Pesquisa de enteropatógenos em amostras de fezes

A coleta de amostra de fezes era requerida na primeira visita à residência do caso (quando o/a responsável era encontrado/a no domicílio) a fim de obter a coleta de fezes ainda aquosas. Para pesquisa dos enteropatógenos, foram disponibilizados ao/à responsável pelo caso, dois potes do tipo coletor universal: um contendo meio de transporte Cary and Blair (BBL®) para transporte e conservação das fezes para pesquisa de enterobactérias e Rotavírus; e outro pote com conservante MIF para pesquisa de protozoários. O/a responsável pela criança era orientado quanto aos procedimentos de coleta e armazenamento (refrigeração a 4°C). Era pedido ao responsável que entrasse em contato com a pesquisadora após a coleta.

As amostras coletadas eram encaminhadas para o Laboratório de Microbiologia do Setor de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Pública do Departamento de Medicina Veterinária - UFV. No laboratório, era realizado o teste para Rotavírus e iniciada a coprocultura. A alíquota de fezes contendo meio conservante MIF era armazenada sob refrigeração (4ºC) para posterior pesquisa de protozoários e helmintos.

Foi entregue a todos os participantes do estudo, via correio, o resultado da pesquisa de enteropatógenos, anexo carta de agradecimento de participação e o contato telefônico para maiores esclarecimentos. Quando o resultado era positivo para um patógeno (Rotavírus, Salmonella spp. entre outros), a pesquisadora encaminhava o resultado pelo correio, mas orientava, por telefone, ao/à responsável que procurasse um serviço de saúde e que poderia repetir o exame, caso achasse necessário.

4.2.3.1. Pesquisa de Rotavírus

A pesquisa de Rotavírus foi realizada utilizando o kit Teste Imunocromatográfico para Detecção de Rotavírus CRR20 (inovaBiotec®) segundo o manual de instruções do fabricante. A detecção do vírus foi qualitativa (positivo/negativo).

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4.2.3.2. Pesquisa de enterobactérias

As amostras de fezes obtidas eram repicadas em caldo Tetrationato (Difco®) (37º C/24 h) e caldo GN (Himedia®) (37ºC/6-8h). Após os períodos de incubação desses meios, uma alçada de cada cultura era estriada nos meios seletivos MacConkey (Acumedia®) Salmonella-Shigella (SS) (Difco®) e Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (Himedia®). Posteriormente, as colônias formadas nos meios seletivos eram caracterizadas quanto à morfologia, purificadas e submetidas a testes bioquímicos para identificação da(s) espécie(s).

Para caracterização bioquímica, foram utilizados o conjunto de meios EPM- MILI e o kit Painel para Enterobactérias, ambos da empresa PROBAC® do Brasil. Os procedimentos para os testes e a forma de obtenção dos resultados obedeceram às recomendações do fabricante constantes no manual de uso dos meios.

4.2.3.3. Pesquisa de (oo)cistos de Giardia spp. e Cryptosporidium spp.

A pesquisa de cistos de Giardia spp. e de oocistos de Cryptosporidium spp. foi realizada por meio do método de concentração com formalina e acetato de etila (CDC, 2002). A identificação de protozoários nas amostras concentradas foi realizada empregando-se o kit de diagnóstico MERIFLUOR® (Meridian Diagnostics), que se baseia na técnica de imunoflorescência direta (reação conjugado antígeno-anticorpo FITC) in vitro para detecção simultânea de cistos de Giardia sp. e oocistos de Cryptosporidium spp., conferindo uma fluorescência típica aos (oo)cistos pesquisados. Os procedimentos adotados seguiram as recomendações constantes no manual de instruções do kit. As lâminas preparadas foram observadas sob microscopia de epiflorescência (microscópio Nikon Eclipse E600, com filtro 450-490 nm de excitação), em objetiva de 40X, para detecção da presença dos (oo)cistos. Foi utilizado o microscópio de epifluorescência do Laboratório de Controle da Qualidade da Água da Estação de Tratamento de Água da Universidade Federal de Viçosa.

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Os cistos de Giardia sp. eram identificados como estruturas de formato oval ou redondo, de tamanho entre 8-12 µm de comprimento e 7-10 µm de largura.; e os oocistos de Cryptosporidium spp. como composições esféricas e tamanho de 4-6 µm diâmetro, os (oo)cistos apresentam brilho maçã-verde, principalmente, nas paredes, sobre fundo negro e vermelho correspondente aos sedimentos.

4.2.3.4. Pesquisa de outros protozoários e helmintos

A detecção de outros protozoários (exceto Giardia sp. e Cryptosporidium spp.) e helmintos foi realizada por meio do método de sedimentação espontânea em água (HOFFMAN et al., 1934).

4.2.3.5. Perfil de suscetibilidade a antimicrobianos

Para a seleção dos antimicrobianos a serem testados foi feita consulta a profissionais de saúde do município e levantamento bibliográfico, com o intuito de identificar os antimicrobianos prescritos para tratamento dos casos de DDA. A consulta aos profissionais foi realizada a partir do envio de carta (Anexo 5) a cinco médicos/as pediatras, sendo que três respondentes indicaram os seguintes antimicrobianos: gentamicina (1 respondente), nitrofurantoína (1 respondente), ácido nalidíxico (1 respondente) e sulfametoxazol-trimetoprim (3 respondentes).

Por meio de levantamento bibliográfico, identificamos recomendação do uso de cloranfenicol, ampicilina e sulfametoxazol-trimetropim para tratamento de casos de febre tifóide (Brasil, 2004). A instituição americana Food and Drug Administration (FDA) recomenda, através do Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI/National Committee Clinical for Laboratory Standards - NCCLS, uma série de agentes antimicrobianos que devem ser considerados para teste de rotina e registro de micro-organismos não-exigentes em laboratórios de microbiologia clínica, havendo uma lista para isolados da família Enterobacteriaceae, da qual foram selecionados os fármacos estreptomicina e tetraciclina.

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Assim, para realização do teste, utilizou-se meio de cultura Müeller-Hinton e discos dos antimicrobianos selecionados nas respectivas concentrações: ácido nalidixíco - 30µg, ampicilina - 10µg, cloranfenicol - 30 µg, tetraciclina - 30 µg, sulfametoxazol-trimetropim - 25µg , estreptomicina - 10µg, gentamicina - 10µg e nitrofurantoína - 300 µg.

Desse modo, após identificação do isolado bacteriano, era realizado teste de sensibilidade antimicrobiana dos isolados bacterianos pelo método de disco-difusão (Bauer et al., 1966) conforme recomendações do CLSI/NCCLS (2003). O teste foi realizado em duplicata e os diâmetros dos halos de inibição foram mensurados e interpretados com base na tabela para isolados da família Enterobacteriaceae recomendada pelo CLSI/NCCLS (2005) para classificação do isolado quanto à sensibilidade aos antimicrobianos testados. O isolado era classificado para cada antimicrobiano como sensível, intermediário ou resistente.

Cabe evidenciar que como os casos de diarréia do estudo eram crianças que já haviam sido avaliadas por um/a médico/a, no momento do contato para colaboração com o projeto (aplicação do questionário e solicitação da coleta de fezes), na maioria das vezes, a criança já estava sendo medicada e, em algumas ocasiões com antimicrobiano. Ainda assim, optou-se por realizar o teste de suscetibilidade aos antimicrobianos para aquelas que realizaram a coleta de material fecal, sendo essas informações utilizadas na interpretação dos resultados das análises de isolamento e do antibiograma.

4.2.3.6. Análise dos dados

Os resultados da identificação de enteropatógenos foram expressos qualitativamente, em termos de positivo e negativo. Quando resultado era positivo para identificação de bactéria, protozoário e helminto, a espécie encontrada foi registrada. Os resultados da identificação de enteropatógenos e do teste de suscetibilidade dos isolados bacterianos a antimicrobianos foram analisados através do

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cálculo de proporções e apresentados em tabelas de frequência utilizando o programa Microsoft® Excel.