A amplificação do gene LEU2 mostrou que as linhagens apresentam duas bandas com pesos moleculares diferentes, uma banda mais pesada (cerca de 1100pb) com as linhagens JP1 e CLIB 811 (colunas 1 e 2) e uma banda mais leve (cerca de 800pb) que compreende as linhagens CLIB 252, 256, 533 e 251 (colunas 3, 5, 6 e 7), contudo a linhagem CLIB 254 não apresentou amplificação para esse gene (figura 9).
34 Figura 9. Eletroforese do gene LEU2.M: Marcador; 1: JP1 S. cervisiae; 2: CLIB 811 S. bayanus; 3: CLIB 252
S. bayanus; 4: CLIB 254 S. bayanus; 5: CLIB 256 S. bayanus; 6: CLIB 533 S. uvarum; 7: CLIB 251 S. uvarum.
4.6. PCR e análise dos genes HO, YCK1, RPS24A e SNF1
As linhagens JP1 e CLIB 811 apresentaram amplificação para todos os iniciadores utilizados (figuras 10 a 13, respectivamente), HO com 1760pb, YCK1 com 1616pb, RPS24A com 873pb e SNF1 1901pb. As demais linhagens de S. bayanus não amplificaram os genes com exceção do gene RPS24A (figura 12). Notou-se que o tamanho dos fragmentos em todas as linhagens do gene RPS24A apresentam o mesmo peso molecular de 873pb.
Figura 10. Eletroforese do gene HO. M: Marcador; 1: JP1 S. cerevisiae; 2: CLIB 811 S. bayanus; 3: CLIB 252 S. bayanus; 4: CLIB 254 S. bayanus; 5: CLIB 256 S. bayanus.
35 Figura 11. Eletroforese do gene YCK1 M: Marcador; a: JP1
S. cerevisiae; b: CLIB 811 S. bayanus; c: CLIB 252 S. bayanus; d: CLIB 254 S. bayanus; e: CLIB 256 S. bayanus.
Figura 12. Eletroforese do gene RPS24A M: Marcador; 6: JP1 S. cerevisiae; 7: CLIB 811 S. bayanus; 8: CLIB 252 S. bayanus; 9: CLIB 254 S. bayanus; 10: CLIB 256 S. bayanus.
Figura 13 Eletroforese do gene SNF1 M: Marcador; f: JP1 S. cerevisiae; g: CLIB 811 S. bayanus; h: CLIB 252 S. bayanus; i: CLIB 254 S. bayanus; j: CLIB 256 S. bayanus.
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4.7. PCR-RFLP e análise do gene MET2
A banda do gene MET2 possui 600pb como identificado na coluna 1 da figura 14. Esta coluna está representada pela JP1 S. cerevisiae. Não houve amplificação do gene da levedura S. bayanus CLIB 181 como pode ser observado na coluna 2. A coluna 3 é apenas um controle negativo. As bandas de S. cerevisiae (JP1) e S. bayanus (CLIB 811) apresentam-se digeridas pela enzima de restrição EcoRI (colunas e1 e e2, respectivamente) as demais colunas da primeira linha não foram digeridas pela enzima.
Na segunda linha da figura 14 foi utilizada a enzima PstI. É visto que as colunas p1 e p2 não foram digeridas e as colunas p5, p7 e p8 foram digeridas (CLIB 256 S. bayanus, CLIB 533 S. uvarum e CLIB 251 S.uvarum), na coluna p5 nota-se que ela apresenta três fragmentos ao invés de dois como os que ocorrem nas colunas p7 e p8. As colunas p3 e p4 (S. bayanus CLIB 252 e 254) também não foram digeridas por ambas as enzimas.
Figura 14. Eletroforese de RFLP do gene MET2 M: 100pb; 1: JP1 S. cerevisiae não digerido; 2: CLIB 181 S. bayanus não amplificado; 3: controle negativo. Digestão com EcoRI: e1: JP1 S. cerevisiae; e2: CLIB 811 S. bayanus; e3: CLIB 252 S. bayanus; e4: CLIB 254 S. bayanus; e5: CLIB 256 S. bayanus; e6: CLIB 181 S. bayanus; e7: CLIB 533 S. uvarum; e8: CLIB 251 S. uvarum. Digestão com PstI: p1: JP1 S. cerevisiae; p2: CLIB 811 S. bayanus; p3: CLIB 252 S. bayanus; p4: CLIB 254 S. bayanus; p5: CLIB 256 S. bayanus; p6: CLIB 181 S. bayanus; p7: CLIB 533 S. uvarum; p8: CLIB 251 S. uvarum.
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5. Discussão:
Na análise das linhagens pelo método PCR-fingerprint (GTG)5 foi visto que nem todas as linhagens da mesma espécie apresentaram o mesmo padrão de bandas como o ocorrido com as linhagens de S. uvarum, entretanto foi visto que as linhagens S. bayanus CLIB 811 e
S. cerevisiae JP1 apresentam padrão similar de bandas estando elas classificadas como
espécies diferentes. Dos Santos et al (2007) mostram que as linhagens da mesma espécie apresentam o mesmo perfil, o que não foi observado neste trabalho. Sugerimos que as linhagens de S. bayanus sejam híbridas (com exceção da linhagem CLIB 811), pois apresentam perfis diferentes, com algumas bandas em comum.
A cariotipagem por eletroforese tem sido amplamente utilizada para caracterizar a viabilidade dos cromossomos entre as linhagens de Saccharomyces (Naumov et al., 1993; Schütz & Gafner, 1994). Esta técnica tem sido aplicada com sucesso para revelar rearranjo cromossômico interespecífico dentro do gênero Saccharomyces (Ryu et al., 1996; de Barros Lopes et al., 2002) e para caracterizar as linhagens de leveduras híbridas (Yamagishi & Ogata, 1999).
O perfil encontrado na levedura S. cerevisiae JP1 é idêntico ao que Lucena et al (2007) descrevem para essa levedura, entretanto os autores afirmam que JP1 mostrou um alto grau de polimorfismo cromossômico devido ao ambiente de estresse que é encontrado nas dornas fermentativas das indústrias alcooleiras.
As linhagens de S. uvarum comportam-se de uma forma homogênea e formam um grupo natural dentro do complexo Saccharomyces “sensu stricto”, apresentando duas bandas características na área entre 225 e 365 Kb (Rainiere et al, 1999), o que foi observado nas linhagens CLIB 251 e CLIB 533.
Nota-se que as linhagens de S. bayanus apresentam uma banda característica de 1300 Kb, as linhagens CLIB 252 e 254 mostraram o mesmo perfil descrito por Naumova et al. (2005) e a CLIB 256 mostrou um perfil levemente diferentes das duas outras linhagens. Na área entre 225-365 Kb apresentam de três ou mais bandas de cromossomos pequenos de acordo com Naumov et al. (2001) para as três linhagens diferente das linhagens de S. uvarum que possuem apenas duas bandas de cromossomos.
As diferenças cromossômicas entre S. cerevisiae e S. bayanus é resultante de rearranjos por translocação (González et al, 2006), entretanto o autor não especifica qual é o tipo de S. bayanus se é S. bayanus var bayanus ou se é S. bayanus var uvarum.
38 Dos Santos et al. (2007) separa o complexo Saccharomyces “sensu stricto” em dois
grandes grupos: o grupo cerevisiae e o grupo bayanus. Dentro deste complexo, a ribotipagem por PCR apresenta uma banda padrão de 850pb e essa divisão é dada devido à digestão deste fragmento pela enzima de restrição HaeIII, gerando quatro fragmentos de 325pb, 230pb, 175pb e 125pb para o grupo cerevisiae e 3 fragmentos de 495pb, 230pb e 125pb para o grupo bayanus. Como pode ser visto, a figura 7 mostra que o padrão de digestão da linhagem CLIB 811 S. bayanus (coluna 2) é o padrão do grupo cerevisiae, mostrando mais uma vez que esta linhagem deve ser uma Saccharomyces cerevisiae e não Saccharomyces bayanus como está atualmente classificada. As demais linhagens apresentam o padrão do grupo bayanus como demonstrado por Dos Santos et al. (2007).
A amplificação dos genes URA1, HO, YCK1 e SNF1 só ocorreram nas linhagens JP1 e CLIB 811 enquanto que as demais linhagens não apresentaram o fragmento amplificado, mais um indício de que a linhagem CLIB 811 seja Saccharomyces cerevisiae e não
Saccharomyces bayanus. Apesar dos iniciadores utilizados serem para Saccharomyces cerevisiae, os genes LEU2 e RPS24A amplificaram nas demais linhagens e como foi visto na
figura 9, as linhagens JP1 e CLIB 811 apresentaram um fragmento com 1100pb e as demais linhagens, com exceção de CLIB 254 que não amplificou, apresentaram um fragmento com 800pb. Isso demonstra que esse gene presente nas linhagens de S. bayanus seja proveniente de seu parental S. uvarum o que aponta para um caráter híbrido de S. bayanus. Em relação ao gene RPS24A, é visto que as linhagens de JP1, CLIB 811, 252, 254 e 256 apresentaram um fragmento de mesmo peso molecular e isso pode indicar, para as linhagens CLIB 252, 254 e 256, que esse gene possa ter vindo de um parental S. cerevisiae sugerindo que essas linhagens tenham surgido de um evento de hibridização com três parentais como o ocorrido com as linhagens CID1 e S6U que fermentam vinho e cidra (Masneuf et al., 1998) já que para os demais genes não ocorreu amplificação e isso sugere que o alelo para os genes seja de um parental não-S. cerevisiae.
A análise do gene MET2 através de PCR-RFLP é baseada nos padrões de restrição do próprio MET2 em S. cerevisiae e S. bayanus (Masneuf et al., 1996). A enzima de restrição EcoRI corta fragmentos do gene MET2 oriundos de S. cerevisiae enquanto que a PstI corta apenas os fragmentos vindos de S. uvarum (Masneuf et al., 1996 e Masneuf et al.,1998). A digestão dos fragmentos de MET2 das linhagens JP1 e CLIB 811 feita com a EcoRI segue o padrão encontrado por Masneuf et al., 1996 e Masneuf et al., 1998. Esse é mais um dado indicando que CLIB 811 não é S. bayanus, enquanto que os demais fragmentos das outras
39 linhagens não foram digeridos indicando que não apresentam parental S. cerevisiea, no caso
das linhagens híbridas. Na digestão com PstI o DNA amplificado do gene MET2 das linhagens JP1 e CLIB 811 permaneceram intactas, enquanto as linhagens CLIB 251, 256 e 533 [S. uvarum(linhagem tipo), S. bayanus e S. uvarum, respectivamente] foram digeridas, além disso percebe-se uma banda extra na linhagem CLIB 256 que não foi digerida indicando que essa levedura possui um dos alelos de outra levedura que não é S. uvarum e nem S.
cerevisiae já que a mesma não apresentou digestão pela enzima EcoRI. Esse padrão de uma
terceira banda não digerida foi apresentado pelas linhagens híbridas que fermentam cidra e vinho por Masneuf et al., (1998) e Le Juene et al. (2006). Dois pontos importantes que devem ser ressaltados é que: (i) a linhagem tipo CLIB 181 não apresentou amplificação do gene MET2; e (ii) as bandas das linhagens CLIB 252 (CBS 1546) e 254 (CBS 1505) não foram digeridas por nenhuma das enzimas, apesar de Naumova et al (2005) ter trabalhado com essas linhagens, não há dados na literatura que explique esse acontecimento.
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6. Conclusão
A levedura CLIB 811 Saccharomyces bayanus, mostrou-se completamente diferente das demais linhagens de Saccharomyces bayanus tendo um perfil cariotípico, tipagem por (GTG)5, padrão de digestão de ITS e demais marcadores idênticos ao da linhagem JP1 de
Saccharomyces cerevisiae, mostrando que foi classificada equivocadamente como Saccharomyces bayanus, de modo que propomos que seja reclassificada como Saccharomyces cerevisiae.
As demais linhagens de Saccharomyces bayanus apresentam variações intra- específicas marcantes, o que suporta a idéia de que as diferentes linhagens sejam originadas de diferentes eventos de hibridização entre Saccharomyces uvarum e um parental não-
Saccharomyces cerevisiae. Contudo foi visto que as linhagens apresentaram um alelo de Saccharomyces cerevisiae do gene RPS24A e que as linhagens CLIB 252 e 254 não
apresentaram restrição para o gene MET2 com a enzima PstI, mas a linhagem CLIB 256 além de ter mostrado o padrão de restrição esperado, mostrou um terceiro fragmento não digerido. Diante destes resultados, as linhagens de Saccharomyces bayanus analisadas são realmente híbridas e provavelmente surgiram por hibridização com mais de dois parentais, sendo o parental Saccharomyces cerevisiae o de menos influência.
Os métodos utilizados funcionam bem para agrupar as similaridades, já que as duas linhagens bem definidas como Saccharomyces uvarum apresentaram-se bem homogêneas sem diferenças entre elas, reforçando o status de espécie que foi proposto por Nguyen e Gaillardin (2005).
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Giordanni Cabral Dantas [giordanni_cabral@yahoo.com.br], nascido em 30 de janeiro de 1982, Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade Federal da Paraíba no dia 26 de novembro de 2007, com trabalho de conclusão de curso intitulado: Morfologia de Glândulas Tegumentares de Abelhas da Tribo Centridini. Em 2004 participou do Programa Aristides Pacheco Leão de estímulo a vocação científica financiado com bolsa auxílio CNPq no Instituto de Biociências da UNESP – Rio Claro com foco em microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. Em resumos de Congresso publicou como primeiro autor o seguinte trabalho: Diversidade Genética de Algumas Leveduras do Complexo Saccharomyces “Sensu Stricto” (27ª Reunião de Genética de Microrganismos, 2010); e como segundo autor publicou os seguintes resumos em Congresso: A new alternative of a biopolymer as antimicrobial agent: in vitro analysis of the antimibacterial activity of chitosans against Staphylococcus aureus, Echerichia coli e Lactobacillus casei (XXII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2003.) e Ação Antimicrobiana da quitosana contra cepas de Staphylococcus aureus multiressistente obtidas de bovinos e isolados clínicos (V Simpósio Iberoamericano de Quitina, 2003, Natal. IV Simpósio Iberoamericano de Quitina, 2003.).