PERFUSÃO TRANSCARDÍACA, MICROTOMIA E IMUNOISTOQUÍMICA

Para o início dos procedimentos, os animais foram anestesiados por meio da administração de Quetamina e Xilazina (numa dosagem de 80 mg/Kg/ml e 10 mg/Kg/ml, respectivamente, por via intraperitoneal). O cloridrato de quetamina é um antagonista não competitivo dos receptores glutamatérgicos NMDA responsável pela anestesia e analgesia (VASCONCELOS et al., 2005), enquanto que a xilazina é um fármaco agonista alfa2-adrenérgico de ação central responsável pelo relaxamento muscular.

3.8.2 Perfusão Transcardíaca

Decorridos alguns minutos após serem anestesiados, os animais foram submetidos à técnica da perfusão transcardíaca. Durante o procedimento, cada animal foi posicionado em decúbito dorsal sobre uma tela de arame mantida na horizontal dentro de uma capela de exaustão com ponto de água corrente. Logo após, ainda anestesiado, o animal foi submetido, com auxílio de material cirúrgico específico, a um corte na cavidade torácica para dar acesso ao coração. Foi inserida no músculo cardíaco, de modo a posicioná-la no terceiro ventrículo em direção à aorta, uma agulha com dimensões de 17 mm x 1,5 mm, conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer). Por meio desta bomba peristáltica foi impulsionada, pelo leito vascular do animal, 400 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M,

pH 7,4 seguida de 700ml de paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. Imediatamente após a inserção da agulha no ventrículo esquerdo, o átrio direito foi seccionado para que o sangue fosse escoado do corpo do animal.

3.8.3 Remoção dos encéfalos

Após o procedimento da perfusão, os encéfalos foram retirados da calota craniana com auxílio de material cirúrgico. Ao serem retirados, os encéfalos permaneceram por 4 horas em solução contendo paraformaldeído a 4% acrescido de sacarose a 30% para a pós-fixação. Depois da pós-fixação, os encéfalos foram armazenados em solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 para serem posteriormente submetidos ao processo da microtomia. Para evitar desenvolvimento de fungos, a solução de sacarose foi trocada diariamente até que a microtomia fosse realizada.

3.8.4 Microtomia

Os encéfalos foram congelados em gelo seco e seccionados em micrótomo de deslizamento manual (LeicaTM_{). Foram realizados cortes coronais com uma} espessura de 30µm onde foram distribuídos serialmente e sequencialmente em seis compartimentos. Portanto, a distância entre uma secção e a seguinte, no mesmo compartimento foi de 180µm. As secções foram armazenadas em solução anticongelante e acondicionadas em um freezer com temperatura de -20Cº até a realização do processo imunoistoquímico.

Figura 5- Representação esquemática dos pontos de realização dos cortes coronais no encéfalo do rato.

3.8.5 Imunoistoquímica

Anteriormente ao processo imunoistoquímico, os cortes foram retirados da solução anticongelante e submetidos a um pré-tratamento para inativação de peroxidases endógenas e, assim, prevenir a formação de artefatos. Inicialmente, os cortes foram lavados com tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 durante 20 minutos, havendo a troca da solução tampão a cada 5 minutos. As lavagens foram realizadas em recipientes posicionados sobre um agitador orbital. Os cortes foram incubados

durante 20 minutos numa solução contendo peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,03%

em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4.

Em seguida foram realizadas mais 4 lavagens em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 com uma duração de 5 minutos cada. Posteriormente, os cortes foram incubados em uma solução contendo o anticorpo primário (anti- 5-HT obtido em coelho, concentração de 1:5000, Sigma, St. Louis, MO, USA) diluído em tampão fosfato contendo Triton X-100 0,04% e soro normal de cabra (concentração 1:50). Os cortes permaneceram na solução durante 18 horas em um rotor com rotação lenta com eixo de inclinação de 30°. Decorridas 18 horas, os cortes foram submetidos a mais 4 lavagens em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 com duração de 5 minutos cada, sendo, posteriormente incubados em solução contendo o anticorpo secundário diluído (anti- coelho obtido em cabra, concentração, 1:1000, Jackson Immunoresearch, West Groove, PA, USA) em tampão fosfato contendo Triton X-100 0,4% por 2 horas. Imediatamente após este período mais 4 lavagens de 5 minutos na solução tampão foram realizadas e as secções foram incubadas no complexo avidina-biotina- peroxidase (Kit Elit Vector) Triton X-100 NaCl por mais 2 horas. Logo após este período, realizou-se mais 4 lavagens com tampão fosfato 0,1M, pH 7,4.

Ao final, para a visualização da reação, as secções foram submetidas a uma técnica de revelação que ocorria em meio líquido contendo tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, peróxido de hidrogênio 0,003% tendo como cromógeno a diaminobenzina (DAB) (Sigma; St Louis, MO, USA). Os cortes foram imersos nesta solução por um período de 10 minutos. Ao final, os cortes foram lavados em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 durante 20 minutos e o tampão foi trocado a cada 5 minutos. As secções foram então montadas em lâminas de vidro gelatinizadas. Após a secagem em

temperatura ambiente, a reação de imunoistoquímica foi intensificada em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% seguida de desidratação e diafanização em uma bateria de álcoois. Com o auxílio do meio de montagem ERV-MOUNT as lamínulas foram coladas sobre as lâminas.

3.8.6 Imagem

A visualização das lâminas foi realizada com o auxílio de um microscópio óptico (Nikon Eclipse Ni). Para a obtenção das imagens digitais utilizou-se uma câmera digital (Moticam 5) acoplada a este microscópio. O software utilizado para a captura das imagens foi o Motic Images Plus 2.0, tomando como base para cada foto o atlas do cérebro de rato de Paxinos e Watson (2007). As fotografias capturadas foram corrigidas para brilho e contraste com o auxílio do software Adobe

Photoshop CS4®_{. Foram realizadas fotos nas objetivas de 2X e 10X.}

3.8.7 Contagem de células imunorreativas para a serotonina

Para a contagem das células imunorreativas para a serotonina foi necessário o auxílio do software ImageJ. Considerando a contagem das células imunorreativas foi realizada uma média de 3 slices de cada porção dorsal e caudal do NDR, respectivamente, para cada animal, representando o número mais semelhante possível de células serotonérgicas dispostas no plano tridimensional. Inicialmente, todas as imagens obtidas foram renomeadas por outro pesquisador, de maneira aleatória, de modo que o contador realizasse a contagem “às cegas”, a fim de evitar abordagens tendenciosas. As imagens obtidas em objetivas foram utilizadas para a contagem no software ImageJ e como critérios padrões de contagem foram considerados núcleo e delimitação da borda celular.

Grupos experimentais

Nas etapas comportamental e imunoistoquímica os animais foram divididos em grupos, como ilustrado nas tabelas abaixo:

Tabela 3 _{– Representação das divisões dos grupos da etapa comportamental ilustrando o} tempo de tratamento e de retirada do etanol

Grupos etapa comportamental

Tempo de tratamento Tempo de retirada e teste no

LCE e CA

Controle

Sem etanol (água à vontade)

Submetidos ao LCE e CA junto aos demais grupos

Retirada Curto Prazo 21 dias de tratamento Submetidos ao LCE 72h e ao CA 96h após a retirada

Retirada Longo Prazo 21 dias de tratamento Submetidos ao LCE 21 dias e ao CA após 22 dias de retirada Fonte: (a autora)

Tabela 4 - Representação das divisões dos grupos da etapa imunoistoquímica ilustrando o tempo de tratamento e de retirada do etanol

Grupos etapa imunoistoquímica

Tempo de tratamento Tempo de retirada

Controle

Sem etanol (água à vontade)

Submetidos à técnica da perfusão junto aos demais grupos

Retirada Curto Prazo 21 dias de tratamento Submetidos à técnica da perfusão após 72h de retirada

Retirada Longo Prazo 21 dias de tratamento Submetidos à técnica da perfusão 21 dias após a retirada

Etanol Crônico 21 dias de tratamento Submetidos à técnica da perfusão imediatamente após 21 dias de

consumo contínuo Fonte: (a autora)