Perfil de expressão do miR-328

O miR-328 foi descrito como um regulador da expressão do gene PTPRJ, cujo produto é uma proteína PTPRJ (receptor-type protein tyrosine phosphatase) encontrada diminuída em diversos tipos de neoplasias (PADUANO et al., 2013), potencial biomarcador para o câncer de pulmão (ULIVI et al., 2013), marcador prognóstico de glioblastoma (WU et al., 2012) e encontrado ainda em câncer colorretal. Segundo o DIANA TOOLS – Tarbase (2013g) foram validados 6 alvos para esse miRNA (ABCG2, H2AX, CD44, BACE1, NM_004827, NM_001001390), nenhum aparenta ter relação com o transplante renal humano ou com linfócitos T.

Na análise estatística das amostras do presente estudo não foram verificadas diferenças significativas, visto que em todos os indivíduos a expressão basicamente foi linear, com uma pequena expressão diferencial não significativa nos indivíduos estáveis. O fato de o resultado apresentar uma amplitude de expressão para os pacientes transplantados leva a cogitar que a expressão deste miRNA é influenciada por fatores intrínsecos às condições clínicas destes pacientes (Gráfico 7).

Gráfico 7. Expressão do miR-328 em linfócitos T de indivíduos transplantados renais e não transplantados. Tolerância operacional (TO), rejeição crônica (RC), estáveis (ES) e saudáveis (SA).

5.5 SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO

Para o sequenciamento de alto desempenho foram escolhidas, primeiramente, as amostras pertencentes aos matchings 2 e 4, que apresentavam as maiores quantificações de RNA e melhor qualidade. O sequenciamento de alto desempenho foi realizado no centro de sequenciamento The Scripps Research Institute (TSRI), conforme descrito na sessão 4 (Material e Métodos).

Após o sequenciamento foram avaliadas as quantidades e as qualidades das reads obtidas. Logo, verificou-se a necessidade da retirada dos adaptadores. Na tabela 4 constam os dados de números de reads antes e depois da retirada dos adaptadores e os Gráficos 8 e 9 remetem as qualidades das reads antes e depois da retirada dos adaptadores e das sequências com valores abaixo de 20, segundo a escala PHRED. Os dados, a princípio, se mostravam de boa qualidade e quantidade em relação ao número de reads mesmo após a retirada dos adaptadores.

Tabela 4. Número de reads antes e depois da retirada dos adaptadores e das sequências de baixa qualidade.

Indivíduo - Barcode Quantidade de reads _inicial Quantidade de reads _final Ltx08 (Mat. 2) TO - TTCAGC 19.462.548 12.455.850 Ltx04 (Mat. 2) RC - AAGGGA 25.875.560 11.077.357 Ltx09 (Mat. 2) ES - AAGACG 20.667.454 11.316.570 Ltx36 (Mat. 2) SA - TTCGCT 27.037.554 10.062.600 Ltx16 (Mat. 4) TO - CCTCGG 18.068.907 13.446.753 Ltx67 (Mat. 4) RC - TGTTGC 18.191.347 15.229.226 Ltx27 (Mat. 4) ES - GGATGT 22.938.163 12.681.304 Ltx37 (Mat. 4) SA - GTGGCC 23.319.858 9.789.617

Gráfico 8. Gráfico boxplot das qualidades das sequências obtidas inicialmente. Eixo X: posição nas reads em pb. Eixo Y: escala de qualidade PHRED.

Gráfico 9. Gráfico boxplot das qualidades das sequências obtidas depois da retirada dos adaptadores e das sequências com qualidade <20, segundo a escala PHRED. Eixo X: posição nas reads em pb. Eixo Y: escala de qualidade PHRED.

A análise dos dados foi feito a partir do alinhamento de cada par de reads ao conjunto de todos os cromossomos humanos (hg19p10) simultaneamente. O próximo passo tinha a intenção de explorar dois conteúdos em paralelo: o primeiro, quantitativo, utilizado para quantificar a expressão diferencial de éxons entre as amostras (MARIONI et al., 2008); o segundo, qualitativo, referindo-se a diferentes formas de splicing entre as amostras (SULTAN et al., 2008). Todavia, logo nas análises inicias foi observado um problema no alinhamento das reads em relação ao genoma referência. As reads não se alinhavam em regiões de éxons, e estavam distribuídas ao longo de todos os cromossomos, incluindo em regiões intergênicas (Figura 5).

Figura 5. Mapeamento das reads no gene CD28, localizado no cromossomo humano 21. Em cada isoforma, as linhas mais grossas representam éxons e as mais finas, regiões de íntrons. A visualização foi feita no UCSC Genome Browser.

Primeiramente, a suspeita foi que o problema era proveniente do programa Segemehl, utilizado para o mapeamento, que acabara de ser implementado no Laboratório de Bioinformática da Universidade de Brasília. Contudo, o problema estava no material biológico que havia sido enviado ao centro de sequenciamento. Sendo assim, o pipeline desenvolvido foi validado com dados públicos de RNA-seq de linfócitos T que se encontravam disponíveis no SRA/NCBI, evidenciando o alinhamento esperado principalmente nas regiões de éxons (Figura 6).

Figura 6. Mapeamento das reads advindas do banco de dados SRA/NCBI no gene CD28, localizado no cromossomo humano 21. Em cada isoforma, as linhas mais grossas representam éxons e as mais finas, regiões de íntrons. A visualização foi feita no UCSC Genome Browser.

Mais uma vez questionado, o centro de sequenciamento confirmou o problema ocorrido e sugeriu que as amostras estavam contaminadas com DNA genômico. Entretanto, as amostras deveriam ter passado por um tratamento com DNase, no centro de sequenciamento, antes de serem sequênciadas. Em seguida, houveram novas tentativas frustradas de se obter dados de qualidade como pode ser visualizado no Gráfico 10 enviada pelo centro de sequenciamento.

Gráfico 10. Análise da qualidade das sequências obtidas por novas bibliotecas de cDNA. Eixo X: tamanho das reads. Eixo Y: escala Phred.

Na tentativa de corrigir o problema, foram enviadas ao mesmo centro de sequenciamento amostras provenientes dos matching 3 e 4, dessa vez em maior quantidade (250ng) e tratadas com DNase utilizando a mesma metodologia empregada para o envio anterior, sessão 4. Material e Métodos. Porém, a resposta obtida foi de que as amostras chegaram com quantificações entre 130-150ng e que por esse motivo não foi possível a obtenção de bibliotecas de cDNA de qualidade. Atualmente estamos buscando uma forma de solucionar esse problema.

O entendimento da expressão dos miRNAs para determinados tipos celulares específicos, é um passo importante para a elucidação da função dos miRNAs. Atualmente um número crescente de estudos remetem miRNAs ao desenvolvimento de órgãos, tecidos, células, sistemas e em várias doenças, necessitando de um abrangente catálogo de sequências acuradas, validadas por sequenciamento de alto desempenho, bioinformática e técnicas de biologia molecular como microarranjo, qPCR e PCR array, capazes de gerar informações sobre expressão e conservação desses inúmeros miRNAs encontrados.