A figura 11 ilustra a viabilidade celular após 30 minutos de tratamento ácido dos mutantes nulos de componentes da via da proteína quinase Snf1p (snf1Δ, sak1Δ, elm1Δ e tos3Δ). A contagem de colônias da cepa parental BY4741 exposta
ao mesmo tempo de tratamento foi usada como controle (100% de viabilidade). Os resultados mostram tolerância significativamente inferior dos mutantes em relação à cepa parental, sugerindo o envolvimento da via da quinase Snf1p na resposta a estresse ácido. Embora sejam quinases redundantes, os mutantes deficientes em Sak1p e Tos3p apresentaram viabilidades significativamente maiores que o mutante deficiente em Elm1p.
Figura 11: Viabilidade celular de mutantes da via da Snf1p após 30 minutos de exposição a HCl pH2,0 mais 86mM de NaCl. Os resultados estão expressos em função da cepa parental BY4741 – 100% de viabilidade. *Significância em relação a BY4741. **Significância em relação a elm1Δ. p<0,05.
5.Discussão
No presente trabalho, foi analisada a participação do íon cálcio na resposta a estresse ácido provocado por ácidos inorgânicos. A concentração citoplasmática de cálcio em condições ideais é relativamente baixa e aumenta quando as células são submetidas a um estresse ambiental. Esse aumento transitório dos níveis de cálcio é fundamental para a ativação das vias reguladas pelo íon, incluindo a via da calcineurina. Para monitorar o aumento de cálcio citoplasmático decorrente de pulsos ácidos, foram utilizadas duas técnicas. No ensaio da fotoproteína sensível a cálcio, aequorina, houve um evidente aumento de luminescência desencadeado por um pulso de 0,1M final de glicose (Figura 4a). Quando comparados ao controle positivo, os sinais de cálcio induzidos por diferentes pHs ácidos mostraram-se muito menores, sendo que em pH2,2 não foi possível detectar emissão de luz (Figura 4b). Quando os pulsos de glicose foram executados em meio ácido, notou-se que quanto menor o pH, menor foi o aumento de luminescência (Figura 4a), o que confirma a sensibilidade do ensaio da aequorina a variações de pH como alguns estudos já haviam sugerido (Viladevall et al., 2004; Zhang et al., 2012).
Como alternativa ao ensaio da aequorina, foi utilizado o ensaio do indicador fluorescente de cálcio Oregon Green® 488-1 BAPTA, AM (Figuras 5a e 5b). Nossos
resultados mostraram sinais de cálcio induzidos por pulso ácido mais evidentes e de amplitude semelhante ao do controle positivo (0,1M final de glicose), sendo que o pulso efetuado com um pH4,1 desencadeou o melhor sinal. Viladevall e colaboradores (2004) utilizaram o ensaio da aequorina para estudar a elevação transitória dos níveis de cálcio desencadeadas por pH alcalino. A maior emissão de luz foi obtida em pH8,2 e reduziu em pH próximo da neutralidade ou mais alcalino. Wang e colaboradores (2011) monitoraram o fluxo de cálcio com o indicador fluorescente Fluo-3 AM na levedura Candida albicans através de citometria. Os resultados encontrados sugeriram que o sinal é sensível a pH, apresentando maior fluorescência em pH8,1, mas em pH4,0 a detecção de fluorescência é muito menor. A menor sensibilidade do Oregon Green a variações de pH permitiu a medição dos níveis de Ca2+ na cepa parental BY4741 com resultados semelhantes em três
Os mutantes do canal de cálcio de membrana plasmática, mid1Δ e cch1Δ, e
do canal de cálcio vacuolar, yvc1Δ, apresentaram menores elevações de
fluorescência induzida por um pulso de pH4,1 quando comparados à cepa parental BY4741 (Figura 6). Estresses hiperosmótico e oxidativo induzem elevação dos níveis de cálcio principalmente através da liberação das reservas vacuolares (Matsumoto et al., 2002; Popa et al., 2010), enquanto pulsos alcalinos desencadeiam principalmente a entrada de Ca2+ externo (Viladevall et al., 2004;
Wang et al., 2011). Nossos resultados, porém, indicaram emissões muito semelhantes de fluorescência nos mutantes cch1Δ e yvc1Δ e um pouco maiores no
mutante mid1Δ. Embora Cch1p e Mid1p façam parte do mesmo complexo proteico,
Popa e colaboradores (2010) observaram diferenças nos sinais de cálcio em ambos os mutantes, o que permitiu sugerir uma maior importância de Cch1p para a passagem de cálcio pela membrana plasmática. No presente trabalho, os ensaios realizados na cepa parental BY4741 em presença dos quelantes de cálcio externo EGTA ou interno BAPTA, AM, ou do cátion competidor Mg2+, mostram uma redução
do sinal de cálcio (Figura 7), sugerindo que tanto o influxo extracelular quanto a mobilização vacuolar de cálcio estão envolvidos no aumento dos níveis do íon em pH ácido.
Nos ensaios de viabilidade celular, os mutantes de canais de cálcio apresentaram menor viabilidade em relação à cepa parental BY4741 já a partir de 30 minutos de exposição a pH ácido. Além disso, observa-se tolerância um pouco maior do mutante mid1Δ em relação a cch1Δ e yvc1Δ (Figura 8). Ao se comparar
resultados de viabilidade e resultados de sinal de cálcio, é possível sugerir que o canal de cálcio Mid1p é menos importante para o influxo de cálcio externo que o canal Cch1p.
Os mutantes da via da calcineurina também foram submetidos a testes de viabilidade celular após exposição a estresse ácido (Figura 9). A viabilidade significativamente menor dos mutantes cnb1Δ e crz1Δ em comparação com a cepa
parental BY4741 (assim como o efeito observado quando a cepa parental foi previamente incubada com o inibidor de calcineurina FK506) mostra a importância desta via para a resposta da S. cerevisiae a estresse ácido. Adicionalmente, estes mutantes apresentaram crescimento celular significativamente menor que a cepa parental em meio ácido (Figura 10). O envolvimento desta via na resposta a estresses osmótico, alcalino e oxidaditvo foi previamente descrito (Matsumoto et al.,
2002; Viladevall et al., 2004; Popa et al., 2010). Lucena e colaboradores (2012) demonstraram uma menor viabilidade do mutante crz1Δ exposto a ácido sulfúrico
pH2,5, corroborando nossos resultados de que o aumento transitório dos níveis de cálcio ativa a calcineurina em baixo pH e regula a expressão gênica em resposta a estresse ácido através do fator de transcrição Crz1p.
A via de sinalização da proteína quinase Snf1p tem papel fundamental para a mobilização de fontes alternativas de carbono na ausência de glicose e também está relacionada à resposta a estresses. Sua ativação e interação com o aumento dos níveis de cálcio já foram demonstradas em resposta a íons tóxicos e estresses alcalino, salino e oxidativo (Dubacq et al., 2004; Portillo et al., 2005; Hong & Carlson, 2007; Ohdate et al., 2009). Os mutantes nulos de componentes dessa via também foram submetidos a ensaios de viabilidade celular. Nossos resultados mostraram que snf1Δ foi bem menos viável que BY4741 após o tratamento ácido, bem como os
mutantes das quinases redundantes que ativam Snf1p (sak1Δ, elm1Δ e tos3Δ),
sugerindo a participação dessa via na resposta a baixo pH (Figura 11). Segundo Hedbacker e Carlson (2009), as quinases Sak1p, Elm1p e Tos3p contribuem de forma diferente para a ativação de Snf1p, sendo Sak1p a principal delas em limitação de glicose. Curiosamente, nossos resultados mostraram maior viabilidade dos mutantes sak1Δ e tos3Δ em relação a elm1Δ, indicando que possivelmente
6.Conclusões
Nossos resultados mostram aumento da concentração citosólica de cálcio frente a um pulso ácido e esta elevação é devida tanto ao influxo de cálcio extracelular quanto à mobilização de cálcio vacuolar. Os níveis aumentados de cálcio livre ativam a via da calcineurina dependente de Ca2+/calmodulina que é
importante para o crescimento e manutenção da viabilidade celular de
Saccharomyces cerevisiae em pH ácido através da regulação da expressão gênica
pelo fator de transcrição Crz1p. Além disso, a via de mobilização de fontes alternativas de carbono também parece estar envolvida na maior tolerância de S.
cerevisiae a baixo pH e, aparentemente, a ativação de Snf1p é feita principalmente
pela quinase Elm1p.
Figura 12: Participação da via de sinalização da calcineurina dependente de Ca2+/calmodulina e da
7.Perspectivas
Estudar o envolvimento de outras proteínas na variação dos níveis citosólicos de cálcio e na tolerância da S. cerevisiae frente a estresse ácido, como a quinase Arg82p (responsável pela fosforilação de IP3 a IP4 e IP5) e as
quinases dependentes de calmodulina Cmk1p e Cmk2p.
Demonstrar a atividade da quinase Snf1p em condições de estresse ácido, confirmando os resultados de viabilidade celular.
Verificar a fosforilação/ativação de Snf1p por quinases dependentes de calmodulina em resposta a baixo pH, permitindo sugerir a interação entre a via da Snf1 e o aumento transitório da concentração citoplasmática de cálcio.
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