PLA 2 K49 Btt-TX do veneno de Bothriopsis taeniata

Em estudos anteriores realizados em nosso laboratório mostraram que o veneno total da serpente Bothriopsis taeniata apresentava uma alta atividade miotóxica e uma baixa atividade PLA2, indicando que este efeito poderia estar

sendo produzido por uma PLA2 K49. Para obter uma nova PLA2 a partir do

veneno da serpente Bothriopsis taeniata, seguimos a metodologia de Lomonte e colaboradores (1990), que usa dois passos cromatográficos para isolar e purificar PLA2s. No primeiro passo, o veneno total foi aplicado em uma coluna

de exclusão molecular (Sephadex G75), separando os grupos de proteínas pela diferença de peso e tamanho entre elas. O perfil cromatográfico apresentou 4 picos, os quais foram analisadas em relação as atividades fosfolipásicas e miotóxica. A atividade miotóxica é também medida devido a presença de ambas as PLA2s nos venenos de serpentes, com e sem atividade

PLA2 K49, que não apresenta atividade catalítica (Lomonte et al, 1989;

Gutierrez e Lomonte, 1995).

Apenas o pico Bt-III apresentou atividade PLA2 e miotóxica, sendo então

selecionado e submetido à uma nova etapa cromatográfica. De acordo com o processo de otimização da purificação feito por Clement e colaboradres (2012), a fração selecionada foi submetida à uma coluna de troca iônia acoplada à um sistema de HPLC. Nesta etapa da purificação constatou-se a presença de 9 picos, que foram coletados e analisados por MALDI-TOF e após digestão tríptica por LC-MS/MS (Dados não mostrados), após a busca em banco de dados foi determinado que o pico 6 era a proteína alvo, uma PLA2 K49, pois

apresentou alta similaridade com outras PLA2 K49.

O pico 6 foi então submetido à um ultimo passo cromatográfico, uma coluna de fase reversa C-18 acoplada à um sistema de HPLC, obtendo uma maior eficiência na purificação e uma dessalinização da amostra que devido ao passo cromatográfico anterior estava com uma grande concentração de sal. O perfil apresentou 6 picos, sendo o pico 3 a nossa proteína alvo, então denominada Btt-TX. A massa intacta da Btt-TX foi analisada por espectrometria de massas com um equipamento de alta resolução e possui uma massa de 11923,55Da.

A identificação de proteínas em proteômica é baseada na informação da sequencia de proteínas já estudas, descritas e depositadas em bancos de dados. Para o sequenciamento de proteínas de organismos não descritos e sem sequenciamento do genoma ou identificação de modificações pós traducionais, deve ser realizado o sequenciamento “de novo”, sendo o método mais comum à digestão destas proteínas e os peptídeos resultantes analisados em MALDI-MS/MS e o sequenciamento “de novo” feito manualmente através da interpretação dos espectros (Roepstorff, 2012). Porém o êxito desta técnica depende da pureza em que se encontra a proteína em questão, diminuindo significantemente a confiabilidade da cobertura alcançada quando existe a presença de isoformas.

A Btt-TX foi reduzida, alquilada e digerida pela tripsina, os peptídeos trípticos foram aplicados a um sistema LC-MS/MS e fragmentação por CID. O arquivo Raw gerado foi utilizado em uma busca no banco de dados e também utilizado para o sequenciamento “de novo” automático realizado pelo

softwarePeaks Studio (Versão 6). Em ambos os casos a Btt-TX apresentou alta homologia com a PLA2 K49 PLA2_BOLTC isolada do veneno de B. leucurus, e

quando analisado somente o sequênciamento “de novo” realizado pelo PEAKS, notou-se que a Btt-TX sofre apenas uma redução do N-Terminal em relação à PLA2_BOLTC (B. leucurus) tendo aparamentemente encontrado 100% de

cobertura. Porém, a massa total da sequência de aminoácido feita através do sequenciamento “de novo” automático é superior à massa total da Btt-TX observado na análise de massa intacta,inferindo que haja uma isoforma da Btt- TX, podendo produzir peptídeos de alta homologia e que são confundidos como pertencentes da mesma proteína.

Guthals e colaboradores (2013) desenvolveram uma metodologia para sequenciamento “de novo” com alta cobertura e confiabilidade para misturas proteicas contendo até 6 diferentes tipos de proteínas, utilizando a combinação de diferentes enzimas de digestão e diferentes tipos de fragmentação dos peptídeos precursores (ETD,HCD e CID) em análise por FT-MS, alcançando 99% de cobertura para proteínas com até 200 aminoácidos.

Com base nesta metodologia, a fim de sequenciar a Btt-TX separando-a da isoforma, esta proteína foi submetida a dois tipos diferentes de enzimas de clivagem, a tripsina e Lys-C esta utilizadadada a existência de grande quantidade de lisina.Os peptídeos resultantes desta digestão foram submetidos à LC-MS/MS com análise em modo FT-MS. Desta vez os 8 picos mais intensos dos peptídeos precursores foram selecionados para a fragmentação em CID, HCD e ETD, obtendo assim diferentes padrões de fragmentação do mesmo peptídeo. Como estes fragmentos são complementares e geram espectros complementares é possível, através da combinação destes fragmentos, obter uma maior cobertura e confiabilidade do sequenciamento “de novo” realizado pelo PEAKS, podendo confirmar mutações de aminoácidos da estrutura proteica.

Desta forma foi possível identificar uma descontinuidade da sequencia na região N-terminal da Btt-TX, sugerindo então que este peptídeo MILQETGKseria derivado de uma isoforma e não da proteína em questão. A acetilação da PLA2 Btt-TX, permitiu a identificaçãodo início da cadeia

polipeptídica,comprovando que o N-terminal inicia-se no peptídeo SKVSYGVYGNCGV.

A confirmação da sequencia de aminoácidos foi feitapor umasobreposição de todos os peptídeos encontrados no sequenciamento “de novo” como já utilizado por Verano-Braga e colaboradores (2013). A partir da combinação destes peptídeos foi possível cobrir 100% da sequencia de aminoácidos da PLA2 Btt-TX, sendo agora a massa total da soma da sequencia

dos aminoácidos equivalente a massa intacta encontrada.

A Btt-TX é um PLA2 K49 devido à presença da K no sítio catalítico, e de

estrutura primária formada pela sequência de aminoácidos SVKSYGVYGCNCGVGGRGKPKDATDRCCYVHKCCYKKLTGCDPKKDRYSY SWKDKTIVCGENNPCLKELCECDKAVAICLRENLGTYNKKYRYHLKPFCKKAD PC.

A miotoxicidade da Btt-TX foi avaliada por análises bioquímicas e histológicas. A liberação de CK plasmático foi medida após duas horas da injeção de diferentes concentrações da Btt-TX e da Btt-TX modificada através da acetilação das lisinas. O tempo de 2 horas foi escolhido devido à maior atividade miotóxica ocorrer neste período (Huancahuire-Vegaet al, 2013). A Btt- TX induziu um efeito miotóxico dose-dependente, provocando uma maior liberação de CK com 40μg (600.919±19.74U/CK).

Este efeito foi parcialmente reduzido quando os resíduos de lisina da Btt- TX foram quimicamente acetilados com anidro acético, mostrando que estes resíduos desempenham um importante papel na atividade miotóxica induzida pela Btt-TX. As doses de 5μg até 40 μg não foramcapazes de induzir um dano muscular de grande extensão, medido por uma maior liberação do CK no plasma, assim como produzido por outras toxinas bothropicas (Floriano et al, 2013).

A Btt-TX possui uma alta similaridade na sequência de aminoácidos com outras proteínas PLA2s K49 isoladas de venenos bothropicos, entretanto

sofreu uma importante mutação na região N-terminal, havendo uma perda desta sequência consenso, o que poderia explicar o baixo efeito miotóxico quando comparado com outras K49 PLA2’s (Higuchi et al, 2007; Carregari et al,

2013). Já é bem definido que o N-terminal das PLA2s possuem uma importante

participação no mecanismo de ancoragem e ligação com a membrana fosfolipídica, agindo como um domínio regulatório que medeia a interface de ativação destas enzimas, permitindo uma maior penetração dos aminoácidos

hidrofóbicos presentes na região C-Terminal (Kao et al, 2008; Shan Qin et al, 2005).

A região C-terminal da Btt-TX possui uma sequencia de aminoácidos conservada e similar à de outras potentes PLA2s K49. De acordo com os

estudos de Fernandes e colaboradores (2013), existe um sítio catiônico de ancoragem à membrana que está presente nas PLA2s K49, formado

principalmente pelos resíduos da região C-terminal (lisina 115 e arginina 118), mas que também é auxiliado por outros resíduos positivos expostos, tais como lisina 20, lisina 80, lisina 122 e lisina 127. A presença destes aminoácidos pode estar relacionada a uma maior interação com superfície da membrana, aproximando mais as PLA2s e permitindo uma maiorexposição dos resíduos

hidrofóbicos, aumentando a eficiência da penetração na bicamada lipídica. Após estudos de homologia sequencial da Btt-TX, a presença destes aminoácidos do este sítio de ancoragem, sugere que a liberação do CK observada após a injeção da Btt-TX ocorre devido a interação destes resíduos positivos com o grupo fosfatidil da bicamada lipídica aniônica constituinte da membrana celular, permitindo assim a penetração da região altamente hidrofóbica. Mesmo sem a presença do N-terminal conservado, a presença das lisinas fez com que a Btt-TX pudesse ancorar na membrana plasmática das células musculares, permitindo assim a penetração dos resíduos hidrofóbicos da região C-terminal.

Baseados em estudos de cristalografia de raio X com a miotoxina ACL, Ambrosio e sua equipe (2005) propuseram que resíduos hidrofóbicos específicos, (Phe 121 e Phe 124) presentes na região C-terminal desta toxina e de outras PLA2sK49 poderiam estar diretamente relacionados aos mecanismos

da atividade miotóxica. Na forma ativa destas PLA2 K49, Phe 121 e Phe 124

háanéis aromáticosexpostos comconformaçõesparalelas esalientesda superfície da toxina, formando, após a anconragem desta proteína na membrana uma espécie de “cotovelo” hidrofóbico que permite a penetração e o rompimento da membrana. Tal situação só é possível quando a lisina 122 interage com a Cys29/Gly30 e quando existe uma ligação com o canal hidrofóbico desta toxina.

O alinhamento do N-terminal da Btt-TX mostrou um alto número de resíduos hidrofóbicos nesta região, particularmente Leu, Pro e Phe nas

posições 121,124 e 125 respectivamente, assim como observado também nas miotoxinas BbTX-II, MTX-II e ACL (Fernandes et al, 2013; Ambrosio et al, 2005). No caso das PLA2 K49 bothropicas as posições 121 e 125 são

usualmente ocupadas por resíduos hidrofóbicos, onde Leu e Phe representam 98% das sequências descritas (Fernandes et al, 2013).

Estes resíduos hidrofóbicos são responsáveis pelo mecanismo de ruptura da membrana celular e a presença da Leu, Phe e Pro na região C- terminal confere um altíssimo nível de hidrofobicidade,permitindo uma alta capacidade de penetração da membrana. Considerando a alta conservação estrutural destes resíduos e estudos funcionais sobre este cacho hidrofóbico (resíduos 121 e 125) encontrado em PLA2s K49 de venenos bothropicos,

conclui-se que estes resíduos sejam os maiores responsáveis pelo rompimento da membrana após a ancoragem desta proteína com a membrana celular, recebendo assim a denominação de sítio hidrofóbico de rompimento da membrana.

As modificações causadas na membrana pela interação com a toxina podem ser o principal fator para a toxicidade, permitindo um influxo descontrolado de íons (Ca2+e Na+) o que inicia uma complexa série de efeitos degenerativos nas fibras musculares (Gutierrez et al, 2003). Osachados bioquímicos do presente trabalho e relacionados com a liberação de CK estão de acordo com a literatura (Fernández et al, 2013).

A acetilação das aminas primárias (resíduos de lisina e N-terminal) da toxina Btt-TX através da incubação com anidro acético, produz uma leve diminuição da liberação de CK, porém não inibe completamente ou induz a uma perda significante desta atividade farmacológica. Esta leve diminuição na liberação de CK, e consequentemente perda na atividade miotoxica da Btt-TX modificada, pode ser explicada pelo fato de que após a acetilação dos resíduos de lisinas,há uma diminuição da interação destas com a membrana plasmática, a ancoragem é incompleta devido à neutralização de carga da lisina 122. Esta modificação diminui a interação entre o sítio de ancoragem da toxina com a membrana, produzindo uma redução da penetração dos resíduos de alta hidrofobicidade (presentes na região C-terminal) na membrana plasmática.

Estes dados corroboram com estudos prévios nos quais a PLA2s K49

(Soares et al, 2003; Huancaiure-Vega et al,2013). As análises morfológicas com a Btt-TX modificada apresentaram apenas um edema tecidual, mas não foi possível identificar a presença do efeito de hipercontração muscular, o que poderia nos trazer maiores informações sobre o mecanismo de rompimento da membrana plasmática.