PLA 2 D49 Bbil-TX do veneno de Bothriopsis bilineata

A PLA2D49 Bbil-TX previamente isolada e purificada a partir do

veneno de Bothriopsis bilineata (Carregari et al, 2013) foi modificada quimicamente com o p-bromofenolbromide (p-BPB), onde esta modificação já bem descrita para as PLA2s, ocorre principalmente na histidina do sítio

catalítico desta família de proteínas.O p-BPB se liga ao átomo ND1 da histidina

perdendo um bromo e uma molécula de hidrogênio, como comprovado através de cristalografia de raio-X por (Zhaoet al, 1997).

No presente trabalho, a confirmação da modificação das histidinas da Bbil-TX pelo reagente químico p-BPB foi feita através da avaliação da atividade PLA2 e confirmada com o uso de espectrometria de massas. Como

apresentado a Bbil-TX sofre uma inibição quase completa de sua atividade enzimática após a modificação com o p-BPB.

A PLA2 Bbil-TX em sua forma intacta, sem a presença de modificações

químicas, apresentando um único pico e massa real de 14243,57Da quando analisada em um espectrômetro de alta resolução, servindo como base de identificação da alteração de massa provocada pela adição da massa do reagente p-BPB após a modificação. A Bbil-TX após a modificação com o p- BPB apresentou dois picos de massa total de 14440.4712Da e 14639.4171Da, apresentando uma adição de 196.9Da e 395.8Da à sua massa intacta.

Segundo Zhao et al(1997) e Huancahuire-Vegaet al(2013), há uma adição de 196/197u após a modificação da histidina com o p-BPB, o que sugere que estes dois picos representam a Bbi-TX com a presença de uma histidina modificada e duas histidinas modificadas. Carregari et al,(2013) suportam esta suposição, pois apresentam, neste trabalho, a presença de duas histidinas na sequência de aminoácidos da Bbil-TX.

Para analisar as modificações químicas e o local exato onde estas ocorreram, foi feita a digestão tríptica da PLA2 Bbil-TX na qual os peptídeos

gerados foram analisados por LC-MS/MS. Após a análise dos dados dos espectros gerados pelos peptídeos trípticos foi possível identificar as modificações na histidina da região N-terminal e da histidina do sítio catalítico.

A modificação foi denominada de Alq, sendo previamente adicionada na busca realizada pelo Sequest. Os dados obtidos também demonstram a presença de peptídeos onde não há a modificação da histidina na região N- terminal, oque não foi possível observar com a histidina presente na região do sítio catalítico.Este fato permite afirmar que a histidina presente no sítio catalítico é mais suscetível a modificação química promovida pelo p-BPB, dadoa uma maior exposição desta histidina do sítio catalítico, devido à estrutura tridimensional do sítio catalítico onde a constituição dos aminoácidos permitem esta maior exposiçãogerando assim maior afinidade desta histidina com o reagente p-BPB, como visto por Zhao et al(1997).

A acetilação das lisinas promovidas pela adição de anidro acético é frequentemente utilizada para estudos de relação estrutura e função das PLA2.Normalmente a alta quantidade de lisinas na sequência está vinculada a

atividade miotóxica destas toxinas.A modificação destas lisinas através da acetilação pode proporcionar um melhor entendimento do mecanismo miotóxico promovido pelas PLA2, sendo ela catalítica ou não (Soares et al,2003; Verheij, 1981; Yang,1997).

A PLA2 Bbil-TX foi modificada quimicamente com o uso de anidro

acético, acetilandoas lisinas presentes em sua estrutura. Através do uso de espectrometria de massa por MALDI-TOF, identifico-se que a houve uma alta eficiência nesta modificação, uma vez que foram encontrados três picos bem definidos de massa 14579.741Da, 14625,706Da e 14664.394Da, demostrando a presença de 8, 9 e 10 lisinas modificadas, pois cada acetilação aumenta em 42u a massa de cada lisina. As acetilações nas lisinas e o numero exato em que ocorreram, foramconstatadas atravésda digestão tríptica da PLA2 Bbil-TX

modificada e da análise dos peptídeos gerados por LC-MS/MS.

Após a análise dos dados dos espectros gerados pelos peptídeos trípticos foi possível identificar 9 lisinas acetiladas. Os dados sugerem a presença de 10 lisinas na cadeia de aminoácidos que compõe esta proteína (tendo sido um peptídeo contendo uma lisina não identificada), e através das massas totais encontradas por MALDI-TOF infere-se que houve também uma acetilação nesta lisina. Estes resultados são complementares e comprovam que a acetilação ocorreu somente nas lisinas, não provocando assim nenhuma

outra alteração na estrutura de outros aminoácidos da cadeia polipeptídica da PLA2 Bbil-TX.

As atividades farmacológicas apresentadas pelas PLA2s podem ser

dependentes ou independentes da sua atividade catalítica.Quando dependente da atividade enzimática, a hidrólise dos fosfolipídeos, produzindo a liberação de lisofosfolipídios e ácidos graxos é responsável pelos efeitos farmacológicos (Kini e Evans, 1989). Tal fenômeno pode romper ou mudar a fluidez da membrana e do envoltório fosfolipídico tornando-a permeável à íons. Lisofosfolipídios e ácidos graxos também são precursores de mediadores derivados de lipídeos com uma alta faixa de atuação biológica (Gelb et al, 1995, 1999; Dennis,2000).

Estudos para correlação entre estrutura e função das PLA2 são de suma

importância para se entender o mecanismo e as formas de interação na produção dos efeitos farmacológicos. Para a melhor compreensão tem se utilizado de modificações químicas de regiões específicas destas PLA2s que

induzem a perda da atividade catalítica e a modificação de regiões já estabelecidas e essenciais para determinadas atividades biológicas (Soaresetal,2003).

As modificações químicas usualmente mais estudadas nas PLA2s D49 é

a inibição da atividade enzimática utilizando o reagente p-BPB e a acetilação das aminas primárias (lisinas) por anidro acético (Huncaiure-Vega et al, 2013; Zhao et al, 1997), isolando assim regiões farmacológicas específicas e correlacionando a presença dos aminoácidos presentes ao mecanismo de ação da enzima.

A toxina Bbil-TX descrita por Carregariet al(2013) foi submetida a modificação por p-BPB e anidro acético, sendo avaliado o efeito destas modificações na atividade miotóxica desta enzima. O efeito miotóxico foi observado pela liberação de CK plasmático 2 horas após a injeção intramuscular da PLA2 D49 Bbil-TX, sendo que a atividade miotóxica não

sofreu alteraçãosignificativa em nenhuma das doses aplicadas 0,1μg, 1μg e 5μg(395,1259±15,5336CK(U/l); 461,2801±82,9984 CK(U/l) e 880,4662±15,2187 CK(U/l, respectivamente)quando comparadas a Bbil-TX nativa com a modificada por p-BPB.

A manutenção da atividade farmacológica pode ser explicada pelo fato do sítio catalítico das PLA2s embora promova a hidrólise total dos fosfolipídios

de membrana, não são de fato os únicos responsáveis pelo efeito miotóxico destas toxinas.A região C-terminal das PLA2s com seus resíduos hidrofóbicos

estão diretamente relacionadas à atividade miotóxica. A hidrólise completa dos fosfolipídios, realizada pela atividade catalítica, esta associada à atividade inflamatória(Teixeiraet al, 2009; Doleyet al, 2010). A Bbil-TX apresenta uma região composta por aminoácidos hidrofóbicos e catiônicos formando uma possível região miotóxica que, independente da atividade catalítica desta enzima, promove a penetração na membrana celular causando um rompimento desta membrana ou desregulação de íons do ambiente celular, levando a lise destas células.

Peptídeos sintéticos representando a região C-terminal de determinadas PLA2sD49 apresentaram atividade citolítica e danos musculares similares ao

das proteínas utilizadas como moldes para a síntese dos peptídeos, porém com uma menor potência do efeito (Lomonte et al, 2003; Costaet al, 2008). A perda da atividade miotóxica após a incubação com heparina demonstrou a importância da região C-terminal neste efeito farmacológico da PLA2PhTX-I

(Huncaiure-Veja et al, 2011).

A acetilação das 10 lisinas presentes na Bbil-TX causou uma diminuição da liberação de CK plasmático, ou seja, do efeito miotóxico produzido pela toxina nas doses de 1μg e 5μg (359,9577±14,1192 CK(U/l) e 616,9289±71,8741 CK(U/l)). O bloqueio desta atividade miotóxica ocorre devido à modificação dos resíduos de lisina presentes na Bbil-TX, mudando a carga destas lisinas de positivas para negativas ou neutras, o que fez com que a interação destes resíduos com a membrana plasmática fosse reduzido, confirmando assim a importância das lisinas presentes na estrutura com o efeito miotóxico produzido.

As análises histológicas com a Bbil-TX nativa mostram em todas as doses analisadas (0,1μg, 1μg e 5μg) edema tecidual, presença de algumas células edemaciadas e infiltrado inflamatório, mas não foi possível identificar a presença de hipercontração. Os estudos morfológicos feitos com a Bbil-TX modificada quimicamente por p-BPB e anidro acético em todas as doses aplicadas (0,1μg, 1μg e 5μg), apresentaram somente edema tecidual, não

sendo possível a identificação da presença de danos celulares severos. O fato de não serem encontrados danos nas fibras musculares nas análises histológicas não condizem com os danos constatados pela liberação de CK plasmático, podendo o tempo utilizado para dissecção dos músculos inoculados com o veneno não ter sido o suficiente para que a ação da PLA2

provocasse a ruptura completa da membrana celular, precisando de mais tempo para que o aumento da permeabilidade da membrana causasse a lise total destas células musculares.

Os lisofosolipídeos podem ser metabolizados por ativadores de agregação plaquetária, os quais são potentes mediadores inflamatórios (Kume e Shimizu, 1997; Jackson et al, 1998). Os ácidos graxos, particularmente o ácido araquidônico, atua como precursor e na síntese de mensageiros secundários da cascata inflamatória, tais como prostaglandinas e tromboxanos (Dennis, 2000). A ausência dos infiltrados inflamatórios em ambas as Bbil-TX modificadas pode estar diretamente relacionadas à perda da atividade catalítica causadas por ambas as modificações, diminuindo assim a hidrólise direta da membrana e impedindo uma maior liberação de ácidos graxos e lisofosfolipídios, ativadores de vias inflamatórias.