PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL FATORIAL E

Para desenvolver ou melhorar um processo, é necessário planejar um procedimento experimental para avaliar os efeitos que suas variáveis independentes ou fatores têm sobre a resposta. Parece inevitável a opção de se avaliar um fator por vez (one-at-a-time), mantendo as outras variáveis fixadas para controlar o processo, avaliando separadamente cada fator.

Os métodos clássicos, que avaliam um parâmetro ou variável por vez, mantendo os demais constantes, falham ao não considerarem as interações entre as variáveis envolvidas no processo, significando perda de tempo e dinheiro (ELIBOL & OZER, 2002; VARGAS et al., 2008). Mas nos últimos anos, tem sido cada vez maior a procura por métodos científicos que diminuam os números de ensaios e aumentem a precisão dos resultados. A resolução do problema através de um planejamento estatístico ou Planejamento Experimental Fatorial pode ser feita usando um número menor de medidas, identificando a relação entre as variáveis e a resposta, ou seja, explorando todo o espaço experimental (CONTESINI et al., 2009).

A otimização de processos de aplicação de enzimas, com aplicação de metodologia de planejamento experimental fatorial, em conjunto com análise de superfícies de resposta, têm sido realizados com maior eficiência. Essas metodologias, além de demandarem um menor número de experimentos ao avaliarem as resposta às alterações simultâneas de vários fatores, permitem que as mesmas sejam avaliadas na forma de uma superfície sobre aquele espaço experimental formado pelas variáveis estudadas. Planejamento experimental fatorial e metodologia de superfície de resposta são ferramentas importantes na determinação das condições ótimas de um processo e têm sido usados com sucesso para otimizar e avaliar os efeitos dos parâmetros na produção de enzimas e em suas aplicações (BURKET et al., 2004; VARGAS et al., 2008).

Segundo ELIBOL & OZER (2002), a metodologia de superfície resposta é uma técnica matemática e estatística usada para determinar os efeitos de diversas variáveis e que pode ser aplicada para otimizar diferentes processos biotecnológicos. Alterando tais variáveis ao mesmo tempo, a dependência entre elas pode ser mostrada graficamente num diagrama de contorno das respostas. As respostas, no caso, são representadas por linhas de contorno, e o “cume” dessas linhas representa a região desenhada pelas variáveis em estudo, na qual a resposta conseguida é máxima (COLEN, 2006). A superfície de resposta, bem como a projeção de seus cortes sobre o plano dos fatores gerando as curvas de contorno, pode simplificar a interpretação dos resultados.

A aplicação da metodologia se inicia a partir das condições experimentais que usualmente têm sido usadas, levando em consideração o nível da resposta às condições empregadas para as variáveis inferentes. Para saber se é possível melhorar o rendimento, empregando-se outros valores para as variáveis em questão, é necessário investigar a superfície de resposta (COLEN, 2006). A faixa ótima das variáveis em questão, fornecida pela superfície de resposta, é muito mais interessante do que apenas um valor pontual, pois ela fornece informações sobre a robustez do processo (RODRIGUES & IEMMA, 2005).

3.10.1 Delineamento Composto Central Rotacional

É usual que sejam feitos alguns ensaios no ponto central do espaço experimental. Ensaios no ponto central podem fornecer informações muito úteis sobre o comportamento das respostas entre os níveis inicialmente atribuídos aos fatores, além de evidenciar a qualidade da repetibilidade do processo. Já a adição de pontos axiais é uma alternativa interessante, para se ajustar às respostas experimentais um modelo de segunda ordem,

gerando um delineamento extremamente útil que é o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) (RODRIGUES & IEMMA, 2005). A partir dos resultados do DCCR, traça-se o gráfico de superfície de resposta, podendo-traça-se estabelecer a melhor combinação de fatores e as condições operacionais ótimas para o sistema estudado ou determinar a região que satisfaça as especificações operacionais (OLIVEIRA et al., 1999).

3.10.2 Melhoramento de processos envolvendo reações hidrolíticas catalisadas por lipases

Alguns trabalhos tentando desenvolver ou melhorar processos de hidrólise enzimática por lipases têm sido realizados.

OLIVEIRA et al. (1999) verificaram a ação da lipase comercial FAP de Rhizopus sp. no processo de hidrólise parcial de gordura de babaçu, empregando a metodologia da superfície de resposta. Neste trabalho, o efeito das variáveis independentes concentração enzimática (U/mL) e tempo de reação (horas) e suas interações foram estudados em relação à resposta grau de hidrólise (%). As reações de hidrólise ocorreram em recipientes contendo a gordura de babaçu, água e a solução de lipase, a 40°C, em banho de água. Após a reação, a mistura foi transferida para funil de separação para a decantação da fase gordurosa. Um Delineamento Composto Central Rotacional foi realizado havendo 12 ensaios, sendo 8 axiais e 4 centrais. O parâmetro tempo variou de 1 a 31 horas, enquanto que a concentração enzimática variou de 3 a 327U/mL, partindo de 16 horas e 165U/mL como pontos centrais. A maior porcentagem de hidrólise ocorreu nas condições de 165U/mL e 31 horas de reação. Após ajuste do modelo, ficou estabelecido que a porcentagem de hidrólise era dependente dos termos lineares “tempo de reação” e “concentração da enzima”, e do termo quadrático “concentração da enzima”. E o R² de quase 88%, demonstrou o ajustamento do modelo aos dados experimentais.

FREITAS et al. (2007) submeteram lipase pancreática suína a estudos de verificação do efeito da adição de sais sobre a atividade enzimática. A adição de diferentes sais, na mesma concentração, junto ao substrato, resultou tanto no aumento, quanto na diminuição da atividade lipásica. O cátion Na+ promoveu o maior acréscimo à atividade da enzima, por este motivo, em seguida, foi utilizado NaCl em um experimento fatorial 22, na tentativa de se compreender a influência da concentração deste sal e da concentração da lipase, e suas interações sobre a resposta (% hidrólise) do óleo de soja. O maior grau de hidrólise, 35%, foi alcançado com os maiores níveis de concentração de enzima (3%p/p) e NaCl (0,08%p/p). O

efeito da adição de NaCl foi pronunciado quando se utilizou níveis intermediários de concentração de lipase. A análise estatística demonstrou efeitos significativos de ambas as variáveis sobre a reposta grau de hidrólise. A concentração de enzima e de NaCl e suas interações foram estatisticamente significantes, enquanto que o quadrado dos efeitos, não, sendo portanto, excluídos da análise.