Casos de LTA no Brasil de 1990 a
5.4. Permeação percutânea de Sb
A permeação média de antimônio a partir da formulação NatAM nestas condições descritas no item 4,8, após oito horas de exposição foi de 0,33 ± 0,26% e 14,57 ± 1,08%, respectivamente. Para o composto LA8-Sb, estes valores foram 0,008 ± 0,003% e 4,27 ± 2,49%, respectivamente (Figura 11).
Foi observada uma baixa permeação de antimônio em ambas as formulações testadas, após oito horas de exposição, quando a pele apresentava o estrato córneo. Entretanto, a permeação de Sb para ambos as formulações foi maior na ausência de estrato córneo (p < 0,05) (Figura 12).
54
NatAM LA8-Sb NatAM LA8-Sb
0.01 0.02 0.03 0.20 0.35 0.50 5 10 15
Pele íntegra Ausência de estrato
córneo 20
**
*
**
%
d
e
S
b
pe
rm
ea
do
Figura 11 - Percentual da permeação cutânea de Sb através da pele de camundongos Hairless, após oito horas de exposição às formulações na presença e na ausência de estrato córneo. Os asteriscos representam diferença estatística significante (* = p < 0,05 e ** = p < 0,001) (n=3).
A formulação NatAM apresentou uma taxa de permeação maior que o LA8-Sb na presença de estrato córneo (p < 0,05) após 8 horas (figura 12-A). O mesmo foi observado na ausência de estrato córneo (p < 0,001) (Figura 12-B). Na ausência de estrato córneo, destaca-se a liberação sustentada de Sb a partir da formulação LA8-Sb, representada pela inclinação da curva visualmente menor que a de NatAM.
55 0 2 4 6 8 10 0.0 0.2 0.4 0.6
NatAM
LA8-Sb
A
Horas
%
d
e
S
b
pe
rm
ea
do
0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20NatAM
LA8-Sb
B
Horas
%
d
e
S
b
pe
rm
ea
do
Figura 12 - Permeação percutânea de antimônio em função do tempo, em células de difusão de Franz usando pele íntegra de camundongos Hairless (A) ou na ausência do estrato córneo (B). Os dados representam a média (n=3) e os desvios-padrão são representados por barras verticais.
56 5.5. Atividade anti-leishmania in vivo
A eficácia in vivo dos compostos LA8 e LA8-Sb foi avaliada em camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis. O tratamento foi iniciado 45 dias após a infecção através de aplicação tópica das formulações na lesão conforme descrito no item 4.7.2. Foram determinados dois parâmetros: diâmetro médio da lesão e carga parasitária estimada pela técnica de LDU.
O peso dos camundongos foi aferido para avaliação da toxicidade sistêmica do composto (Tabela 4). Não foi observada alteração nas médias dos pesos dos camundongos tratados com nenhuma das formulações utilizadas no ensaio in vivo.
Tabela 4 - Avaliação do peso médio de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis tratados com Glucantime, LA8 e LA8-Sb. Os valores apresentados se referem às médias e desvio padrão de dois experimentos independentes (n=5).
Não foi observada redução do tamanho da lesão dos camundongos tratados com o ligante, quando comparados com o grupo controle no 21º dia de tratamento. Entretanto, foi observada diminuição do diâmetro médio da lesão dos camundongos tratados com o Glucantime, a partir do 14º dia de tratamento e com o complexo LA8-Sb a partir do 21º dia de tratamento (Figuras 13 e 15).
Quando comparamos a evolução da lesão em cada grupo, é observada uma diminuição no tamanho da lesão com o passar do tempo no grupo tratado com Glucantime. Os grupos controle e LA8 apresentaram um aumento do tamanho da lesão como esperado. Por outro lado, o grupo tratado com o complexo LA8-Sb não apresentou diferença significativa no tamanho da lesão com relação ao tempo (Figura 15).
Tempo de tratamento
(dias) Controle Glucantime LA8 LA8-Sb
0 20,94 ± 0,67 20,08 ± 1,40 19,58 ± 2,01 19,32 ± 1,15 7 21,50 ± 0,90 20,84 ± 2,04 20,26 ± 0,90 19,42 ± 1,17 14 21,20 ± 0,92 20,86 ± 2,12 20,52 ± 0,98 20,06 ± 1,06 21 20,38 ± 0,25 20,56 ± 2,13 20,66 ± 1,20 20,06 ± 1,29
57 0 7 14 21 0.0 0.5 1.0 1.5 Controle Glucantime LA8 LA8-Sb
*
**
**
Tempo (dias) D iâ m e tr o m é d io ( m m )Figura 13 - Diâmetro médio da lesão em função do tempo de tratamento de camundongos BALB/c tratados com Glucantime (200mg Sb/Kg/IP/24h por 21 dias), LA8- Sb (51,7mg Sb/kg/12h) e LA8 (mesma concentração de LA8 no complexo LA8-Sb). Os desvios padrão estão representados por barras verticais. Os asteriscos representam diferença significativa com relação ao grupo controle (*p < 0,05 e **p<0,01)(n=5).
Controle Glucantime LA8 LA8-Sb
0 2.0109 4.0109 6.0109 8.0109 * *,a Ca rg a p ar as it ár ia
Figura 14 - Avaliação da eficácia da formulação tópica de LA8-Sb em camundongos infectados com L. amazonensis. Os dados são mostrados como as cargas parasitárias médias e os desvios padrão determinados após 21 dias de tratamento pela técnica de LDU. Camundongos BALB/c foram tratados com Glucantime (200mg Sb/Kg/24h por via IP), LA8-Sb (51,7mg Sb/kg/12h) e LA8 (mesma concentração de LA8 no complexo LA8- Sb). Grupos marcados com asterisco diferem do grupo controle pelo teste ANOVA (p <0,001). O grupo marcado com o “a” difere do Glucantime ao nível de significância de 5% (p < 0,05) (n=5).
58
Os imprints das lesões mostraram a presença de macrófagos, em sua maioria, infectados por Leishmania, e raros linfócitos, neutrófilos e eosinófilos, além de inúmeras amastigotas extracelulares.
A carga parasitária estimada pela técnica de LDU mostrou uma significativa diminuição do número de parasitos nos grupos tratados com Glucantime e LA8-Sb (p < 0,01) com relação ao grupo controle não tratado. Também foi observada diferença estatística entre os grupos LA8 e LA8-Sb (p < 0,05).
Figura 15 - Avaliação do efeito do tratamento em camundongos BALB/c fêmeas infectadas com L. (L.) amazonensis. As imagens representam o mesmo animal em cada grupo.
Dias de
tratamento Controle Glucantime LA8 LA8-Sb
0
7
14
59
6.
Discussão
e Conc
60
A quimioterapia ainda constitui o pilar para o controle de doenças que, como as leishmanioses, não dispõem de vacinas eficazes (Kouni, 2003). As leishmanioses são consideradas doenças negligenciadas e foram caracterizadas pela OMS como doença emergente e de difícil controle. A OMS propõe a erradicação de leishmaniose no mundo até 2015, dentro do plano global para o combate de doenças tropicais negligenciadas – 2008 – 2015 (WHO, 2011).
O arsenal quimioterapêutico para o tratamento das leishmanioses é pequeno, sendo os antimoniais pentavalentes as drogas de primeira escolha para o tratamento. Além da elevada toxicidade dos fármacos de primeira escolha, as vias de administração são muito desconfortáveis para os pacientes e em algumas situações são contraindicados. Além disso, a resistência aos antimoniais, tem se apresentado como um problema na quimioterapia da doença, sobretudo no estado de Bíhar, na Índia, mas também em outras partes do mundo (Farault-Gambarelli et al., 1997; Rojas et al., 2006;Sundar et al., 2001).
Tendo em foco os problemas ressaltados, existem dificuldades que ainda devem ser consideradas para o desenvolvimento de novos fármacos: o parasito se localiza dentro de fagolisossomas de macrófagos, o que dificulta a ação potencial de fármacos. Novas moléculas devem ter baixa toxicidade e novas estratégias, particularmente na escolha dos alvos e novas vias de administração, devem ser consideradas.
Como descrito anteriormente, a proposta de estudar o LA8 complexado com o antimônio pentavalente, faz parte de um estudo mais amplo do Grupo de Desenvolvimento de Compostos Leishmanicida e do Grupo Interdisciplinar de Drogas Leishmanicida da UFMG (ICEX/ICB), que nos últimos anos tem
estudado vários compostos complexados ao SbV.
Um estudo realizado por Ferreira (2010) avaliou o coeficiente de partição óleo/água do complexo LA8-Sb, demonstrando que o seu balanço hidrofóbico/hidrofílico caracteriza este novo complexo como sendo anfifílico, sugerindo uma maior facilidade para atravessar membranas e tecidos biológicos.
A incorporação de antimônio em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c foi avaliada pela equipe do Laboratório de Biofísica de
61
Sistemas Nanoestruturados/ Departamento de Fisiologia e Biofísica da UFMG, e mostrou que essas células, quando incubadas por 4 horas com o complexo, foram capazes de incorporar mais antimônio do que quando se utilizou o
Glucantime ou o antimoniato de potássio (KSb(OH)6) na mesma concentração
de Sb (dados não publicados).
Os nossos resultados mostram que o complexo LA8-Sb apresentou uma
elevada toxicidade (CC50=0,26mM de Sb) para macrófagos murinos, cerca de
100 vezes maior que a do Glucantime quando comparada à concentração de antimônio em ambos os compostos, e 6 vezes mais tóxico que o ligante, quando comparada à concentração da molécula LA8.
O conjunto desses dados sugere um papel central do SbV na
citotoxicidade do complexo LA8-Sb. Apesar do antimônio pentavalente ser menos tóxico que a forma trivalente (Berman et al., 1997), ele pode ser reduzido à sua forma trivalente no organismo (Burguera et al.,1993; Petit,1990). Acredita-se que a redução pode estar ligada ao metabolismo dos tióis, uma vez que a glutationa pode promover a redução do SbV a SbIII no antimoniato de N- metilglucamina (AM), em condições próximas às fisiológicas (Frézard et al.,, 2001).
Com base nos resultados obtidos nos experimentos citados, foi
levantada a hipótese de que o complexo LA8-Sb poderia atuar como uma “pró-
droga”, sendo ativa contra formas amastigotas após a metabolização no tecido. Os valores encontrados nos testes de citotoxicidade (figura 8) e de atividade anti-amastigota para o Glucantime (figuras 9 e 11) no presente estudo, bem como o índice de seletividade encontrado (IS = 6,2) diferem dos encontrados na literatura. O modelo utilizado neste trabalho foi o sistema de macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c infectados com formas promastigotas em fase estacionária de crescimento, sendo internalizadas e diferenciadas em formas amastigotas. Este modelo foi utilizado por outros autores, como Sereno & Lemesre, (1997), Morais-Teixeira et al., (2008) e Pinheiro et al., (2011).
Nesse trabalho obtivemos um valor de CI50 cerca 22 vezes maior que o
encontrado por Morais-Teixeira et al., (2008), quando utilizado um modelo experimental semelhante. No entanto, foi observado que no trabalho citado as temperaturas de incubação foram diferentes das utilizadas nesse trabalho, uma
62
vez que nos nossos experimentos, ocorria morte celular da cepa quando incubadas a 37ºC.
Em resumo, não há um modelo padronizado para os testes de novas moléculas. Os trabalhos utilizam desde diferentes cepas do parasito, diferentes formas evolutivas, crescidas em diferentes meios de cultura, além de diferentes linhagens de macrófagos, o que inviabiliza em muitos casos, a comparação entre os índices de seletividade encontrados (Gupta, 2011; Borborema et al., 2011; Callahan et al., 1997; Morais-Teixeira et al., 2008; Torres-Santos et al., 2004 ; Grecco et al., 2012). Novos modelos têm sido propostos para screening de novas moléculas, utilizando parasitos transfectados com genes que expressam proteínas fluorescentes, mas esses modelos ainda não foram bem estabelecidos e, portanto, pouco difundidos (Pulido, 2012; Siqueira-Neto et al., 2010; De Muylder et al., 2011).
Além disso, muitos destes trabalhos utilizam formas promastigotas como modelo de screening (Tahghighi, 2012; Sanchez-Moreno, 2012; Fouladvand, 2011, Tariku, 2011). No entanto, considerando as diferenças entre as formas evolutivas de Leishmania, principalmente no que tange as diferenças proteômicas (Leifso, 2007, Brotherton, 2010), o modelo utilizando parasitos internalizados em macrófagos pode ser considerado uma metodologia preferencial (Croft, 1986), embora esse seja trabalhoso, caro, não automatizável, (Gupta, 2011) e que muitas vezes não reflete a atividade in vivo. Acreditamos que as diferenças encontradas nos valores de citotoxicidade desse trabalho, podem estar relacionadas com os diferentes modelos experimentais e protocolos utilizados pelos vários autores.
Nos experimentos de atividade anti-amastigota in vitro, foi observada ainda, a morte celular dos macrófagos infectados, expostos à concentração de 0,2mM do complexo por 72 horas. Uma dose menor e relativamente próxima, 0,1mM, apresentou uma menor toxicidade, mas foi incapaz de reduzir a infecção in vitro (figura 8).
Os resultados indicam que o complexo apresenta uma toxicidade elevada para macrófagos peritoneais murinos, e não apresenta atividade seletiva contra as formas amastigotas de Leishmania amazonensis, em concentrações abaixo da sua concentração citotóxica e no tempo de 72 horas.
63
Com relação ao estudo da atividade in vivo, foi observada diminuição do diâmetro médio da lesão dos camundongos tratados com o Glucantime IP, a partir do 14º dia de tratamento e do complexo LA8-Sb no 21º dia de tratamento (figuras 13 e 15). Por outro lado, não foi observada redução do tamanho da lesão dos camundongos experimentalmente infectados e tratados com o ligante LA8, quando comparados com o grupo controle. Não houve indícios de toxicidade sistêmica durante os tratamentos, quando se utilizou como parâmetro o peso médio dos camundongos tratados (tabela 4).
A carga parasitária dos camundongos, avaliada pelo método de LDU (Stauber, 1956), mostrou que houve uma redução significativa no número de parasitos do grupo tratado com o Glucantime e LA8-Sb, quando comparado como grupo controle (figura 14). Esses resultados associados com os obtidos na avaliação do tamanho da lesão, sugerem que a formulação tópica de LA8- Sb apresenta uma atividade anti-Leishmania in vivo, tal como demonstrado nos ensaios realizados previamente por via oral.
No presente trabalho, investigamos também a permeação percutânea in
vitro de antimônio a partir da formulação tópica de LA8-Sb, que foi comparada
àquela do antimoniato de meglumina hidrofílico incorporado em gel de natrosol (Nat-AM). A formulação LA8-Sb promoveu uma taxa de permeação significativamente menor que o Nat-AM, tanto na presença quanto na ausência de estrato córneo.
Vale ressaltar que a pele sem estrato córneo representa uma condição fisiopatológica mais próxima àquela de uma lesão cutânea causada por
Leishmania amazonensis. Nessa condição, a menor taxa de permeação
percutânea de antimônio a partir da formulação LA8-Sb indica uma liberação mais sustentada do metal, podendo contribuir a uma ação mais prolongada.
O fato da permeação do LA8-Sb estar significativamente aumentada após retirada do estrato córneo sugere também a retenção do complexo no estrato córneo quando a formulação é aplicada em pele intata. As propriedades de barreira do estrato córneo são atribuídas à composição dos lipídeos presentes, ao arranjo estrutural desta matriz intercelular e ao envelope lipídico que circunda as células (Moser et al., 2001). A maior retenção do complexo LA8-Sb no estrato córneo poderia ser explicada por uma interação do
64
complexo com alguns dos constituintes dessa barreira. Entretanto, outras formulações contendo o complexo podem potencializar a absorção de Sb. A observação do aumento de permeação percutânea de antimônio a partir do Nat-AM, após retirada do estrato córneo, está de acordo com os resultados de Martins et al (2006) que avaliaram a absorção percutânea de AM complexado ou não à -ciclodextrina (-CO),
Um estudo realizado pela equipe do Laboratório de Biofísica de Sistemas Nanoestruturados/ Departamento de Fisiologia e Biofísica da UFMG, avaliou a atividade in vivo de LA8-Sb contra Leishmania infantum (cepa BH46), em camundongos BALB/c fêmeas tratadas por via oral na dose de 200mg Sb/Kg/12h. Neste estudo, foi observada uma diminuição da carga parasitária no fígado. Observou-se em um estudo concomitante que uma dose oral de 600 mM do ligante, duas vezes ao dia, foi letal para 50% dos camundongos em 10 dias de tratamento (dados não publicados).
Foi mostrado ainda que o complexo facilita a absorção de antimônio quando administrado por via oral a camundongos swiss, permitindo uma absorção até nove vezes maior de Sb, quando comparado à absorção pela administração oral de AM (Ferreira, 2010).
Os resultados obtidos nesse experimento e nos demais trabalhos dos grupos de pesquisa reforçam a hipótese de que o LA8-Sb possa atuar como uma “pró-droga”, sendo ativa após uma metabolização no organismo. Isso explicaria a diferença entre sua atividade in vitro e in vivo. Novos testes foram conduzidos para avaliação dessa hipótese.
Como perspectivas para novos ensaios, o grupo pretende testar novamente a formulação utilizando métodos moleculares para quantificação mais precisa da carga parasitária, além de um acompanhamento dos animais tratados após um período de tratamento.
Apesar do tratamento por via tópica com a formulação do complexo LA8- Sb ter mostrado uma atividade anti-leishmania e uma discreta diminuição do crescimento da lesão, novos estudos são necessários para melhor avaliação do complexo, sendo proposta avaliação de novas formulações..
Estudos recentes têm mostrado o potencial terapêutico de associações de fármacos com eficácia já comprovada. Esses estudos mostraram que as associações podem acelerar a resolução das lesões e potencializar a eficácia
65
do tratamento diminuindo suas doses e consequentemente sua toxicidade (Aguiar et al., 2009; Da Silva et al., 2012). Pretende-se também testar as possíveis associações do complexo com tratamentos convencionais, diminuindo assim as doses e a toxicidade do tratamento como um todo.
O presente estudo permite concluir que o complexo anfifílico de antimônio LA8-Sb apresenta atividade anti-leishmania após aplicação tópica em modelo murino de leishmaniose cutânea causada por L. amazonensis, apesar da aparente ineficácia em modelo in vitro de macrófagos infectados. Novos estudos são necessários para elucidação do modo de atuação da nova formulação bem como sua otimização.
66
7.
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