et al. [31]. Segundo os autores, nas áreas, industrial, biológica e ambiental houve um aumento significativo nos estudos. Ainda nesta revisão, foi comentado que as aplicações empregando a técnica fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (SR-XRF, do inglês, synchrotron radiation X-ray
Uma aplicação interessante da SR-XRF foi estudada por Geraki
et al. [32]. Os autores determinaram Cu, Fe e Zn em tecido mamário
lesado com tumores cancerígenos. Neste estudo houve um interesse específico na investigação de reações enzimáticas oxidativas envolvendo Cu e Zn. No caso do Fe, variações na concentração desta espécie química podem estar associadas com vascularidade e aumento do fornecimento de sangue para o crescimento do tumor. Com o emprego da SR-XRF para este tipo de amostra (tecido
mamário) foi alcançado um limite de detecção inferior a 1 µg.g-1 para
todos os metais. Os autores concluíram que as principais vantagens em se empregar esta técnica foram a manutenção da integridade da amostra e não houve necessidade em se realizar um procedimento de preparo da mesma.
Outro emprego da SR-XRF é a possibilidade de estudar a distribuição e/ou mapeamento de espécies químicas, além da determinação semi-quantitativa em vários tipos de amostras [30], como pode ser verificado no estudo de Gao et al. [33]. No método proposto foram detectados Cu, Fe e Zn por SR-XRF, em bandas protéicas de citosol de fígado humano. Estas bandas protéicas foram previamente separadas por SDS-PAGE. Segundo os autores, o emprego da técnica SR-XRF para a detecção de metais em bandas de proteínas foi eficiente para a identificação e localização das espécies químicas de interesse em amostras biológicas. Além disso, este estudo tornou possível comparar a distribuição de metalo-proteínas em tecidos
As principais vantagens apresentadas pela fluorescência de raios-X são: não é necessário, em muitos casos, realizar um pré-tratamento da amostra, trata-se de uma técnica não-destrutiva, apresenta boa sensibilidade e é multi-elementar [34].
Microfluorescência de Raios-X com Radiação Síncrotron
A microfluorescência de raios-x com radiação síncrotron (µSR-XRF, do inglês, micro synchrotron radiation X-ray fluorescence) começou a ser empregada aproximadamente nos anos 90. Nos dias de hoje, já pode ser considerada uma das técnicas mais eficientes que utiliza micro-sonda para análise inorgânica de vários tipos de amostras. Além de ser possível sua utilização à pressão ambiente, em contraste com outras técnicas como PIXE [31] ou microscopia de varredura eletrônica (SEM, do inglês, scanning eletron microscopy) [35].
O progresso da µSR-XRF está ligado ao desenvolvimento significativo na instrumentação, tais como, capilares com lentes de raios-X, tubos de raios-X com micro-foco resfriados a ar. Além disso, estão disponíveis sistemas de detector compactos, com boa resolução (ajustado para altas contagens) e que não exigem, por um tempo adicional, resfriamento com nitrogênio líquido [31, 36].
Os avanços mais recentes ligados a esta técnica foram quanto à otimização do sistema ótico e ao tamanho cada vez menor do feixe, abaixo de 5 µm [31].
Fluorescência de raios-x por reflexão total excitada com radiação síncrotron
A radiação síncrotron combinada com a técnica de fluorescência de raios-x por reflexão total (TXRF, do inglês, total reflection X-ray
fluorescence) proporcionou um aumento da ordem de 8-12 vezes no
brilho do feixe de elétrons comparando-se com tubos de raios-X convencionais, além de reduzir o limite de detecção da TXRF [31].
O efeito de reflexão total é aplicado para minimizar a intensidade da radiação de fundo e intensificar o sinal de fluorescência. A TXRF é uma técnica de energia dispersiva, sendo a excitação da amostra efetuada pela incidência de um feixe com ângulo de aproximadamente 1 mrad no refletor (suporte de quartzo ou acrílico, por exemplo) da amostra. A amostra é depositada e evaporada, geralmente sobre o refletor para formar um filme muito fino (da ordem de alguns nanômetros de espessura). A radiação de fundo baixa resulta, principalmente, da menor profundidade de penetração com ângulos inferiores ao ângulo crítico de reflexão total. Finalmente, a distância pequena entre a amostra e o detector, de poucos milímetros apenas, resulta em um ângulo grande obtendo, assim, a detecção eficiente do sinal de fluorescência proveniente da amostra [37-39].
O emprego da fluorescência de raios-x por reflexão total excitada com radiação síncrotron (SR-TXRF, do inglês, total
reflection X-ray fluorescence analysis excited with synchrotron radiation) está ligado a várias áreas, como, ambiental, médica e
em baixas concentrações, níveis de ng.g-1 ou pg.g-1, alcançando até
fg.g-1 [38].
A aplicabilidade da SR-TXRF na determinação de espécies químicas em células biológicas foi estudada por Yuying H. et al. [40]. Neste estudo, foram determinadas espécies químicas presentes em grupos de células de intestino de ratos brancos e também, em células individuais. Com esta técnica foi possível, para os autores, realizar estudos preliminares relacionados com as variações de algumas espécies químicas em células cancerígenas pulmonares e cervicais, antes e após a apoptose (apoptose é o processo programado de morte celular). As células cancerígenas se multiplicam desordenadamente, e assim o processo de apoptose está defeituoso [41]. Os autores concluíram que estes estudos preliminares empregando a SR-TXRF abrem a possibilidade de se ter uma técnica eficaz para a análise de espécies químicas em células biológicas, pois foi verificado uma variação considerável para Cu, Fe e Zn em células cancerígenas (antes e após a apoptose).
Calos
O calo é uma massa de células vegetais que está em contínua proliferação celular, podendo ser compacto, friável, esbranquiçado ou amarelado. As culturas de calos são realizadas in vitro, sob condições assépticas, sendo que estes podem ser induzidos a formar brotos e plantas completas (organogênese) [10, 42].
Para o desenvolvimento e a manutenção destas culturas são necessários alguns requisitos importantes como: assepsia (para evitar
contaminações com bactérias, fungos, etc), meio nutritivo (composto por: sais minerais, sacarose, vitaminas, meso-inositol, ágar e hormônios), luz, temperatura (ambos são necessários para o
desenvolvimento adequado das plantas), O2 e CO2 (necessários para a
respiração). As aplicações da cultura de calo estão voltadas para as áreas de genética e biotecnologia, proporcionando estudos direcionados à elucidação de rotas metabólicas, crescimento e desenvolvimento de plantas melhoradas geneticamente, efeitos de metais tóxicos, estudos de aberrações cromossômicas, resistência a pragas e doenças, entre outros [10].
Sendo este campo de pesquisa muito vasto e complexo, serão apresentados e discutidos somente alguns trabalhos relevantes a esta dissertação. Watmough e Dickinson [43], estudaram a maior tolerância da Acer pseudoplatanus L. Sycamore a locais contaminados por metais. Sendo assim, meios de cultura de calo de tecidos destas árvores foram enriquecidos com soluções concentradas de Cd, Cu, Ni e Zn. Neste trabalho foi divulgado pela primeira vez, a resistência múltipla e a co-resistência a metais ocorrendo em nível celular em plantas. Com esta investigação pode-se destacar a possível utilização de plantas para, por exemplo, tratamento de resíduos compostos por metais tóxicos.
No estudo de Santandrea et al. [44], foi verificado que o
aumento da concentração de Mn (5 a 20 mmol.L-1) causou uma
redução significativa na formação dos calos de espécies Nicotiana. Rout et al. [45] estudaram alguns parâmetros de crescimento em cultura de tecido vegetal, dentre estes estão: atividade enzimática (catalase, peroxidase e ácido fosfatase), pesos fresco e
seco, além da altura destas espécies. Tais parâmetros foram utilizados para a avaliação de tolerância ao Mn e ao Zn. Os autores verificaram que as plantas obtidas a partir dos calos que apresentaram tolerância aos metais citados anteriormente,
desenvolveram-se in vitro na presença de concentrações de 0,80.10-3
e 0,24.10-3 mol. L-1 de Mn e Zn, respectivamente. Estes dados podem
ajudar, em programas de melhoramento genético, no processo de seleção e caracterização de plantas que apresentam tolerância a metais.
Outra propriedade interessante, estudada por Ben-Hayyim e Kochba [46], foi o crescimento e a estabilidade de células de calos ovulares de Citrus (Citrus sinensis Osbeck) em presença de excesso de NaCl. Os autores trataram algumas células dos calos com radiação gama, aquelas que sobreviveram foram mantidas permanentemente em meio de cultura, no qual foi adicionada uma solução de NaCl 0,2
mol.L-1 e apresentaram tolerância a este meio. O resultado foi
inovador, pois este tipo de calo apresenta, geralmente, alta sensibilidade a meios salinos. Com este estudo foi obtida uma nova variedade de plantas que poderiam crescer, por exemplo, com maiores concentrações de sal na água empregada para irrigação.
Materiais e Equipamentos
Os materiais e equipamentos que foram necessários para realizar esta dissertação encontram-se disponíveis no Instituto de Química da UNICAMP (Quadro 1) e no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS).
QUADRO 1: Relação dos principais equipamentos e materiais utilizados na parte experimental.
Equipamentos/Materiais Marca Modelo
Cuba e aparatos para eletroforese: placas
de vidro, pente e espaçadores de Teflon Fanezze PD–244
Potenciômetro Digimed DM–20
Agitador por efeito vortex Thermolyne M-37600
Ultracentrífuga Revan 14000-D
Balança Analítica; precisão = 0,1mg Mettler AE-200 Forno de microondas, operando a 2450±13
MHz, com potência nominal de 1200 W e equipado com sensor de temperatura e
frascos de Teflon
Provecto DTG–100
Chapa de aquecimento Marconi MA-289 Destilador de ácido sub-ebulição Marconi MA-075 Analisador elementar (CHN) Perkin-Elmer PE-2400
Reagentes e Soluções
Todas as soluções utilizadas foram preparadas com reagentes de grau analítico e água de alta pureza (18,2 MΩ cm), purificada com sistema de filtração Milli-Q (Millipore).
Os reagentes empregados para a eletroforese de gel e mineralização das bandas de proteínas foram da J. T. Baker. O padrão protéico de pesos moleculares conhecidos empregado na SDS-PAGE foi da MBI Fermentas.
A vidraria utilizada foi aquela de uso comum a um laboratório de química analítica.
As soluções-estoque (1000 mg.L-1) para Ca, K e Na foram
preparadas a partir dos seguintes sais: CaCO3, KNO3 (Carlo Erba) e
NaCl (Synth). Para os metais Cu, Fe, Mg, Mn e Zn foram utilizadas
soluções estoques (1000 mg.L-1) comerciais (J. T. Baker), a mesma
concentração de solução estoque foi empregada para o ítrio (SPEX).
Todas estas soluções foram preparadas empregando HNO3 2% (v/v).
Para as determinações de Ca e Mg empregando FAAS, foi adicionado determinado volume de uma solução de La 10% (m/v), de modo que a concentração final de La foi de 0,1% (m/v). A solução 10 % (m/v) de
La foi preparada pesando-se 58,7 g de La2O3 e dissolvendo-se esta
massa em 150 mL de HCl (conc.). O volume final desta solução foi aferido para 500 mL com água destilada/deionizada.
Procedimento de Limpeza
A limpeza das vidrarias foi realizada em banho de HNO3 10%
(v/v) por aproximadamente 10 h, sendo, em seguida, enxaguadas várias vezes em água ultra-pura.
Amostras
Os calos nucelares de laranja Valência (Citrus sinensis L. Osbeck) foram obtidos de acordo com o procedimento descrito por Benedito et al. [47]. O meio de cultura utilizado para a multiplicação
e 0,5 g.L-1 de extrato de malte. Após a auto clavagem por 20 min, o
valor de pH do meio de cultura foi de 5,8. Este meio, também, apresenta em sua composição uma série de sais e compostos orgânicos, o que pode ser verificado no Quadro 2.
Como os calos apresentam uma grande variabilidade no tamanho e forma de seus agrupamentos celulares, foi necessário empregar um procedimento para a amostragem [49] com o intuito de minimizar a heterogeneidade nos experimentos. Neste, a amostra que está inserida numa placa de Petri, contendo o meio de cultura, foi divida em quatro partes. Conseqüentemente, foram coletadas quatro sub-amostras de ca. 75 mg por divisão, totalizando aproximadamente 300 mg. A Figura 1 ilustra uma das amostras de calos de Citrus.
As amostras de calos foram obtidas do Laboratório de Biotecnologia Vegetal, CENA-USP.
QUADRO 2: Composição do meio de cultura EME.
Constituintes Concentração (mg.L-1) Constituintes Concentração (mg.L-1)
Na2MoO4.2H2O 0,25 NH4NO3 1650 CuSO4.5H2O 0,025 KNO3 1900 CoCl2.6H2O 0,025 MgSO4.7H2O 370 Tiamina-HCl 10,0 KH2PO4 150 Piridoxina-HCl 10,0 K2HPO4 20 Ácido nicotínico 5,0 CaCl2.2H2O 440 Glicina 2,0 FeSO4.7H2O 27,8 Meso-Inositol 100 Na2EDTA 37,3 Ágar 8,0x103 H 3BO3 6,2 MnSO4.H2O 2,3 KI 0,83 ZnSO4.7H2O 8,6
FIGURA 1: Calos de Citrus (aumento de 8 x).
Extração das Proteínas
Para a extração das proteínas do calo de Citrus foi utilizada uma solução tampão (solução que é designada também de tampão de incubação ou tampão de amostra) [15] contendo, 60 µL de SDS 10% (m/v), 30 µL de glicerol (conc.), 15 µL de β-mercaptoetanol (conc.),
8 µL de bromofenol 0,05% (m/v), 38 µL de tris-HCl 0,5 mol.L-1, pH 6,8
e 150 µL de H2O. A proporção empregada do tampão e de massa de
calo foi de 1:1. Assim, adicionou-se a solução tampão ao calo, e este foi macerado com o auxílio de um almofariz e pistilo em banho de
gelo, para manter a temperatura em aproximadamente 0oC. Após
esta etapa, a amostra foi colocada em um frasco adequado (tipo eppendorf), este frasco foi tampado e agitado por efeito vortex durante 20 min. Finalizada a agitação, a amostra foi centrifugada a 8500 g durante 5 minutos. A solução sobrenadante foi recolhida e armazenada em frasco adequado. Esta foi aquecida em banho-maria
aquecimento na presença de β-mercaptoetanol e SDS foi necessário para a desnaturação das proteínas. Além disso, o β-mercaptoetanol atua como agente redutor, quebrando as ligações dissulfídricas presentes em grande parte das proteínas. Esta quebra torna-se necessária para facilitar o acesso do SDS às partes internas das proteínas, além de contribuir para a separação de cadeias polipeptídicas mantidas por esta ligação covalente [15, 16].
Para aplicação no gel, aguardou-se o resfriamento da mesma à temperatura ambiente. Vinte µL de amostra foram aplicados em cada divisão do gel. A Figura 2 mostra um resumo de todo o processo de preparo da amostra de calo de Citrus anterior à aplicação no gel.
0oC 300 mg + 300 µL tampão Tris- HCl pH 6,8 75 mg 8500 g (13000 rpm) 5 min 100oC 10 min Aplicação no gel Agitação por efeito vortex 20 min 75 mg 00ooCC 300 mg + 300 µL tampão Tris- HCl pH 6,8 75 mg 8500 g (13000 rpm) 5 min 8500 g (13000 rpm) 5 min 100oC 10 min100 oC 10 min100 oC 10 min Aplicação no gel Agitação por efeito vortex 20 min 75 mg
FIGURA 2: Esquema das etapas realizadas para a extração das proteínas de calo de Citrus.
Gel de Eletroforese
Os géis empregados foram compostos por duas partes denominadas por gel concentrador ou de empilhamento (gel superior, pH 6,8) e gel fracionador ou separador (gel inferior, pH 8,8) [21]. Para a composição destas duas partes, foi necessário o seguinte procedimento: duas placas de vidro foram justapostas, sendo
separadas por espaçadores (confeccionados em Teflon). Estes
espaçadores têm como função determinar a espessura do gel, assim, foram fixados com graxa de silicone nas laterais e na parte inferior de uma das placas. Finalizada a montagem da placas, foi feita a aplicação da solução do gel fracionador até a altura suficiente para o
encaixe do pente de Teflon somando mais uma distância de 1,5 cm.
Aplicou-se, aproximadamente, 3 mL de água para a formação de um filme líquido sobre a superfície do gel. Assim é evitado o contato do
mesmo com o O2 do ar que pode interferir na polimerização, e
também são eliminadas as freqüentes bolhas formadas durante a etapa de aplicação. O gel requer cerca de 40 min para polimerização. Com o gel fracionador já polimerizado, a água foi devidamente retirada, adicionou-se a solução do gel concentrador e um pente de
Teflon foi encaixado. Após a polimerização (aproximadamente 30
min), o pente foi cuidadosamente retirado. Assim, onde os dentes dos pentes estavam encaixados formaram-se pequenas cavidades, as quais foram usadas para a aplicação das alíquotas da solução contendo as proteínas extraídas. Para montagem do sistema de eletroforese, o espaçador inferior foi retirado, para que a solução tampão, previamente adicionada, do reservatório inferior entrasse
em contato com o gel. As placas foram fixadas na cuba com o auxílio de prendedores. Posteriormente a esta etapa, a amostra protéica foi aplicada no gel concentrador (mais poroso), cuja função é efetuar uma separação prévia das proteínas. A Figura 3 mostra um esquema do sistema eletroforético. Nos reservatórios da cuba foi utilizado o
tampão tris-Glicina (tris 0,25 mol.L-1 e glicina 1,92 mol.L-1) de pH 8,3.
As funções e as composições de cada solução utilizada no preparo dos géis podem ser visualizadas no Quadro 3.
QUADRO 3: Composição dos géis concentrador (superior) e fracionador (inferior). Gel concentrador 3,0% (m/v) pH 6,8 Gel fracionador 12,5% (m/v) pH 8,8 Solução Função Volume (mL) Volume (mL) Acrilamida (29,1% m/v) + Bis-acrilamida (0,9% m/v) Acrilamida– monomêro; Bis-acrilamida–agente de ligação cruzada 1,00 4,20 Solução tampão
Tris-HCl Eletrólitos do meio (Tris+, Cl-) (1,0 mol.L1,25; -1) (1,5 mol.L2,50; -1) SDS 10% (m/v) Normaliza a carga e a forma das proteínas 1,00
Persulfato de amônio 10% (m/v) Gerador de radicais livres 0,05 TEMED Catalisador 0,01 Água destilada/
deionizada solvente/diluição final ≈ 10 mL) 6,75 (volume
2,30 (volume final ≈ 10 mL)
As condições empregadas na corrida eletroforética foram: correntes e tensões (inicial e final) de 10 e 30 mA, 40 e 120 V, respectivamente. Durante a corrida, o sistema de eletroforese foi
mantido sob refrigeração (10-15 oC). As dimensões do gel foram de:
185 x 135 x 1,5, largura, altura e espessura (mm), respectivamente. O tempo total da corrida eletroforética foi de aproximadamente 10 h. O término da corrida foi indicado por uma linha frontal formada por um corante presente no tampão de amostra, o azul de bromofenol, esta linha migra à frente das proteínas. Assim, quando a linha está a uma distância de aproximadamente 0,5 cm anterior à extremidade final do gel fracionador, a fonte elétrica deve ser desligada.
Finalizada a corrida eletroforética, foi necessário revelar as proteínas. Desta forma o gel foi cuidadosamente retirado das placas de vidro e imerso numa solução composta por: 0,15 g de Comassie
Brilliant Blue G–250 (CBG–250), 90 mL de metanol, 30 mL de ácido
acético glacial (conc.) e 180 mL de água destilada/deionizada. O gel foi colocado em contato com esta solução por aproximadamente 12 horas. Após este tempo, todo o gel adquire uma coloração azul, assim é necessário remover o excesso de corante utilizando a mesma solução descrita anteriormente, porém, sem a adição do CBG–250. O processo de descoloração durou aproximadamente 10 horas. A troca de solução foi necessária até se verificar um contraste das bandas de proteínas com a transparência do gel. A coloração azul permanece apenas nas bandas de proteínas, porque esta é resultante da reação entre os grupamentos sulfônicos do CBG-250 com os grupamentos amina das proteínas [50].
Reservatórios Gel Concentrador (pH 6,8) Gel Fracionador (pH 8,8) Local onde é aplicada a amostra 5 cm -Catodo + Anodo Fio de Platina Fio de Platina Solução tampão Tris-glicina (pH 8,3) Solução tampão Tris-glicina (pH 8,3)
Estimativa do Peso Molecular das Proteínas
Para estimar o peso molecular das proteínas do calo de Citrus, separadas por SDS-PAGE, foi empregado um padrão de proteínas com pesos moleculares conhecidos. Este padrão também foi aquecido a
100oC, por 5 min e aplicado em uma das divisões do gel (Figura 3). O
Quadro 4 mostra as proteínas presentes no padrão e os seus respectivos pesos moleculares.
QUADRO 4: Padrões protéicos de diferentes pesos moleculares.
Proteína Peso Molecular (kDa) β-galactosidase 116 albumina de soro bovino 66,2
ovalbumina 45,0 lactato dehidrogenase 35,0
endonuclease restrição Bsp98I 25,0 β-lactoglobulina 18,4
lisozima 14,4
Assim, a estimativa dos pesos moleculares é realizada utilizando uma curva do logaritmo do peso molecular versus mobilidade relativa (Rf), após a separação das proteínas por SDS-PAGE [15, 16, 19]. Na Equação 1 pode ser verificado como foi realizado o cálculo para Rf.
frontal linha pela percorrida distância proteína pela percorrida distância Rf = Equação (1)
A partir desta curva, foi gerada uma equação, sendo possível estimar os pesos moleculares das bandas de proteínas do calo de
Mapeamento de espécies químicas presentes nas bandas de proteínas
As varreduras foram realizadas na linha de Fluorescência de Raios-X (XRF) do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) [51]. A fonte de radiação síncrotron desta linha foi direcionada por um dipolo magnético D09B (dispositivo que mantém o feixe de elétrons em uma trajetória circular) no qual o campo magnético é de 1,65 T. A energia do elétron no interior do anel de armazenagem é de 1,37 GeV que gera uma energia crítica do fóton de 2,08 keV. Um sistema de fendas, controlado por computador, foi utilizado para colimar o feixe branco, de forma a se obter um micro-feixe de 280 x 280 µm na estação experimental. Um filtro de selênio foi colocado entre a amostra e o micro-feixe, para reduzir a intensidade dos componentes de maior energia do espectro. Já, para coletar a fluorescência, bem como a radiação proveniente das varreduras das amostras, foi utilizado um detector de energia dispersiva de Si(Li).
Para o mapeamento, algumas bandas do gel foram cuidadosamente retiradas com o auxílio de um bisturi. As varreduras nestas bandas foram efetuadas de duas formas: (1) varredura em uma área de 1000 x 1000 µm, totalizando 9 pontos, sendo o tempo de medida de 100 segundos por ponto, e (2) varredura em uma única direção, totalizando 3 (branco) e 8 (bandas de proteínas) pontos, o tempo de medida por ponto foi de 500 s. A Figura 4 mostra um esquema dos procedimentos adotados.
280 µm
(b)
(a) 1000 µm
500 µm
FIGURA 4: Esquema das varreduras realizadas nas bandas do gel de poliacrilamida. O tempo de medida em cada região (círculos) foi de (a) 100 s/ponto e em (b) 500 s/ponto.
Na realização das varreduras, a amostra (banda de proteína separada por SDS-PAGE) foi fixada com fita adesiva em um porta– amostra confeccionado em alumínio. O porta–amostra estava posicionado sobre um sistema controlado por computador que
permitiu movimentos nas direções X, Y, Z, θz, e estava localizado a
45o da direção do feixe incidente. A Figura 5 mostra a configuração
Fita
adesiva Porta- amostras (Al) Peça do gel contendo banda protéica e -Detector Si/Li Sistema Colimador Anel de armazenamento de elétrons 90o 45o 45o Motor de passos x y z
FIGURA 5: Configuração do sistema empregado na µSR-XRF para o mapeamento de espécies químicas nas bandas de proteínas separadas por SDS-PAGE.
Mineralização dos géis de poliacrilamida contendo as bandas de proteínas
No procedimento para a mineralização deste tipo de amostra, foi necessário cortar cuidadosamente, com o auxílio de um bisturi, os géis que possuíam as bandas de proteínas. O mesmo processo foi realizado para o branco (que foi definido como uma região do gel, onde não havia banda protéica). As dimensões de cada banda foram de aproximadamente 5 a 7 mm de largura por 1 a 2 mm de altura. As massas destas variaram entre 10–80 mg.
Nas mineralizações, foi utilizado um forno de microondas tipo
cavidade, equipado com sensor de temperatura e frascos de Teflon;
operando a 2450±13 MHz, com potência nominal de 1200 W. Dois programas (compostos por três etapas) de mineralização foram
testados (Tabela 1). As proporções de HNO3/H2O2 empregadas foram
de 4:1 e de 5:1 mL. Neste caso, os programas foram executados uma e duas vezes para se comparar a eficácia das mineralizações.
TABELA 1: Programações utilizadas no forno de microondas tipo cavidade.
Programa 1 Programa 2 Etapa Tempo
(min) Potência (W) Tempo (min) Potência (W)
1 03 400 03 400 2 03 790 06 790
3 03 0 03 0
Após o término do programa utilizado, aguardou-se, por
condições de segurança, o resfriamento dos frascos de Teflon. Em
seguida, os frascos foram colocados em chapa de aquecimento (60 a
70 oC), para a evaporação lenta do excesso de ácido. Posteriormente,
os volumes finais das amostras foram ajustados para 5 mL com HNO3
0,2% (v/v) em balões volumétricos.
Determinação de Metais em Proteínas empregando SR-TXRF
As determinações foram realizadas na linha XRF do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) empregando um detector de raios-X de energia dispersiva com as mesmas características descritas para o mapeamento dos metais por µSR-XRF. Neste caso, foi utilizado um
feixe branco com 0,3 mm de largura e 2 mm de altura para excitação das amostras.
Para o preparo da amostra, foram utilizados 45 µL de cada amostra mineralizada (bandas de proteínas de diferentes pesos
moleculares), sendo adicionados 5 µL de solução de Y (100 mg.L-1)
que foi utilizado como padrão interno. Assim, a concentração final de
Y em cada amostra foi de 10,0 mg.L-1. Cinco µL das amostras foram
aplicados em discos de acrílico do tipo Perspex [52] (3 cm ∅), sendo este volume seco à temperatura ambiente em porta-amostra individual para proteção contra possíveis contaminações.
As amostras foram excitadas por 300 s e os espectros foram avaliados pelo programa computacional AXIL [53] para o cálculo das intensidades de raios-X.
Na Figura 6 pode ser verificada a configuração do sistema empregado para a SR-TXRF.
≈180o e -Sistema Colimador Anel de armazenamento de elétrons Motor de passos x y z Detector Si/Li Disco Perspex
Local onde as soluções das amostras mineralizadas foram depositadas
FIGURA 6: Configuração do sistema empregado na SR-TXRF para a determinação quantitativa das espécies químicas em bandas de proteínas mineralizadas.
Determinação de Metais em Proteínas empregando FAAS e FAES
Para a determinação das espécies químicas nas amostras mineralizadas foi utilizado um espectrômetro de absorção atômica, Perkin-Elmer AAnalyst 300, equipado com lâmpada de deutério para a correção de sinal de fundo. Nas determinações foram utilizadas lâmpadas de catodo oco (Perkin-Elmer) de Ca (λ=422,7 nm, abertura de fenda=0,7 nm) e Mg (λ = 285,2 nm, abertura de fenda=0,7 nm) como fontes primárias de radiação. O Na foi determinado por FAES e empregou-se o mesmo equipamento descrito anteriormente. Os sinais analíticos foram registrados de acordo com a absorbância (FAAS) ou
intensidade (FAES) média e coletados por um tempo de aproximadamente 5s. As demais condições analíticas empregadas foram aquelas recomendadas pelo fabricante do equipamento [54].
Gel de Eletroforese
A Figura 7 mostra um gel de eletroforese obtido para uma das amostras de calo de Citrus utilizada durante o decorrer dos trabalhos. Este gel apresenta 4 colunas, sendo que as numeradas de 1 a 3 são correspondentes às replicatas das bandas protéicas para a amostra de calo. Na coluna 4 temos as bandas do padrão que contêm proteínas de pesos moleculares conhecidos (de 14,4 a 116 kDa). Na Figura 7, os retângulos tracejados (coluna 2) representam as bandas estudadas com os respectivos pesos moleculares, de cima para baixo, 86, 81, 75, 62, 55, 53, 36, 32, 27, 26,5, 24, 19, 15 e 14 kDa.
PM
(kDa)
1 2 3 4
116
66,2
45
35
25
18,4
14,4
5 cm
FIGURA 7: Imagem de um gel obtido por SDS-PAGE para amostra de calo de Citrus. Os números à direita representam os pesos moleculares já conhecidos do padrão de proteínas e P. M. corresponde ao peso molecular (kDa).
Com os dados dos pesos moleculares do padrão e de suas
mobilidades relativas (Rf) foi possível gerar uma curva (linear) do log
do peso molecular X Rf. Por meio desta curva foi possível obter uma
equação da reta. Esta equação foi utilizada para estimar os pesos moleculares das proteínas separadas das amostras de calos (ver detalhes no item Estimativa do Peso Molecular das Proteínas). A Figura 8 mostra a equação gerada e o coeficiente de correlação (r) obtido. 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
y=-0,9953x+2,108
r=0,9754
Lo
g PM
R
fFIGURA 8: Curva obtida para os padrões de pesos moleculares protéicos conhecidos e a respectiva equação gerada.
O mecanismo de separação das proteínas está diretamente ligado ao diâmetro do poro do gel. Esta propriedade está relacionada com a concentração de acrilamida (monômero)/bis-acrilamida (agente de ligação cruzada) [15]. Os géis utilizados neste trabalho apresentaram concentrações de 3,0% (m/v) para o gel concentrador e 12,5% (m/v) para o gel fracionador (ver detalhes no Quadro 3). Esta
combinação permitiu obter um maior número de bandas protéicas (faixa de 10-90 kDa) separadas por SDS-PAGE [16], evidenciando que estas concentrações foram adequadas para a amostra de calos de Citrus. Esta afirmação pode ser observada na Figura 7.
Mapeamento de Espécies Químicas presentes nas Bandas de Proteínas
O mapeamento com a µSR-XRF foi efetuado em diferentes regiões do gel. As espécies com números atômicos inferiores ao Al não foram detectadas (caso do Na e Mg), pois, o filtro utilizado para recobrir e proteger o detector de Si(Li) foi confeccionado em Al.
Nas varreduras realizadas na região do gel onde não havia proteínas (branco) e nas bandas de proteínas foi possível verificar, com o auxílio da Figura 9, que a radiação de fundo foi intensa para ambos os casos. Sendo mais persistente entre as energias de 7 a 14 keV. Esta observação foi constatada para todas as bandas estudadas. A Figura 9 mostra as varreduras para alguns pontos.
Esta intensa radiação de fundo pode ser decorrente da complexa composição do gel de poliacrilamida. Assim, esta limitação pode levar a alguns problemas de ordem analítica como, por exemplo, a redução da sensibilidade, inviabilizando as análises. No entanto, apesar desta alta radiação de fundo, foi possível realizar o mapeamento de alguns metais nas proteínas (Figura 9b).
O mapeamento foi realizado nas bandas que se encontravam na faixa de 86 a 14 kDa (Figura 7) e apresentaram resultados
interessantes e muito significativos. Além das bandas de proteínas, foi efetuado um mapeamento de possíveis elementos presentes na região do gel onde não havia proteína (branco).
0
7
14
21
28
0
2000
4000
6000
8000
Ar-Kα Ti-Kα Cl -K α Ca-KαCo
nt
ag
en
s (u
. a
.)
Energia (keV)
(a) 0 7 14 21 280
2000
4000
6000
8000
Zn-Kβ Zn-Kα Cu-Kα Fe-Kα Ca-Kα K-Kα Ar-KαCo
nt
ag
en
s (u
. a
.)
Energia (keV)
(b)FIGURA 9: Gráficos de contagens obtidos com o emprego da µSR-XRF para (a) branco e (b) banda de proteína de 53 kDa. As energias, a seguir, se relacionam com os elementos mostrados no gráfico: (Cl) 2,622; (Ar) 2,957; (K) 3,313; (Ca) 3,691; (Ti) 4,510; (Fe) 6,403; (Cu) 8,046; (Zn-Kα) 8,637 e (Zn-Kβ) 9,570 keV.
No branco (Figura 10), foram observadas as presenças de Ca, Cl e Ti. A presença de Ti foi relacionada ao contato da amostra com a fita adesiva (utilizada para fixar a banda protéica no suporte de alumínio), já que este material apresenta altas concentrações deste elemento (este fato foi previamente observado pelos usuários da linha XRF do LNLS). Já, Ca e Cl foram, possivelmente, provenientes das soluções utilizadas no preparo do gel, pois as intensidades obtidas foram constantes nas réplicas do branco (n=3).
0 280 560 0,0 4,0x10-5 8,0x10-5 1,2x10-4 Posição (µm) I. F .-K α (u . a .) Ca Cl Ti
FIGURA 10: Gráfico representando as varreduras do branco. Onde I. F. corresponde à intensidade de fluorescência (unidades arbitrárias).
Para identificar os metais realmente ligados às proteínas, a média das intensidades de fluorescência encontradas no branco foi subtraída das intensidades das bandas de proteínas.
O tempo de medida de algumas bandas foi menor (ver Figura 4a), porque no procedimento de medições foi adotada a seguinte estratégia: realizou-se, inicialmente, uma avaliação prévia das espécies químicas presentes em várias bandas (cerca de 40 bandas).
Em seguida, aquelas que apresentaram resultados mais promissores, ou seja, um número maior de espécies, foram mapeadas por um tempo maior (500 s por ponto medido). Como se tratava de uma análise qualitativa, este procedimento adotado foi necessário para obter uma visão global das espécies químicas presentes nas bandas de proteínas.
Na banda de 53 kDa foi encontrado um número maior de espécies, desta forma, o tempo de medida foi ampliado para esta amostra (ver Figura 4b). Nesta banda foram verificadas as presenças de Ca, Fe e K. Além disso, foi constatada a presença de Cu e Zn. A Figura 11 mostra a distribuição destas espécies, sendo possível observar que nas posições de 1120 a 1960 µm foi verificado um aumento do sinal para, principalmente, Ca, K e Zn.
Outro fator importante observado nesta banda foi relacionado à constância no sinal para o Cu (Figura 11). Este fato permite considerar que a maioria das proteínas presentes nesta banda apresenta ligações químicas com o Cu. Este fato é proveniente da essencialidade que o Cu apresenta em plantas, sendo necessário para uma variedade extensa de processos, que incluem reações de transferência de elétrons na respiração (oxidase citocromo c) e na fotosíntese (plastocianina), além de lignificação das paredes celulares da planta (laccase) [3].
Na posição 1120 µm foi verificado um aumento significativo do sinal para o Fe que, para as outras posições, se manteve menos intenso. Estas observações apresentam um forte indício de que tipos diferentes de proteínas presentes nesta banda não estariam ligados
às mesmas concentrações de metais. Além disso, evidencia que determinadas proteínas poderiam ter maior afinidade por uma espécie em particular, neste tipo de amostra (calo de Citrus).
0 280 560 840 1120 1400 1680 1960 0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 Ca Cu Fe K Zn I. F .-K α (u . a .) Posição (µm)
FIGURA 11: Gráfico representando as regiões mapeadas das bandas de proteínas com 53 kDa e as espécies químicas encontradas.
As demais bandas foram mapeadas por apenas 100 s por ponto (ver Figura 4a), pois durante as varreduras iniciais foi verificada, apenas, a presença de Fe.
A Figura 12a-f mostra a distribuição do Fe para as bandas de proteínas mapeadas. Nos gráficos apresentados na Figura 12 foi verificada uma região bem definida de maior intensidade para o Fe. Esta região de maior intensidade (região em preto) esteve presente em todas as bandas mapeadas. As observações levantadas anteriormente refletem na possibilidade de que este metal esteja atuando em processos bioquímicos e/ou fisiológicos no calo de Citrus. Isto pode sugerir que proteínas presentes, por exemplo, nas raízes de plantas se ligam ao Fe. Desta forma, atuando na captação deste
metal (que é vital para o crescimento das plantas) presente no solo [3]. No caso particular dos dados apresentados nesta parte o Fe está ligado a proteínas de diferentes pesos moleculares. Os resultados apresentados foram essencialmente qualitativos e estão coerentes com os estudos encontrados na literatura [33].
Para comprovar que os metais mapeados não eram provenientes do corante utilizado para revelar as bandas ou de possíveis contaminações, realizou-se a determinação de espécies químicas de interesse para este estudo na solução reveladora empregando a técnica FAAS.
As concentrações dos metais na solução reveladora foram: 1,10
mg.L-1 para o Ca, 0,16 mg.L-1 para o Mg e 0,77 mg.L-1 para o Fe. Estes
dados, somados ao fato de que as espécies que foram encontradas no mapeamento do branco foram apenas Ca, Cl e Ti, contribuíram, ainda mais, para a comprovação da hipótese de que os metais mapeados estavam realmente ligados às proteínas.
P. H. ( µm) P. V. (µm)x y z (a) (b)
FIGURA 12-Parte 1: Gráficos das varreduras realizadas para o Fe nas bandas de proteínas, (a) 81 kDa e (b) 62 kDa. Onde P. V. e P. H. correspondem às posições vertical e horizontal, respectivamente e I. F. é a intensidade de fluorescência (unidades arbitrárias).
P. H. ( µm) P. V. (µm)x y z (c) (d)
FIGURA 12-Parte 2: Gráficos das varreduras realizadas para o Fe nas bandas de proteínas, (c) 55 kDa e (d) 36 kDa.
P. H. ( µm) P. V. (µm)x y z (e) (f)
FIGURA 12-Parte 3: Gráficos das varreduras realizadas para o Fe nas bandas de proteínas, (e) 32 kDa e (f) 14 kDa.
Mineralização dos géis de poliacrilamida contendo as bandas de proteínas
No item anterior foi comentado sobre uma elevada radiação de fundo para todas as bandas de proteínas estudadas, além de serem verificados resultados muito promissores para se realizar a determinação de espécies químicas nas bandas de proteínas dos calos de Citrus. Este fator foi mais marcante para a banda de 53 kDa. Desta forma, para tentar contornar a elevada radiação de fundo e, ao mesmo tempo, realizar a determinação dos metais nas proteínas, foi elaborado e otimizado um procedimento para mineralização deste tipo de amostra (banda de proteína em gel de poliacrilamida).
No procedimento de mineralização foi utilizado um forno de microondas tipo cavidade, sendo que este é equipado com frascos de
Teflon. Nas mineralizações, foram avaliadas duas proporções entre
HNO3 conc. (sub-ebulição) e H2O2, 5:1 e 4:1. Com o programa 2
(Tabela 1) executado duas vezes, não se notou, para ambas proporções, nenhuma partícula ou turvação visível a olho nu nas soluções mineralizadas. Além disso, foram verificados teores de carbono residual na faixa de 0,52-1,50% (m/m) nas amostras
mineralizadas, após a eliminação do excesso de HNO3 e ajuste do
volume para 5 mL. Esta baixa concentração de carbono comprova a eficiência do segundo programa de mineralização, já que o teor de carbono original na banda de gel foi de ca. 40% (m/m). Nas mineralizações subseqüentes, o programa 2 foi executado duas vezes,
