Diversidade genética de leveduras do complexo Saccharomyces sensu stricto

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(1)Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. DIVERSIDADE GENÉTICA DE LEVEDURAS DO COMPLEXO SACCHAROMYCES “SENSU STRICTO”. GIORDANNI CABRAL DANTAS. RECIFE 2010. 1.

(2) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. DIVERSIDADE GENÉTICA DE LEVEDURAS DO COMPLEXO SACCHAROMYCES “SENSU STRICTO”. GIORDANNI CABRAL DANTAS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE. Orientador: Marcos Antônio de Morais Júnior. RECIFE 2010 2.

(3) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Dantas, Giordanni Cabral Diversidade genética de leveduras do complexo Saccharomyces “sensu stricto”/ Giordanni Cabral Dantas. – Recife: O Autor, 2010.. 35 folhas : il., fig, tab. Orientador: marcos Antonio de Morais Junior. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, 2010. Inclui bibliografia e anexos. 1. Genética dos fungos 2. Saccharomyces 3. Leveduras I. Título.. 579.135. CDD (22.ed.). UFPE/CCB-2010-219. 3.

(4) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 4.

(5) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Agradecimentos Ao Prof. Dr. Marcos Antônio de Morais Júnior por acreditar em mim para a realização deste trabalho.. Aos colegas de laboratório: Fernanda, Theresa, Carolina, Billy, Rochane, Brígida, André Ribas, Rodrigo e Raquel. Em especial a Rute e Luciana pelas palavras de conforto quando eu precisei.. Aos colegas do grupo GEMAP, em especial à: Angélica, Carolina Maria, Pavla e Jackeline pelas idas e vindas a João Pessoa.. Aos membros do Programa de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco.. A FACEPE pela bolsa auxílio, pois sem ela não seria possível a execução e conclusão deste trabalho.. Aos meus amigos, em especial a Wagner por estar sempre aturando os meus abusos e proporcionando momentos felizes na minha vida e a minha “família feliz” que mora comigo: Leo, Virgínia e Vanessa.. À minha família, principalmente ao meu pai José Taunaí e minha mãe Wanda por estarem sempre ao meu lado e me apoiarem nas minhas decisões e a minha tia Maria Madalena por acreditar em mim.. A Deus por me ajudar a construir os meus sonhos.. 5.

(6) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... SUMÁRIO. Item. Página. Lista de Abreviaturas. .......... i. Lista de Figuras. .......... ii. Lista de Tabelas. .......... iii. Resumo. .......... iv. Abstract. .......... v. Introdução. .......... vi. 1. Revisão Bibliográfica 1.1. As leveduras. 1. 1.2. O gênero Saccharomyces. 1. 1.3. A levedura Saccharomyces cerevisiae. 2. 1.4. O complexo Saccharomyces “sensu stricto”. 3. 1.5. Diferenciação de espécies do complexo Saccharomyces “sensu stricto”. 4. 1.6. Os híbridos do complexo e o problema da especiação. 7. 1.7. Técnicas moleculares: tipagem por PCR-microssatélite, cariotipagem, ribotipagem por PCR e rDNA-RFLP e PCR-RFLP. 8. 1.7.1. Tipagem por PCR-microssatélite. 8. 1.7.2. Cariotipagem. 9. 1.7.3. Ribotipagem por PCR e rDNA-RFLP. 9. 1.8. Considerações. 10. 2. Objetivos. 12. 3. Materiais e Métodos. 13. 4. Resultados. 17. 4.1. Tipagem. 17. 4.2. Cariotipagem. 18. 4.3. Ribotipagem por PCR e rDNA-RFLP. 19. 4.4. PCR e análise do gene URA1. 20. 4.5. PCR e análise do gene LEU2. 20. 6.

(7) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 4.6. PCR e análise dos genes HO, YCK1, RPS24A e SNF1. 21. 4.7. PCR-RFLP e análise do gene MET2. 23. 5. Discussão. 24. 6. Conclusão. 27. 7. Referência Bibliográfica. 28. 8. Anexos. 34. 9. Memorial do aluno. 35. 7.

(8) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Lista de abreviaturas AFLP - Polimorfismo do comprimento do fragmento amplificado BSA - Albumina de soro bovino acetilada CBE - Conceito biológico de espécie clássico CBS - Centraalbureau voor Schimmelculture CFE - Conceito filogenético de espécie CME - Conceito morfológico de espécie CIRM – Centre International de Ressource Microbiennes CLIB - Collection de Levures d’Intérêt Biotechnologique DNA - Ácido desoxirribonucléico dNTP – Desoxirribonucleotídeo trifosfatado DTT - Ditiotreitol ISSR - Seqüências simples entre repetições ITS - Regiões transcritas internas MR - Reparação de bases mal-emparelhadas PCR - Reação em Cadeia de Polimerase PFGE - Eletroforese de Gel em Campo Pulsátil rDNA - Ácido desoxirribonucléico ribossomal RFLP - Polimorfismo de tamanhos dos fragmentos de restrição RNA – Ácido ribonucléico TBE – Tampão tris-borato YPD – Meio de cultura contendo extrato de levedura, peptona bacteriológica e glicose. 8.

(9) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Lista de Figuras. Página. Figura 1. Células de S. cerevisiae em microscópio óptico. 2. Figura 2. Árvore filogenética dos integrantes do complexo “sensu stricto”. 4. Figura 3. Representação dos integrantes do complexo “sensu stricto”. 5. Figura 4. Representação da região ITS. 10. Figura 5. Eletroforese de fingerprinting (GTG)5. 17. Figura 6. Eletroforese em campo pulsado para separação cromossômica. 18. Figura 7. Eletroforese de RFLP da região ITS. 19. Figura 8. Eletroforese do gene URA1. 20. Figura 9. Eletroforese do gene LEU2. 21. Figura 10. Eletroforese do gene HO. 21. Figura 11. Eletroforese do gene YCK1. 22. Figura 12. Eletroforese do gene RPS24A. 22. Figura 13. Eletroforese do gene SNF1. 22. Figura 14. Eletroforese de RFLP do gene MET2. 23. 9.

(10) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Lista de tabelas. Página. Tabela 1. Espécies, linhagens e coleção das leveduras utilizadas neste trabalho. 13. Tabela 2. Iniciadores utilizados como marcadores moleculares. 14. 10.

(11) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Resumo O complexo Saccharomyces “sensu stricto” é atualmente constituído por espécies de leveduras que correspondem aos epítetos Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces. kudriavzevii,. Saccharomyces. pastorianus,. Saccharomyces. uvarum,. Saccharomyces monacensis e Saccharomyces carlsbergensis. A grande similaridade fisiológica entre estas espécies decorre da alta semelhança genética que permite até a formação de híbridos interespecíficos que são viáveis, embora estéreis. Atualmente, os taxonomistas têm se utilizado das técnicas de biologia molecular para a identificação e diferenciação dos isolados deste grupo. Tais técnicas podem gerar valiosas informações sobre a composição e o arranjo genômico desse grupo de leveduras, permitindo o entendimento sobre os mecanismos de especiação biológica e de adaptação genética aos ambientes industriais. O objetivo deste trabalho foi tipar as leveduras deste complexo com o iniciador (GTG)5 para verificar o perfil molecular e realizar uma análise cariotípica de seus cromossomos através da eletroforese em campo pulsado (PFGE) e encontramos diferenças principalmente nas linhagens de S. bayanus tanto intra quanto interespecíficas em ambas as técnicas utilizadas e graças a estas técnicas foi percebido que a linhagem CLIB 811 foi classificada equivocadamente como S. bayanus tendo perfil fingerprinting e cariótipo de S. cerevisiae. Também foi verificado a composição alélica para os loci gênicos MET2, URA1, LEU2, HO, YCK1, RPS24A e SNF1 de S. bayanus e constatado que essa levedura possui genes que vieram de S. uvarum.. Palavras-chaves: híbridos, cariotipagem, tipagem, Saccharomyces cerevisiae e marcadore molecular.. 11.

(12) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Abstract The complex Saccharomyces “sensu stricto” is currently composed of yeast species that correspond. to. Saccharomyces Saccharomyces. the. epithets. bayanus, kudriavzevii,. Saccharomyces Saccharomyces Saccharomyces. cerevisiae, Saccharomyces cariocanus, pastorianus,. mikatae. paradoxus,. Saccharomyces,. Saccharomyces. uvarum,. Saccharomyces carlsbergensis and Saccharomyces monacensis. The great physiological similarity between these species results from the high genetic similarity that allows up to the formation of interspecific hybrids which are viable, but sterile. Nowadays, taxonomists have used the techniques of molecular biology for the identification and differentiation of isolates of this group. Such techniques can generate valuable information on the composition and genomic arrangement of this group of yeasts. This being so, they can allow the understanding of the biological mechanisms of speciation and genetic adaptation to industrial environments. In this paper we typed some yeasts of this complex with primer (GTG)5 to determine the molecular profile and then did a karyotype analysis of their chromosomes by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Therefore, we found differences mainly in all strains of S. bayanus intra and interspecific in both techniques and thanks to them we realized that the strain CLIB 811 was mistakenly classified as S. bayanus after it had shown profile fingerprinting and karyotype of S. cerevisiae. Finally, we also verified the allelic composition for the genes loci MET2, URA1, LEU2, HO, YCK1, RPS24A and SNF1 of S. bayanus; observed that the genes of this yeast has came from S. uvarum.. Keywords: hybrids, karyotyping, typing, Saccharomyces cerevisiae and molecular marks.. 12.

(13) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Introdução As leveduras são microrganismos eucarionte e constituem um dos mais importantes grupos de microrganismos comercialmente explorados. Seu alto valor comercial decorre de sua aplicação biotecnológica em diversas indústrias, dentre as quais a de maior destaque é a que utiliza processos fermentativos (vinho, cerveja, cachaça, álcool combustível e pão). O gênero Saccharomyces inclui linhagens comumente utilizadas na indústria de fermentação, bem como espécies de interesse biotecnológico. A classificação das leveduras Saccharomyces sempre foi uma problemática em nível de espécies. Certo número de classificações têm sido propostas ao longo dos anos. Nomes de linhagens e espécies, como conseqüência, têm sofrido várias alterações que criaram a confusão entre os cientistas e tecnólogos de levedura da fermentação. Este gênero constitui um dos mais importantes gêneros de leveduras pela sua grande importância na produção de alimentos e bebidas. Estas leveduras apresentam reprodução assexuada por brotação multilateral e reprodução sexuada pela produção de esporos através da meiose celular. O gênero Saccharomyces é dividido em dois grandes grupos: o “sensu lato” e “sensu stricto”, sendo o primeiro grupo caracterizado pela ausência de atividade fermentativa. O grupo sensu stricto é composto de linhagens que apresentam fermentação baixa (“Lager”) ou alta (“Ale”) em função do tipo de fermentação relacionada à produção de cervejas. Entretanto, as leveduras pertencentes ao grupo “sensu stricto” apresentam características morfológicas e fisiológicas muito semelhantes, o que dificulta sua discriminação em nível de espécie, já que na taxonomia convencional utiliza-se de técnicas bioquímicas como assimilação e fermentação de certos açúcares. As técnicas em biologia molecular têm se mostrado como boas ferramentas para a identificação e diferenciação das linhagens em espécies. Neste trabalho foram utilizadas técnicas como eletroforese em campo pulsado (PFGE), ribotipagem por PCR, PCR-fingerprinting e RFLP no intuito de contribuir para diferenciação de linhagens de coleção pertencentes a este grupo. Os resultados mostraram que as técnicas empregadas são de grande valia para identificação das linhagens em espécie e diferenças entre linhagens da mesma espécie.. 13.

(14) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 1. Revisão de literatura 1.1.. As leveduras As leveduras são microrganismos eucariontes unicelulares pertencentes ao reino. Fungi, ao filo Ascomycota, à ordem Saccharomycetales (Alexopoulos et al. 1996). São heterotróficos, saprófitos ou parasitas; dependentes de carbono orgânico como fonte de energia e podem ser encontrados em associação com vegetais ou ainda no sistema digestório de animais, no solo em ambientes com pouca disponibilidade de água, bem como associados a qualquer substrato que lhe forneça o açúcar (Pahff, 1990; Alexopoulos et al., 1996; Lucena, 2004). Essas leveduras. constituem. o mais importante grupo de microrganismos. economicamente explorado pelo ser humano (Horii e Oettrer, 1998). Isto ocorre devido a sua importância para os processos fermentativos para produção de cerveja, pão, vinho e álcool combustível (Alexopoulos et al., 1996). As técnicas de engenharia metabólica de leveduras envolvidas em processos biotecnológicos apontam para uma terceira fase nos processos fermentativos. Através dessa nova ferramenta, tem-se procurado o melhoramento genético direcionado destes microrganismos com finalidade de se obter aumento no rendimento e qualidade da produção (Lucena, 2004).. 1.2. O gênero Saccharomyces O nome Saccharomyces significa “fungo do açúcar”, atualmente o gênero Saccharomyces inclui dois grandes grupos de leveduras, separados segundo características fisiológicas e filogenéticas, denominadas Saccharomyces “sensu lato” e Saccharomyces “sensu stricto”. As leveduras do complexo “sensu lato” são geneticamente muito distintas e possuem em comum baixa ou nenhuma atividade fermentativa, como é o caso das espécies S. kluyveri, S. exiguous, e S. castellii e S. servazzii (Walker, 1998). Dentro do grupo “sensu stricto”, algumas espécies de leveduras são bastante utilizadas, como S. cerevisiae na produção de pão, cerveja e vinho, S. bayanus e S. uvarum na produção de vinhos, S. pastorianus, S. carlsbergensis e S. monacensis na produção de cervejas e S. boulardii que é utilizado como probiótico e na suplementação alimentar. Estas. 14.

(15) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... leveduras são geralmente poliplóides, com algumas linhagens industriais apresentando diferentes graus de aneuploidia. As leveduras de cerveja são separadas em dois grupos: as linhagens do tipo “Ale” (S. cerevisiae) e as linhagens do tipo “Lager” (S. pastorianus e S. carlsbergensis). Estas linhagens “Lager” são classificadas como híbridos interespecíficos de S. cerevisiae e S. bayanus e são freqüentemente referidas como leveduras de fermentação baixa (“bottom fermenting yeasts”). Em contraste, as leveduras “Ale” são referidas como leveduras de fermentação alta (“top fermenting yeasts”) (Walker, 1998). Estas denominações se referem ao fato de que as leveduras sedimentam no fundo das dornas (fermentação baixa) ou se mantém em suspensão formando inclusive um biofilme na superfície do mosto (fermentação alta) durante a fermentação.. 1.3. Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo eucarioto mais utilizado para estudos genéticos (figura 1), este fato deve-se à facilidade e rapidez de seu crescimento, à existência de células haplóides e diplóides durante o seu ciclo de vida e ao seu pequeno genoma (Walker,1998). O genoma de S. cerevisiae, um dos primeiros genomas eu cariontes a ser totalmente seqüenciado, contém aproximadamente 13 Mb, com poucos introns nas seqüencias gênicas e pequenos trechos de DNA repetitivo (Oliver, 1996). O cariótipo de linhagens de laboratório de S. cerevisiae apresenta cerca de 16Mb, constituído de cromossomos entre metacêntricos, submetacêntricos a subtelocêntricos, e podendo ser separados através de eletroforese em campo pulsátil com os cromossomos variando entre 230 a 2000Kb (Loidl, 2003).. Figura 1. Células de Saccharomyces cerevisiae (imagem obtida pelo autor), aumento de 100x.. 15.

(16) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 1.4. O complexo Saccharomyces “sensu stricto” O complexo Saccharomyces “sensu stricto” é atualmente constituído por seis espécies de leveduras reconhecidas que correspondem a S. cerevisiae, S. paradoxus, S. bayanus, S. cariocanus, S. mikatae e S. kudriavzevii, e pelos híbridos interespecíficos S. pastorianus, S. uvarum, S. monacensis e S. carlsbergensis (Kurtzman e Robnett, 2003; Rainieri et al, 2003) (figura 2). Estas leveduras apresentam características bioquímicas e fisiológicas muito semelhantes, o que faz com o que a identificação de seus isolados a partir dos métodos bioquímicos convencionais seja uma tarefa muito difícil. Estas espécies de levedura são muito utilizadas do ponto de vista industrial, pois estão envolvidas na produção de bebidas alcoólicas fermentadas (cerveja, vinhos e cidras, dentre outras) e destiladas (cachaça e uísque, dentre outras) e a qualidade destas bebidas depende em grande parte da espécie e da linhagem utilizada, pois as células de levedura produzem, durante a fermentação, compostos que conferem aroma e sabor ao produto final (Querol et al, 2003; Rainieri et al, 2003). Portanto, a correta identificação das linhagens industriais e dos processos biológicos de interação entre elas tem relevância do ponto de vista comercial e biotecnológico, além de contribuir para o entendimento do processo de especiação do complexo Saccharomyces “sensu stricto”. A grande similaridade fisiológica entre estas espécies decorre da alta semelhança genética que permite até a formação de híbridos interespecíficos que são viáveis, embora estéreis (Naumov, 1996; Masneuf et al, 1998). A formação desses híbridos mostra que os genomas dessas espécies ainda são compatíveis. Atualmente, os taxonomistas têm se utilizado das técnicas de biologia molecular para a identificação e diferenciação dos isolados deste grupo (Masneuf et al, 1998; Casareloga et al, 2001; Kurtzman e Robnett, 2003; Dos Santos et al, 2007). Tais técnicas podem gerar valiosas informações sobre a composição e o arranjo genômico desse grupo de leveduras, permitindo o entendimento sobre os mecanismos de especiação biológica e de adaptação genética aos ambientes industriais.. 16.

(17) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Figura 2. Árvore filogenética estabelecida pelo alinhamento de MET2 (Fonte: Nguyen e Gaillardin, 2005).. 1.5. Diferenciação de espécies do complexo Saccharomyces “sensu stricto” A definição de espécie é um elemento-chave nos estudos biológicos de evolução e de biodiversidade, embora não seja algo muito claro especialmente em se tratando de fungos. Por ser um grupo constituído de espécies de leveduras extremamente próximas, a diferenciação das mesmas têm sido algo bastante complicado (Rainieri et al, 2003). Taylor et al (2000) apresenta uma revisão sobre os três conceitos que podem ser utilizados para fungos. O conceito morfológico de espécie (CME - Conceito morfológico de espécie) é o mais antigo e refere-se às diferenças entre caracteres morfológicos estabelecidos que separam as espécies. O conceito biológico de espécie clássico (CBE - Conceito biológico de espécie clássico) leva em consideração o cruzamento de indivíduos que geram descendentes férteis. O conceito filogenético de espécie (CFE - Conceito filogenético de espécie) define as espécies como grupos monofiléticos que apresentam histórias evolucionárias particulares em decorrência de delimitações geográficas. Testes morfológicos e fisiológicos têm sido empregados na diferenciação de leveduras em nível de espécie, o que comumente é referido como taxonomia convencional. Apesar de suas limitações, esses procedimentos ainda são utilizados na identificação e classificação das leveduras e são imprescindíveis na descrição de novas espécies. As possíveis razões para as limitações da taxonomia convencionais são: (1) a morfologia de levedura não é um caractere estável e freqüentemente varia entre leveduras da mesma espécie; (2) a distinção entre dois taxa é freqüentemente estabelecida em apenas uma ou duas características fisiológicas; (3) a maioria dos caracteres fisiológicos podem ser revertidos por uma simples mutação em um gene (Rainieri et al, 2003). As leveduras deste complexo são capazes de reprodução sexual, a partir da produção de células haplóides (esporos) derivadas de eventos meióticos, os quais conjugam entre si. 17.

(18) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... para restaurar o estado diplóide (figura 3). Os estudos de compatibilidade reprodutiva têm comprovado a existência de seis espécies válidas para o complexo. Os descendentes dos híbridos são em geral inférteis, com menos de 1% dos esporos viáveis (Naumov, 1996; Naumov et al, 2000). Isto mostra que existe uma barreira pós-zigótica entre as seis espécies pré-definidas. Entretanto, esta barreira não parece ser causada pelos mecanismos clássicos de incompatibilidade genética do tipo translocações (Coyne e Orr, 2004), já que estas espécies apresentam conjuntos cromossômicos colineares (Fischer et al, 2000). Esta incompatibilidade é pronunciada em híbridos diplóides (2N), mas pode ser superada em híbridos alotetraplóides (4N) que formam esporos diplóides férteis (Greig et al, 2002). Uma das alternativas para explicar a barreira pós-zigótica entre as espécies do complexo parece residir na divergência simples entre genes homólogos que leva à indução dos mecanismos de reparação de bases mal-emparelhadas (Mismatch Repair – MR) formadas a partir de eventos de recombinação recíproca (Liti e Louis, 2005), levando ao estado de aneuploidia nos gametas que impede sua viabilidade, contudo em muitos casos as linhagens deste complexo isoladas do ambiente natural ou usadas na indústria apresentam deficiência reprodutiva (Rainieri et al., 2003). Desta forma, a definição de espécies baseada na (in)fertilidade dos descendentes de um cruzamento, critério utilizado na definição de BSC nem sempre pode ser aplicada com sucesso para todas as linhagens (Naumov, 1996; Rainieri et al., 2003).. Figura 3. Representação esquemática das espécies de Saccharomyces “sensu stricto” e contribuição das espécies puras para os grupos híbridos (Fonte: Rainieri et al, 2003).. A maioria dos estudos de filogenia utiliza a comparação de seqüências de nucleotídeos dos genes que codificam as moléculas de RNA ribossômicos, os quais apresentam taxas de mutação diferenciadas. Por exemplo, as regiões transcritas internas (ITS) do agrupamento de genes que definem a subunidade menor dos ribossomos apresentam altas taxas de mutação e. 18.

(19) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... podem ser utilizadas na identificação de espécies, enquanto a seqüência de nucleotídeos do gene 18S é altamente conservada e pode ser utilizada na definição de gêneros (White et al., 1990). A seqüência do gene 26S também é muito conservada, entretanto existe uma região de aproximadamente 600 pb chamada de domínio variável D1/D2 que foi utilizada para redefinir a classificação das cerca de 500 espécies de leveduras do filo Ascomycota (Kurtzman e Robnett, 1998). Adicionalmente, essa análise estabeleceu também o limite genético entre as espécies como sendo duas leveduras que distam entre si em mais de 1% de divergência na seqüência de 600 nucleotídeos da região variável D1/D2, e este limite tem sido atualmente aplicado para a identificação das espécies atuais do filo Ascomycota bem como na identificação de espécies novas. Este procedimento se enquadra na definição PSC e reforça a taxonomia atual do complexo Saccharomyces “sensu stricto” como apresentando seis espécies e seus híbridos (Kurtzman e Robnett, 2003). Estudos de re-associação de DNA nuclear permitiram agrupar as leveduras em dois conjuntos: o grupo Cerevisiae que incluiu os isolados com nível de reassociação com o DNA genômico da linhagem-tipo de S. cerevisiae CBS 1171 maior do que 89% e o grupo Bayanus que incluiu os isolados com nível de reassociação com o DNA nuclear da linhagem-tipo de S. bayanus CBS 380 superior a 72%. Os taxa S. paradoxus e S. pastorianus não puderam ser separadas e foram incluídas nos conjuntos Cerevisiae e Bayanus, respectivamente (McCullough et al., 1998). Estes dados são reproduzidos pela análise do polimorfismo de restrição do loco ITS1-5.8S-ITS2, que separa o grupo Cerevisiae (S. cerevisiae, S. paradoxus e S. cariocanus) do grupo Bayanus (S. bayanus, S. mikatae e S. kudriavzevii) (Montrocher et al, 1998; Dos Santos et al, 2007). Entretanto, mesmo com a aplicação destes conceitos e a utilização de ferramentas moleculares de análise genética, a taxonomia e a definição de espécie dentro do complexo ainda é contestada. A própria espécie S. bayanus tem sido subdividida em dois grupos: S. bayanus var. bayanus representada pela linhagem-tipo CBS380 e várias culturas híbridas e S. bayanus var. uvarum (ou apenas S. uvarum) que já foi considerada uma espécie distinta (Rainieri et al, 2003). Já S. uvarum perdera seu status de espécie distinta na última classificação proposta por Barnett et al (2000), passando a S. bayanus var. uvarum, mas já teve seu status restaurado algumas vezes nos últimos anos na literatura (Pulvirenti et al, 2000; Nguyen e Gaillardin, 2005). Entretanto, os dados recorrentes na literatura mostram que esta taxonomia depende do conjunto de linhagens que está sendo testado nos artigos científicos (Masneuf et al, 1996; Masneuf et al, 1998; Pulvirenti et al, 2000; Casaregola et al, 2001; Torriani et al, 2004; Nguyen e Gaillardin, 2005; Dos Santos et al, 2007), o que torna o estudo taxonômico e evolutivo deste grupo ainda mais complexo.. 19.

(20) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 1.6. Os híbridos do complexo Saccharomyces “sensu stricto”e o problema da especiação A constituição híbrida desses taxa é evidenciada com o uso de marcadores moleculares que mostram a presença dos dois alelos parentais presentes (Casaregola et al, 2001; Torriani et al, 2004; Dos Santos et al, 2007). Estes dados reforçam aqueles de formação de linhagens híbridas a partir de cruzamentos em laboratório (Naumov, 1987; Naumov et al, 2000). Isto mostra que não há uma barreira pré-zigótica e os genomas de ambos parentais podem conviver no híbrido, dado que as espécies são geneticamente muito próximas e os conjuntos cromossômicos são colineares. A grande maioria dos híbridos neste complexo parecem ser produtos do cruzamento entre um parental S. cerevisiae e um parental do grupo Bayanus, com a maior parte do seu genoma derivado do parental não-Saccharomyces cerevisiae. A hibridização parece ser um evento complexo que pode envolver dois ou até mesmo três possíveis parentais, como mostra ser o caso da linhagem CID1 envolvida na produção de sidras na França (Groth et al. 1999) e vinho na Espanha (González et al 2006), e pode ainda envolver espécies do complexo Saccharomyces “sensu stricto” ou “sensu lato” (Marinoni et al. 1999). A levedura S. carlsbergensis, previamente considerada como sinônimo de S. pastorianus, é uma levedura tetraplóide gerada a partir de uma hibridização entre S. cerevisiae e um membro do complexo S. bayanus, provavelmente S. monascensis (Hansen and KiellandBrandt 1994). Ambas S. carlsbergensis CLIB 176 e S. monacensis CLIB 180 consideradas linhagens-tipo foram consideradas sinônimos da S. pastorianus CBS 1513 e CBS 1508, respectivamente (Casaregola et al. 2001). De Barros Lopes et al. (2002) mostraram por análise de AFLP que S. carlsbergensis e S. monacensis são 35% e 30% similar a S. pastorianus, respectivamente. Desta forma, os autores sugerem que após os eventos de hibridização devem ocorrer perdas genômicas ou rearranjos genéticos que produziram as diferentes linhagens de S. pastorianus. As linhagens S. pastorianus Y12171, S. carlsbergensis CLIB 176 e S. monacensis CLIB 180 produziram padrões de PCR-fingerprinting completamente distintos (Dos Santos et al, 2007). Isto reforça a individualidade de cada híbrido mesmo que formado pelos mesmos parentais. A partir disso, parece que estes marcadores não seriam úteis na correta identificação dos híbridos, já que cada tipo de híbrido apresentaria padrões de amplificação distintos. Entretanto, duas outras utilidades foram propostas para este método. Primeiro, o padrão individual seria útil para definir o caráter híbrido de um isolado. Neste contexto, foi definido como híbrido um isolado do processo de. 20.

(21) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... fermentação alcoólica industrial que apresentou padrões de restrição do lócus de RNA ribossomal semelhante ao grupo Cerevisiae, mas que apresentaram padrões de PCRfingerprinting diferente de S. cerevisiae (Dos Santos et al, 2007). Segundo este método permite seguir a dispersão destes tipos de células. Neste caso foi proposto que a levedura GDB 777 isolada da produção de vinho em Minas Gerais é semelhante a S. monacensis CLIB 180. No banco de linhagens da coleção CBS, S. monacensis é representada apenas pela linhagem CBS 1503 (correspondente a CLIB 180), isolada por Hansen no começo do século XX na cervejaria Carlsberg da Dinamarca juntamente com a linhagem S. carlsbergensis 1513 (correspondente a CLIB 176). Assim, a linhagem GDB 777 é tida como resultado da variação genética das células de CLIB 180 trazida para o Brasil de algum produtor local (Dos Santos et al 2007). Pelo exposto, a formação de híbridos interespecíficos dentro do complexo “sensu stricto” revela que estas espécies devem ser bastante recentes, já apresentando barreira pószigótica, mas não pré-zigótica. Os mecanismos que definem estes limites ainda não estão definidos e entender a compatibilidade genômica associada à infertilidade do híbrido pode auxiliar tanto no entendimento da evolução deste grupo de leveduras como propiciar o desenvolvimento de linhagens industriais. Outro dado interessante foi a identificação de um isolado de fermentação alcoólica industrial identificado como S. cerevisiae com o uso de marcadores alelo-específicos, mas com padrão de amplificação do tipo fingerprinting diferente de todos os representantes do complexo, o que indica seu caráter híbrido (Dos Santos et al 2007). Isto indica que hibridização também ocorre durante a produção de álcool combustível.. 1.7. Técnicas moleculares: tipagem por PCR-microssatélite, cariotipagem, ribotipagem por PCR e rDNA-RFLP e PCR-RFLP 1.7.1. Tipagem por PCR-microssatélite. Microssatélites são seqüências curtas de até seis nucleotídeos repetidas em bloco encontradas no genoma de vários organismos. A utilização deste tipo de seqüência como marcador molecular pode ser posto de duas maneiras: 1) a utilização de iniciadores externos aos microssatélites; e 2) a utilização da própria seqüência microssatélite como iniciador de amplificação do DNA. No segundo caso, as seqüências de nucleotídeos localizadas entre as. 21.

(22) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... microssatélites são amplificadas, e este método é chamado de amplificação de seqüências simples entre repetições de DNA (Inter Simple Sequence Repeats – ISSR). O polimorfismo destas regiões entre repetições mostrou ser uma excelente ferramenta de discriminação intraespecífica para isolados de S. cerevisiae industriais (Lieckfeldt et al.,1993). O motivo (GTG)5 vem sendo utilizado como iniciador na tipagem e estudo populacional molecular de leveduras do processo de fermentação alcoólica para produção de álcool carburante pelo grupo de Genética de Microrganismos da Universidade Federal de Pernambuco. Essa metodologia permite a discriminação a nível intra e interespecífico, além de ser hoje a técnica mais rápida e precisa para discriminar linhagens de leveduras, o que é bastante interessante para o processo industrial (Lieckfeldt et al., 1993; Meyer e Mitchell, 1995; Weising et al., 1995; Baleiras Couto et al., 1996; Silva Filho, 2003). 1.7.2. Cariotipagem. Esta técnica consiste na separação de moléculas muito grandes de DNA, como os cromossomos, através da eletroforese. A cariotipagem molecular através da eletroforese de campo pulsátil (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE) foi criada por Schwarz e Cantor em 1984, esta técnica é capaz de separar moléculas de DNA com cerca de 10 Mb de tamanho (Walz, 1995), e está baseada na utilização de vários campos elétricos oscilantes orientados em diferentes direções. Os cromossomos dos fungos de um modo geral são muito pequenos para serem visualizados com técnicas citológicas. A cariotipagem por PFGE tem sido utilizada pela taxonomia pelo seu alto grau de polimorfismo, tanto em número quanto em tamanho dos cromossomos (Lucena, 2004).. 1.7.3. Ribotipagem por PCR e DNAr-RFLP. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica, in vitro, resultante da amplificação de certo fragmento de DNA com o auxílio de uma enzima polimerase termorresistente, desoxiribonucleotídeos trifosfatados (dNTP) e uns oligonucleotídeos chamados de iniciadores. Estes iniciadores hibridizam-se com a região complementar do DNA alvo para produzir bilhões de cópias dessa seqüência em poucas horas. A desnaturação da dupla-hélice do DNA, o emparelhamento dos iniciadores com a seqüência alvo pela redução da temperatura da mistura e a extensão dos iniciadores pela DNA polimerase, se processam automaticamente em um equipamento chamado termociclador (Newton e Graham,. 22.

(23) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 1997; Silva-Filho, 2003). O polimorfismo de tamanhos dos fragmentos de restrição (RFLP) são obtidos por cortes na fita de DNA realizados por enzimas de restrição que reconhecem sítios específicos. Os fragmentos podem ser separados através de eletroforese em gel de agarose e visualizados num transluminador depois de corados com brometo de etídeo (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Em S. cerevisiae quatro diferentes genes do DNAr (5S, 5.8S, 18S e 26S) aparecem agrupados em blocos, estando repetidos em dezenas de cópias no genoma. A Figura 4 apresenta a arquitetura do agrupamento gênico do DNA ribossomal. As regiões ITS1 e ITS2 representam seqüências internas transcritas que não são traduzidas para as subunidades do RNA ribossomal. A região ITS1-5.8S- ITS2 pode ser amplificada através de iniciadores universais homólogos às seqüências finais dos genes 18S e 26S. Como os ribossomos são organelas que estão presentes em todos os organismos, desde os procarionte até os eucariontes superiores, parte da molécula apresenta-se altamente conservada, alternando com regiões variáveis,. demonstrando baixo polimorfismo intra-específico e. alto polimorfismo. interespecífico (White et al.,1990; Esteve-Zarzoso et al., 1999; Garro et al., 1999; Silva-Filho, 2003).. Figura 4. Representação da região ITS (ITS1-5.8S-ITS2) flanqueada pelos iniciadores universais ITS4 e ITS5. Também a região IGS (IGS1-5S-IGS2) flanqueada pelos iniciadores JV51 e JV52 (Fonte: Silva-Filho, 2003).. 1.8. Considerações O complexo Saccharomyces “sensu stricto” apresenta linhagens distintas, entretanto suas características morfológicas e fisiológicas são muito similares, o que dificulta a. 23.

(24) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... identificação por técnicas convencionais. As técnicas moleculares como tipagem e cariotipagem têm-se mostrado bem úteis para identificação das linhagens em nível de espécie, sendo a tipagem uma técnica rápida (em menos de oito horas já são obtidos resultados) e menos custosa em relação à cariotipagem, que requer bastante tempo para obtenção de resultados (tempo mínimo de vinte e quatro horas). A amplificação da região ITS do DNA ribossomal por apresentar um padrão espécie-específico nos dá a certeza de que as linhagens são pertencentes ao mesmo grupo, no entanto não define o nível de espécie. Por tanto, este trabalho utiliza-se das técnicas apresentadas para identificar com precisão as linhagens utilizadas do complexo Saccharomyces “sensu stricto”. 24.

(25) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 2. Objetivos 2.1. Objetivo geral Avaliar diferentes linhagens do complexo Saccharomyces “sensu stricto” da coleção CIRM/França quanto à composição alélica para os loci ITS e YNL277w a partir da análise de RFLP e quanto à composição genômica total pelo uso de marcadores de PCR-fingerprinting e composição cromossômica por eletroforese de campo pulsado (PFGE) em sistema CHEF.. 2.2. Objetivos específicos a) Analisar a constituição genética de linhagens da levedura S. bayanus. b) Colaborar com a identificação molecular de linhagens depositadas na coleção CLIB como pertencentes a espécie S. bayanus. c) Colaborar com a taxonomia molecular de S. bayanus e com a definição de seu estado taxonômico.. 25.

(26) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 3. Materiais e métodos 3.1. Linhagens e meio de cultura: As linhagens do complexo Saccharomyces “sensu stricto” estão disponíveis no Laboratório de Genética de Microrganismos da Universidade Federal de Pernambuco e encontram-se listadas na tabela 1. As linhagens foram cultivadas em meio líquido YPD (extrato de levedura 1%, peptona 2%, glicose 2%) e conservadas em placas de YPD+ágar 2%.. Tabela 1. Espécies, linhagens e coleção das leveduras utilizadas neste trabalho. Espécie Linhagem Coleção S. cerevisiae JP1 Genetech T S. uvarum 251/395 CLIB/CBS S. uvarum* 533 CLIB T 181/380 S. bayanus CLIB/CBS 252/1546 S. bayanus CLIB/CBS 254/1505 S. bayanus CLIB/CBS 256 S. bayanus CLIB 811 S. bayanus CLIB S.cerevisiae size marker bio rad BIO RAD T. : linhagem tipo *: linhagem haplóide. 26.

(27) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 3.2. Lista de iniciadores utilizados Os iniciadores utilizados encontram-se na tabela 2. Tabela 2. Iniciadores utilizados como marcadores moleculares. Iniciador Função Seqüência do iniciador GTG5 GTGGTGGTGGTGGTG ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAA URA1 Dihidroorotato desidrogenase F - CTTCCGTACCAAACATGACA (produção de uracil – sem O2) R – CCGATAATTAAATGCTGTTCA LEU2 2-aminoadipato redutase F – ACCATTCTAATGTCTGCCCCT (metabolismo de leucina) R - GAGAATCTTTTTAAGCAAGGA MET2 Homosserina acetiltransferase F – CGAAAACGCTCCAAGAGCTGG (biossítese de metionina) R – GACCACGATATGCACCAGGCAG HO Endonuclease HO responsável F – ATGCTTTCTGAAAACACGAC pelo homotalismo R – ACACATTTTAGCAGATGCG YCK1 Homólogo de cinase I de F – TTTTCCTGCTCTCCTCCTCC caseína de levedura R – CGGTAGTCTTGCAAAAAATG RPS24A Proteína ribossomal da F – AGATTAAGCAGAAATGGTATG subunidade menor R - TTTGCTTAATCGGCGTTACG SNF1 Proteína ativadora dos genes F- TCAACATGAGCAGTAACAACA reprimidos por glicose R - CGTTCCACCATCAATTGCTT. 3.3. Extração de DNA As células de leveduras foram cultivadas em meio YPD por 16 h a 30ºC e DNA total foi extraído de 1ml de uma cultura de células por centrifugação e suspensas em 600µl tampão de lise (0,2M Tris, HCl, 25mM EDTA, 1% SDS, 25mM NaCl, pH8). Após incubação a 65 º C por 30 min com agitação a cada 10min, o lisado foi extraído uma vez com fenol:clorofórmio (1:1), centrifugado a 13.000 rpm por 15 min e a fase aquosa foi extraída e suspensa com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e centrifugado como descrito acima. O DNA foi precipitado a partir da fase aquosa por 2 h a -20ºC com dois volumes de etanol gelado, lavado com etanol 70%, secado e suspenso em 100µl tampão TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, PH8) de acordo com Silva-Filho et al. (2005a).. 3.4. Tipagem Análises de PCR-fingerprinting foram realizadas utilizando o iniciador (GTG)5. As reações de amplificação de DNA continham 50 ng, 5 pmols de iniciador, 75 nmoles MgCl2, 12,5 nmoles cada dNTP, 0,625 µg BSA e 1,25 U Taq DNA polimerase em 1x tampão de PCR. 27.

(28) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... (Invitrogen Co.) para 25 µl de volume final. Os tubos de amplificação foram previamente aquecidos a 94ºC por 5 min seguido por 40 ciclos de 94ºC por 15s, 55ºC por 45s e 72ºC por 90s, com extensão final a 72ºC por 6 min. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em géis de agarose 1,3% em TBE 0,5X a 75V por 150 min como de acordo com Silva-Filho et al. (2005a).. 3.5. Cariotipagem por eletroforese em campo pulsado (PFGE) Cultura das leveduras. Células de leveduras foram cultivadas por 16h em 25ml de YPD com a temperatura ambiente (em torno de 30ºC) em agitador rotatório a 120 rpm, a diluição da cultura foi de 1/20: 50μl de cultura + 950μl de água destilada estéril e depois feita uma leitura da DO600nm para a contagem do número de células. Em seguida as células foram centrifugadas por 5 min a 2000 rpm e suspensas com 3ml de EDTA a 50mM(0,05M). Preparação dos “plugs”. As células que foram previamente tratadas com EDTA foram suspensas em uma solução contendo CPES (ácido cítrico, fosfato de sódio, sorbitol e EDTA)-DTT 500mM zymoliase 20mg e incubadas a 37°C por 5min e depois foi adicionado 1ml de agarose de baixo ponto de fusão a 1,1% e colocados no molde para solidificar. Depois de solidificados, os plugs foram suspensos em solução CPE (ácido cítrico, fosfato de sódio e EDTA) e incubados a 37°C por 3 horas. Logo após foram lavadas com lauril sulfato de sódio 1%, EDTA 500mM e TRIS pH8,0 10mM e incubadas overnight. Foram feitas 3 lavagens em tampão TE, uma sendo a 50°C e as outras em temperatura ambiente por 30min cada. Os plugs depois de prontos foram estocados em EDTA 0,25M a 4°C.. Preparação do equipamento:. O pulso inicial foi de 40s e o final de 120s, com 6V/cm com uma duração de 24 horas.. 3.6. Ribotipagem por PCR e DNAr-RFLP. 28.

(29) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... O locus ITS1-5.8S-ITS2 do DNAr foi amplificado com iniciadores ITS4 e ITS5. A composição da mistura para o preparo da PCR continha 1X tampão de PCR (Invitrogen Co.), 1µl de amostra de DNA, 37,5 nmol MgCl2, 12,5 pmol de cada iniciador, 5 nmol de dNTP, 0,625µg BSA e 1,25 U Taq DNA polimerase para um volume final de 25µl. Foi feita uma desnaturação inicial de 94°C por 6min seguido por 35 ciclos de 94°C por 20s, 56°C por 20s e 72°C por 60s, com uma extensão a 72° por 5min como descrito por Souza-Liberal et al. (2005). Para análise de RFLP foi utilizado 1µl do amplicon mais 1 U da enzima de restrição HaeIII para cada 1000µg de DNA no amplicon e adicionado do tampão específico para enzima, foi incubado por 2 horas a 37°C de acordo com Hansen e Kielland-Brandt (1994) e Casaregola et al. (2001).. 3.7. PCR-RFLP e análise do gene MET2 A análise de PCR-RFLP para o gene MET2 foi realizada com uma temperatura inicial de 94°C por 5 min e 25 ciclos of 1 min a 94°C, 2 min a 50°C, e 3 min a 72°C, seguidos de um ciclo de 72°C for 10 min de acordo com Masneuf et al. 1998. Utilizou-se as enzimas de restrição EcoRI e PstI para análise de RFLP utilizando 1µl do amplicon contendo até 1000µg de DNA mais ½µl da enzima de restrição para cada no amplicon e adicionado do tampão específico para enzima, foi incubado por 2 horas a 37°C.. 3.8. PCR-marcadores moleculares As linhagens do complexo foram submetidas a amplificações por PCR com ciclagem, otimizado por Souza-Liberal (2010), de 94ºC por 5min; 94ºC por 1min, 45ºC-50ºC por 1min, 72ºC por 2min, com extensão final a 72ºC por 7min. O material foi analisado em gel de agarose 1.3% 75v por 1 hora e 30 minutos e corado em brometo de etídio.. 29.

(30) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 4. Resultados. 4.1. Tipagem Na figura 5 podemos ver que nas colunas 1, 2 e 3 estão três linhagens de S. bayanus e nota-se que apesar de serem a mesma espécie, foram observados distintos perfis de amplificação com o iniciador (GTG)5. As colunas 4 e 7 (S. bayanus e S. cerevisiae, respectivamente) demonstram perfis bem similares apesar de terem sido classificadas como espécies diferentes, sugerindo algum equívoco na identificação convencional. Já as colunas 5 e 6 estão duas linhagens de S. uvarum apresentando o mesmo perfil.. Figura 5. Eletroforese de fingerprinting (GTG) 5. M: marcador 100bp; 1: CLIB 252 S. bayanus; 2: CLIB 256 S. bayanus; 3: CLIB 254 S. bayanus; 4: CLIB 811 S. bayanus; 5: CLIB 251 S. uvarum; 6: CLIB 533 S. uvarum; 7: JP1 S. cerevisiae.. 30.

(31) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 4.2 Cariotipagem. O cariótipo mostrado na figura 6 demonstra o mesmo comportamento dos perfis das linhagens como mostrado na figura 5, ou seja, as colunas 1 e 2 que são, respectivamente, JP1 S. cerevisiae e CLIB 811 S. bayanus apresentam o mesmo cariótipo, reforçando a idéia de que sejam a mesma espécie; nas colunas 3, 4 e 5 vemos que as linhagens S. bayanus também comportam-se diferentes, entretanto é visto que a linhagem da coluna 3 (CLIB 252) apresenta um cariótipo levemente distinto em relação as demais linhagens de S.bayanus (CLIB 254 e 256), nota-se que a variação cromossômica é maior nos cromossomos mais leves situados entre 225-450 Kb. Já as linhagens S. uvarum, representadas pelas colunas 6 e 7, apresentam o mesmo cariótipo sem variações. Percebe-se uma banda de 1300 Kb (setas brancas) característica nas linhagens de S. bayanus (colunas 3-5) e na área compreendida entre 225450Kb (região entre os colchetes) estas linhagens apresentaram algumas variações na quantidade de cromossomos.. Figura 6. Eletroforese em campo pulsado para separação cromossômica. M: Marcador; 1: JP1 S. cerevisiae; 2: CLIB 811 S. bayanus; 3: CLIB 252 S. bayanus; 4: CLIB 254 S. bayanus; 5: CLIB 256 S. bayanus; 6: CLIB 533 S. uvarum; 7: CLIB 251 S. uvarum. .. 31.

(32) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 4.3 Ribotipagem por PCR e DNAr-RFLP. A ribotipagem por PCR da região ITS no gênero Saccharomyces apresenta uma banda com 850pb que é representada pela coluna N da figura 7. Essa banda foi digerida pela enzima HaeIII gerando dois padrões de digestão: o padrão grupo cerevisiae (colunas 1 e 2) e o padrão grupo bayanus (colunas 3 a 7). As colunas 1 e 2 são representadas por JP1 S. cerevisiae e CLIB 811 S. bayanus, respectivamente, mostrando mais uma vez que essas duas linhagens são a mesma espécie. O grupo bayanus está composto pelas demais linhagens de S. bayanus (CLIB 252, 254 e 256) e as duas S. uvarum (CLIB 533 e 251) que correspondem às colunas 3 a 7.. Figura 7. Eletroforese de RFLP da região ITS. N: DNA não digerido; M: marcador 100pb; 01: JP1 S. cerevisiae; 02: CLIB 811 S. bayanus; 03: CLIB 252 S. bayanus; 04: CLIB 254 S. bayanus; 05: CLIB 256 S. bayanus; 06: CLIB 533 S. uvarum; 07: CLIB 251 S. uvarum.. 32.

(33) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 4.4. PCR e análise do gene URA1 As linhagens JP1 e CLIB 811 apresentaram a amplificação do gene (figura 8) com peso molecular de 944pb, entretanto as demais linhagens não aplificaram o gene.. Figura 8. Eletroforese do gene URA1. M1: Marcador; 1: JP1 S. cerevisiae; 2: CLIB 811 S. bayanus; 3: CLIB 252 S. bayanus; 4: CLIB 254 S. bayanus; 5: CLIB 256 S. bayanus; 6: CLIB 533 S. uvarum; 7: CLIB 251 S. uvarum.. 4.5. PCR e análise do gene LEU2 A amplificação do gene LEU2 mostrou que as linhagens apresentam duas bandas com pesos moleculares diferentes, uma banda mais pesada (cerca de 1100pb) com as linhagens JP1 e CLIB 811 (colunas 1 e 2) e uma banda mais leve (cerca de 800pb) que compreende as linhagens CLIB 252, 256, 533 e 251 (colunas 3, 5, 6 e 7), contudo a linhagem CLIB 254 não apresentou amplificação para esse gene (figura 9).. 33.

(34) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Figura 9. Eletroforese do gene LEU2. M: Marcador; 1: JP1 S. cervisiae; 2: CLIB 811 S. bayanus; 3: CLIB 252 S. bayanus; 4: CLIB 254 S. bayanus; 5: CLIB 256 S. bayanus; 6: CLIB 533 S. uvarum; 7: CLIB 251 S. uvarum.. 4.6. PCR e análise dos genes HO, YCK1, RPS24A e SNF1 As linhagens JP1 e CLIB 811 apresentaram amplificação para todos os iniciadores utilizados (figuras 10 a 13, respectivamente), HO com 1760pb, YCK1 com 1616pb, RPS24A com 873pb e SNF1 1901pb. As demais linhagens de S. bayanus não amplificaram os genes com exceção do gene RPS24A (figura 12). Notou-se que o tamanho dos fragmentos em todas as linhagens do gene RPS24A apresentam o mesmo peso molecular de 873pb.. Figura 10. Eletroforese do gene HO. M: Marcador; 1: JP1 S. cerevisiae; 2: CLIB 811 S. bayanus; 3: CLIB 252 S. bayanus; 4: CLIB 254 S. bayanus; 5: CLIB 256 S. bayanus.. 34.

(35) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Figura 11. Eletroforese do gene YCK1 M: Marcador; a: JP1 S. cerevisiae; b: CLIB 811 S. bayanus; c: CLIB 252 S. bayanus; d: CLIB 254 S. bayanus; e: CLIB 256 S. bayanus.. Figura 12. Eletroforese do gene RPS24A M: Marcador; 6: JP1 S. cerevisiae; 7: CLIB 811 S. bayanus; 8: CLIB 252 S. bayanus; 9: CLIB 254 S. bayanus; 10: CLIB 256 S. bayanus.. Figura 13 Eletroforese do gene SNF1 M: Marcador; f: JP1 S. cerevisiae; g: CLIB 811 S. bayanus; h: CLIB 252 S. bayanus; i: CLIB 254 S. bayanus; j: CLIB 256 S. bayanus.. 35.

(36) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 4.7. PCR-RFLP e análise do gene MET2 A banda do gene MET2 possui 600pb como identificado na coluna 1 da figura 14. Esta coluna está representada pela JP1 S. cerevisiae. Não houve amplificação do gene da levedura S. bayanus CLIB 181 como pode ser observado na coluna 2. A coluna 3 é apenas um controle negativo. As bandas de S. cerevisiae (JP1) e S. bayanus (CLIB 811) apresentam-se digeridas pela enzima de restrição EcoRI (colunas e1 e e2, respectivamente) as demais colunas da primeira linha não foram digeridas pela enzima. Na segunda linha da figura 14 foi utilizada a enzima PstI. É visto que as colunas p1 e p2 não foram digeridas e as colunas p5, p7 e p8 foram digeridas (CLIB 256 S. bayanus, CLIB 533 S. uvarum e CLIB 251 S.uvarum), na coluna p5 nota-se que ela apresenta três fragmentos ao invés de dois como os que ocorrem nas colunas p7 e p8. As colunas p3 e p4 (S. bayanus CLIB 252 e 254) também não foram digeridas por ambas as enzimas.. Figura 14. Eletroforese de RFLP do gene MET2 M: 100pb; 1: JP1 S. cerevisiae não digerido; 2: CLIB 181 S. bayanus não amplificado; 3: controle negativo. Digestão com EcoRI: e1: JP1 S. cerevisiae; e2: CLIB 811 S. bayanus; e3: CLIB 252 S. bayanus; e4: CLIB 254 S. bayanus; e5: CLIB 256 S. bayanus; e6: CLIB 181 S. bayanus; e7: CLIB 533 S. uvarum; e8: CLIB 251 S. uvarum. Digestão com PstI: p1: JP1 S. cerevisiae; p2: CLIB 811 S. bayanus; p3: CLIB 252 S. bayanus; p4: CLIB 254 S. bayanus; p5: CLIB 256 S. bayanus; p6: CLIB 181 S. bayanus; p7: CLIB 533 S. uvarum; p8: CLIB 251 S. uvarum.. 36.

(37) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 5. Discussão: Na análise das linhagens pelo método PCR-fingerprint (GTG)5 foi visto que nem todas as linhagens da mesma espécie apresentaram o mesmo padrão de bandas como o ocorrido com as linhagens de S. uvarum, entretanto foi visto que as linhagens S. bayanus CLIB 811 e S. cerevisiae JP1 apresentam padrão similar de bandas estando elas classificadas como espécies diferentes. Dos Santos et al (2007) mostram que as linhagens da mesma espécie apresentam o mesmo perfil, o que não foi observado neste trabalho. Sugerimos que as linhagens de S. bayanus sejam híbridas (com exceção da linhagem CLIB 811), pois apresentam perfis diferentes, com algumas bandas em comum. A cariotipagem por eletroforese tem sido amplamente utilizada para caracterizar a viabilidade dos cromossomos entre as linhagens de Saccharomyces (Naumov et al., 1993; Schütz & Gafner, 1994). Esta técnica tem sido aplicada com sucesso para revelar rearranjo cromossômico interespecífico dentro do gênero Saccharomyces (Ryu et al., 1996; de Barros Lopes et al., 2002) e para caracterizar as linhagens de leveduras híbridas (Yamagishi & Ogata, 1999). O perfil encontrado na levedura S. cerevisiae JP1 é idêntico ao que Lucena et al (2007) descrevem para essa levedura, entretanto os autores afirmam que JP1 mostrou um alto grau de polimorfismo cromossômico devido ao ambiente de estresse que é encontrado nas dornas fermentativas das indústrias alcooleiras. As linhagens de S. uvarum comportam-se de uma forma homogênea e formam um grupo natural dentro do complexo Saccharomyces “sensu stricto”, apresentando duas bandas características na área entre 225 e 365 Kb (Rainiere et al, 1999), o que foi observado nas linhagens CLIB 251 e CLIB 533. Nota-se que as linhagens de S. bayanus apresentam uma banda característica de 1300 Kb, as linhagens CLIB 252 e 254 mostraram o mesmo perfil descrito por Naumova et al. (2005) e a CLIB 256 mostrou um perfil levemente diferentes das duas outras linhagens. Na área entre 225-365 Kb apresentam de três ou mais bandas de cromossomos pequenos de acordo com Naumov et al. (2001) para as três linhagens diferente das linhagens de S. uvarum que possuem apenas duas bandas de cromossomos. As diferenças cromossômicas entre S. cerevisiae e S. bayanus é resultante de rearranjos por translocação (González et al, 2006), entretanto o autor não especifica qual é o tipo de S. bayanus se é S. bayanus var bayanus ou se é S. bayanus var uvarum.. 37.

(38) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... Dos Santos et al. (2007) separa o complexo Saccharomyces “sensu stricto” em dois grandes grupos: o grupo cerevisiae e o grupo bayanus. Dentro deste complexo, a ribotipagem por PCR apresenta uma banda padrão de 850pb e essa divisão é dada devido à digestão deste fragmento pela enzima de restrição HaeIII, gerando quatro fragmentos de 325pb, 230pb, 175pb e 125pb para o grupo cerevisiae e 3 fragmentos de 495pb, 230pb e 125pb para o grupo bayanus. Como pode ser visto, a figura 7 mostra que o padrão de digestão da linhagem CLIB 811 S. bayanus (coluna 2) é o padrão do grupo cerevisiae, mostrando mais uma vez que esta linhagem deve ser uma Saccharomyces cerevisiae e não Saccharomyces bayanus como está atualmente classificada. As demais linhagens apresentam o padrão do grupo bayanus como demonstrado por Dos Santos et al. (2007). A amplificação dos genes URA1, HO, YCK1 e SNF1 só ocorreram nas linhagens JP1 e CLIB 811 enquanto que as demais linhagens não apresentaram o fragmento amplificado, mais um indício de que a linhagem CLIB 811 seja Saccharomyces cerevisiae e não Saccharomyces bayanus. Apesar dos iniciadores utilizados serem para Saccharomyces cerevisiae, os genes LEU2 e RPS24A amplificaram nas demais linhagens e como foi visto na figura 9, as linhagens JP1 e CLIB 811 apresentaram um fragmento com 1100pb e as demais linhagens, com exceção de CLIB 254 que não amplificou, apresentaram um fragmento com 800pb. Isso demonstra que esse gene presente nas linhagens de S. bayanus seja proveniente de seu parental S. uvarum o que aponta para um caráter híbrido de S. bayanus. Em relação ao gene RPS24A, é visto que as linhagens de JP1, CLIB 811, 252, 254 e 256 apresentaram um fragmento de mesmo peso molecular e isso pode indicar, para as linhagens CLIB 252, 254 e 256, que esse gene possa ter vindo de um parental S. cerevisiae sugerindo que essas linhagens tenham surgido de um evento de hibridização com três parentais como o ocorrido com as linhagens CID1 e S6U que fermentam vinho e cidra (Masneuf et al., 1998) já que para os demais genes não ocorreu amplificação e isso sugere que o alelo para os genes seja de um parental não-S. cerevisiae. A análise do gene MET2 através de PCR-RFLP é baseada nos padrões de restrição do próprio MET2 em S. cerevisiae e S. bayanus (Masneuf et al., 1996). A enzima de restrição EcoRI corta fragmentos do gene MET2 oriundos de S. cerevisiae enquanto que a PstI corta apenas os fragmentos vindos de S. uvarum (Masneuf et al., 1996 e Masneuf et al.,1998). A digestão dos fragmentos de MET2 das linhagens JP1 e CLIB 811 feita com a EcoRI segue o padrão encontrado por Masneuf et al., 1996 e Masneuf et al., 1998. Esse é mais um dado indicando que CLIB 811 não é S. bayanus, enquanto que os demais fragmentos das outras. 38.

(39) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... linhagens não foram digeridos indicando que não apresentam parental S. cerevisiea, no caso das linhagens híbridas. Na digestão com PstI o DNA amplificado do gene MET2 das linhagens JP1 e CLIB 811 permaneceram intactas, enquanto as linhagens CLIB 251, 256 e 533 [S. uvarum(linhagem tipo), S. bayanus e S. uvarum, respectivamente] foram digeridas, além disso percebe-se uma banda extra na linhagem CLIB 256 que não foi digerida indicando que essa levedura possui um dos alelos de outra levedura que não é S. uvarum e nem S. cerevisiae já que a mesma não apresentou digestão pela enzima EcoRI. Esse padrão de uma terceira banda não digerida foi apresentado pelas linhagens híbridas que fermentam cidra e vinho por Masneuf et al., (1998) e Le Juene et al. (2006). Dois pontos importantes que devem ser ressaltados é que: (i) a linhagem tipo CLIB 181 não apresentou amplificação do gene MET2; e (ii) as bandas das linhagens CLIB 252 (CBS 1546) e 254 (CBS 1505) não foram digeridas por nenhuma das enzimas, apesar de Naumova et al (2005) ter trabalhado com essas linhagens, não há dados na literatura que explique esse acontecimento.. 39.

(40) Cabral, G. D.; Diversidade Genética de Leveduras do Complexo.... 6. Conclusão. A levedura CLIB 811 Saccharomyces bayanus, mostrou-se completamente diferente das demais linhagens de Saccharomyces bayanus tendo um perfil cariotípico, tipagem por (GTG)5, padrão de digestão de ITS e demais marcadores idênticos ao da linhagem JP1 de Saccharomyces cerevisiae, mostrando que foi classificada equivocadamente como Saccharomyces bayanus, de modo que propomos que seja reclassificada como Saccharomyces cerevisiae. As demais linhagens de Saccharomyces bayanus apresentam variações intraespecíficas marcantes, o que suporta a idéia de que as diferentes linhagens sejam originadas de diferentes eventos de hibridização entre Saccharomyces uvarum e um parental nãoSaccharomyces cerevisiae. Contudo foi visto que as linhagens apresentaram um alelo de Saccharomyces cerevisiae do gene RPS24A e que as linhagens CLIB 252 e 254 não apresentaram restrição para o gene MET2 com a enzima PstI, mas a linhagem CLIB 256 além de ter mostrado o padrão de restrição esperado, mostrou um terceiro fragmento não digerido. Diante destes resultados, as linhagens de Saccharomyces bayanus analisadas são realmente híbridas e provavelmente surgiram por hibridização com mais de dois parentais, sendo o parental Saccharomyces cerevisiae o de menos influência. Os métodos utilizados funcionam bem para agrupar as similaridades, já que as duas linhagens bem definidas como Saccharomyces uvarum apresentaram-se bem homogêneas sem diferenças entre elas, reforçando o status de espécie que foi proposto por Nguyen e Gaillardin (2005).. 40.

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