3 SUBSTITUIÇÃO TOTAL DO FARELO DE SOJA POR URÉIA OU AMIRÉIA,
3.2 Material e métodos
3.2.3 Período experimental
O período experimental teve duração de 84 dias, sendo os primeiros 30 dias destinados ao processo de adaptação dos animais às instalações e às dietas experimentais; e o restante do período, foi segmentado em três sub-períodos de 18 dias, sendo destinado os 14 primeiros dias dos sub-períodos para adaptação dos animais às novas dietas e os quatro últimos dias para colheita de dados e amostras.
3.2.3.1 Colheita de dados referentes ao consumo de matéria seca
Os dados de consumo de MS por animal por dia foram obtidos através da diferença entre a quantidade de MS fornecida e a da sobra. As amostras das dietas fornecidas e das sobras do 150 ao 180 dia foram amostradas uma vez por dia e compostas por animal dentro de cada sub-período.
As amostras foram conservadas congeladas a -10ºC até serem descongeladas e secas em estufas com ventilação forçada (55ºC) por 72 horas e posteriormente, por 12 horas a 105oC para determinação de matéria seca, de acordo com Silva (1990).
3.2.3.2 Colheita de amostras para determinação da digestibilidade aparente no trato digestivo total
Foram realizadas colheitas das amostras de fezes, da porção final do reto, nos quatro últimos dias de cada sub-período à cada oito horas, adiantando duas horas por dia, de maneira que se obtivesse uma amostra a cada duas horas no intervalo de 24 horas depois do término dos quatro dias de colheita.
As amostras foram compostas por animal e período, acondicionadas em sacos plásticos e congeladas a –100C. Posteriormente, estas amostras foram descongeladas homogenizadas e amostrado uma porção de 200 g do material. Essa porção foi seca em estufa com ventilação forçada (550C) por 72 horas e moídas em moinhos do tipo Wiley (Marconi, Piracicaba, SP) primeiramente em peneira com crivos de 2 mm e após em peneira com crivos de 1 mm. Posteriormente, esta amostra voltou a estufa, por 12 horas a 105oC para determinação de matéria seca de acordo com Silva (1990).
Para determinação do cromo utilizou-se a metodologia de fluorescência de raios X, no laboratório de Instrumentação Nuclear do Centro de Energia Nuclear na Agricultura, CENA-USP, descrita por Korndorfer et al. (2001).
As amostras de oferecido, sobras e fezes foram conservadas congeladas a –10oC, para posterior determinação de matéria seca (MS), nitrogênio (N), fibra detergente neutro (FDN), fibra detergente ácido (FDA), lignina, extrato etéreo (EE), matéria mineral (MM). A digestibilidade dos nutrientes foi calculada da seguinte maneira:
Digestibilidade (D) do nutriente (%)
D = 100 – 100 x % do marcador no alimento x % do nutriente nas fezes . % do marcador nas fezes % do nutriente no alimento
3.2.3.3 Colheita de amostras para determinação da digestibilidade aparente no rúmen e intestinos
Inicialmente, a digestibilidade aparente no rúmen e intestinos seria determinada através da utilização do óxido de cromo (Cr2O3), como marcador externo de indigestibilidade, sendo esse fornecido no rúmen duas vezes ao dia (5,0 g/dose a cada 12 horas), via cânula ruminal, iniciando dez dias antes do término das colheitas de cada período.
As amostras do conteúdo duodenal foram colhidas a cada quatro horas, com o horário inicial avançado de uma hora, em cada dia de cada período. Após a colheita das amostras, estas foram compostas por animal e por período, congeladas a –100C, visando a sua conservação, para posterior secagem em estufa com ventilação forçada (550C) por 72 horas e moídas em moinhos do tipo Wiley (Marconi, Piracicaba, SP) primeiramente em peneira com crivos de 2 mm e posteriormente em peneira com crivos de 1 mm, para determinação de lignina, cromo, N, EE, FDN, FDA, MS e MM.
A digestibilidade no rúmen seria calculada através da concentração dos nutrientes e do marcador externo de indigestibilidade no alimento consumido e no conteúdo duodenal. No entanto, os resultados apresentados pelas análises não foram satisfatórios e condizentes com a literatura, não sendo possível determinar a causas dos problemas da recuperação de cromo e conseqüente impedimento da determinação da digestibilidade aparente no rúmen e intestinos. A análise de cromo utilizada foi por fluorescência de raios X, no laboratório de Instrumentação Nuclear do Centro de Energia Nuclear na Agricultura, CENA-USP, descrita por Korndorfer et al. (2001).
3.2.3.4 Análise bromatológica das dietas, sobras e fezes
As amostras do alimento oferecido, sobras e fezes foram secas em estufas com ventilação forçada à temperatura de 55°C por 72 horas e moídas em moinhos tipo Wiley (Marconi, Piracicaba, SP) primeiramente em peneira com crivos de 2 mm e após em peneira com crivos de 1 mm. Posteriormente, esta amostra voltou a estufa por 12 horas a 105oC para determinação de matéria seca de acordo com Silva (1990); MM, EE e N de acordo com AOAC (1990); FDN e FDA de acordo com o método de Van Soest et al. (1991), não seqüencial, utilizando amilase e sulfito de sódio nas determinações de FDN e lignina de acordo com Goering & Van Soest, (1970). O EE nas fezes foi determinado com éter de petróleo adicionado de 10% de ácido acético, para liberar os ácidos graxos (Mattos & Palmquist, 1974). A MO foi obtida pela subtração da MM da MS. Os carboidratos não fibrosos (CNF) pela fórmula: 100 – (FDN + PB + EE + MM).
3.2.3.5 Colheita de amostras para determinação do balanço de nitrogênio
3.2.3.5.1 Colheita de amostras da urina
A colheita total de urina foi realizada durante 48 horas (150 e 160 dias), em todos os sub-períodos, sendo colhida a cada 24 horas (Valadares et al., 1997b). Foram utilizados funis (napa) fixados por alças elásticas no dorso dos animais (Valadares et al., 1997a). A urina foi conduzida por intermédio de mangueira de borracha até um saco plástico contendo 200 mL de solução de ácido sulfúrico a 30%, mantendo o pH final da urina sempre menor que 3,0. Após a pesagem e homogeneização da urina, ela foi filtrada em gaze cirúrgica, colhendo aproximadamente 30 mL, sendo colocada em frascos de vidro com
tampa e armazenado a –10oC para posterior análise (Chen & Gomes, 1992). O nitrogênio da urina foi analisado no macro Kjeldahl segundo a AOAC (1990).
3.2.3.6 Colheita de conteúdo ruminal para determinação de ácidos graxos voláteis (AGV), nitrogênio amoniacal (N-NH3) e pH ruminal
As amostras de conteúdo ruminal foram colhidas no último dia de colheita de cada sub-período (décimo oitavo dia), com intervalos de duas horas entre cada colheita. Os horários de colheita foram determinados obedecendo aos horários da alimentação, sendo que a hora zero foi antes do fornecimento da dieta pela manhã e 2, 4, 6, 8, e 10 horas após o fornecimento da dieta.
As amostras de conteúdo ruminal foram colhidas de quatro pontos diferentes da cavidade e depois filtrada em duas camadas de tecido de algodão (fraldas), obtendo–se desta forma, aproximadamente 200 mL de fluido ruminal filtrado, que foram utilizados para determinação imediata do pH de cada amostra. Esses valores foram determinados através de leitura em peagômetro digital (Digimed, modelo TE-902).
Após a determinação do pH foram retiradas duas alíquotas de 25 mL do fluido ruminal, acrescentando 1,25 mL de solução 6 N de ácido clorídrico e conservando-as congeladas a –10oC para posterior determinação de AGV e N-NH3.
Após o descongelamento, as amostras foram centrifugadas a 11.000 g a 4ºC, durante 20 minutos, sendo uma alíquota utilizada para determinação dos AGV de acordo com Palmiquist & Conrad (1971), utilizando um cromatógrafo líquido gasoso, CLG (Hewlett Packard 5890, series II) equipado com HP integretor (Jewlett – Pacard Company, Avondale, PA). A temperatura do injetor, detector e coluna foram: 150, 190 e 115ºC, respectivamente.
A análise de N-NH3 foi realizada segundo o método calorimétrico descrito por Chaney & Marbach (1962) e adaptado para ser usado em placas de microtítulo e posterior leitura em aparelho do tipo “ELISA READER” (absorvância de 550 nanômetros), o qual apresenta os resultados em mg/dL.
3.2.3.7 Colheita de sangue para determinação de glicose e nitrogênio uréico no plasma
As amostras de sangue foram colhidas no último dia de colheita de cada sub-período (décimo oitavo dia). As amostras de sangue foram colhidas na veia coccigena, em tubos "vacuntainer" contendo oxalato de potássio (anti-coagulante) e fluoreto de sódio (anti-glicolítico).
Os horários de colheita para determinação de nitrogênio uréico no plasma foram determinados obedecendo o horário da alimentação, sendo que a hora zero foi antes do fornecimento da dieta pela manhã e 2, 4, 6, 8 e 10 horas após o fornecimento da dieta.
Foi utilizado apenas o horário das 4 horas após a alimentação para determinação de glicose no plasma. As amostras foram centrifugadas a 4.000 g por 20 minutos à temperatura de 4oC para separação do plasma sanguíneo, o qual foi acondicionado em tubos do tipo “ependorf” e armazenado a -100C para posterior análise.
O nitrogênio uréico no plasma foi determinado através do método enzimático colorimétrico (“Kit” Labtest Diagnóstico SA, Lagoa Santa, MG), multiplicando-se o valor obtido por 0,45 (uréia contém 45% de N) para obter o nitrogênio uréico. A concentração plasmática de glicose foi determinada utilizando um método enzimático colorimétrico (“Kit” Laborlab Produtos para Laboratórios LTDA, Guarulhos, SP).